Name: Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprende a aislar progenitores de megacariocitos (MEP y MKp) de médula ósea de ratón mediante depleción magnética y citometría de flujo. Este protocolo optimizado incluye la cresta ilíaca para aumentar el rendimiento celular y reducir el uso de animales.

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Los autores desean agradecer a Monique Freund, Catherine Ziessel y Ketty por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), y por Grant ANR-17-CE14-0001-01 a Henri.de la. Salle.

Los protocolos con animales se realizaron de acuerdo con el Comité CREMEAS sobre la Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg. Número de permiso: E67-482-10).
1. Colección de hueso de ratón
<ol><li>Sacrificar al animal de acuerdo con los lineamientos institucionales. NOTA: Los datos presentados en este manuscrito se obtuvieron de ratones C57Bl/6 de 8 a 12 semanas de edad. El número de células obtenidas y la frecuencia de las poblaciones citadas pueden variar con la edad y la cepa del ratón.</li>
	<li>Rocíe el cuerpo con etanol al 70%.</li>
	<li>Usando tijeras, haga una incisión de 0.5-1 cm de la piel perpendicular a la columna vertebral y rasgue la piel alrededor de todo el cuerpo. Tire hacia abajo de la piel de la parte inferior del cuerpo y retire la piel.</li>
	<li>Coloque al animal en la almohadilla de disección, boca abajo. Localice los huesos pélvicos deslizando los dedos a lo largo de la columna vertebral expuesta de arriba a abajo. Para localizar la cresta ilíaca, identifique la pequeña protuberancia en la región lumbar cerca de las extremidades posteriores (la región anterosuperior del hueso pélvico). La Figura 1A,B presenta una representación esquemática de la anatomía del ratón.</li>
</ol><img alt="Radiografía y diagrama de la anatomía del hueso pélvico, el fémur y la tibia del ratón para la investigación y el análisis esquelético." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Anatomía del ratón. (A) Radiografía del ratón que muestra los huesos de las extremidades posteriores. Tenga en cuenta el espacio entre el hueso pélvico y la columna vertebral (flecha amarilla), donde se deben insertar las tijeras para separar adecuadamente las extremidades posteriores del cuerpo del ratón (línea punteada amarilla). (B) Representación esquemática de los huesos ricos en médula ósea de interés. Los huesos pélvicos se representan en rojo, los fémures en púrpura y las tibias en verde. (C) Representación esquemática del hueso pélvico del ratón. El ilion corresponde a la parte rica en médula del hueso pélvico y se resalta en rojo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="5"><li>Coloque las tijeras paralelas a la columna vertebral contra las vértebras y cerca de la protuberancia de la cresta ilíaca. Proceda a cortar los músculos a lo largo del lado de la columna vertebral por encima del hueso pélvico deslizando las tijeras a lo largo de las vértebras hasta la cola. NOTA: Esta primera sección de los músculos también se puede realizar utilizando una cuchilla de bisturí.</li>
	<li>Coloque las tijeras paralelas a la columna vertebral y proceda a cortar entre las vértebras y la cresta ilíaca, como lo indica la línea punteada amarilla en la Figura 1A. Asegúrese de permanecer lo más cerca posible de las vértebras. Corte los músculos restantes para separar la extremidad del cuerpo. NOTA: Debe haber poca o ninguna resistencia.</li>
	<li>Repita en el otro lado para separar la segunda extremidad.</li>
	<li>Transfiera las extremidades sobre una superficie limpia y deseche el resto del cuerpo de acuerdo con las pautas institucionales.</li>
	<li>Exponga los huesos pélvicos, femorales y tibiales eliminando la mayor cantidad posible de tejido circundante con las pórceps y los bisturíes.</li>
	<li>Proceda a dislocar cuidadosamente la cabeza femoral del hueso pélvico sosteniendo el extremo distal del fémur con las pórceps mientras corta suavemente los músculos alrededor de la articulación con los bisturíes. Mueva los huesos para facilitar la dislocación.</li>
	<li>Raspe el músculo restante del hueso pélvico y corte con un bisturí en el medio de la cavidad que sostuvo la cabeza del fémur. El ilion se mantiene ya que es rico en progenitores hematopoyéticos mientras que el lado triangular muy delgado del hueso se descarta, como se muestra en la Figura 1C.</li>
	<li>Retire los tejidos residuales alrededor del ilion con el bisturí y coloque el hueso limpio en PBS estéril suplementado con 2% newborn Calf Serum (PBS-2% NBCS).</li>
	<li>Usando tijeras, corte el pie de la pierna en el tobillo.</li>
	<li>Sostenga la parte inferior de la tibia con los pórceps y raspe el músculo hacia la rodilla. Deseche los peroné y corte a través de la meseta tibial con el bisturí. Coloque la tibia en PBS-2% NBCS estéril.</li>
	<li>Retire los tejidos residuales alrededor del fémur con bisturíes.</li>
	<li>Sostenga la parte superior del fémur con pórceps; coloque la hoja del bisturí en la base de la rótula. Aplicar una fuerza hacia la rótula paralela al fémur hasta el desprendimiento de la rótula. Coloque el fémur en PBS-2% NBCS estéril. La extracción de la rótula proporciona un acceso limpio para insertar la aguja para el enrojecimiento de la médula.</li>
</ol>2. Agotamiento magnético de las células positivas del linaje
<ol><li>En un gabinete de flujo laminar, transfiera los huesos en una placa de Petri estéril llena de PBS-2% NBCS estéril.</li>
	<li>Con un bisturí corta la cabeza de los fémures.</li>
	<li>Llene una jeringa de 1 ml con PBS-2% NBCS estéril y conecte una aguja de 21 G a la salida.</li>
	<li>Llene un tubo de polipropileno de 5 ml con 2 ml de PBS-2% NBCS estéril.</li>
	<li>Sostenga el fémur con los pórceps; Inserte suavemente la aguja en el surco que queda después de la extracción de la rótula. Aplique rotación a la aguja mientras inserta para evitar el taponamiento de la aguja. Asegúrese de que la aguja esté completamente insertada en el hueso hasta el bisel.</li>
	<li>Transfiera el hueso con la aguja al tubo que contiene 2 ml de PBS-2%NBCS. Dispense y aspire el PBS-2%NBCS de la jeringa hasta que el hueso esté claro.</li>
	<li>Retire la aguja del fémur e insértela en el orificio en el lado opuesto donde estaba la cabeza del fémur. Dispensar y aspirar el tampón de nuevo y desechar el hueso.</li>
	<li>Para la cresta ilíaca y la tibia, sostenga el hueso con las pórceps; Inserte suavemente la aguja en el lado abierto. Aplique rotación a la aguja mientras inserta para evitar el taponamiento de la aguja. Asegúrese de que la aguja esté completamente insertada en el hueso hasta el bisel. Transfiera el hueso con la aguja al tubo que contiene 2 ml de PBS-2%NBCS. Dispense y aspire el PBS-2%NBCS de la jeringa hasta que el hueso esté claro. Deseche los huesos. NOTA: Los huesos de hasta tres ratones se pueden enjuagar en el mismo tubo. Pool las suspensiones celulares.</li>
	<li>Pase la suspensión de células agrupadas a través de una tapa de colador de células de 40 μm colocada sobre un tubo estéril de poliestireno de 5 ml.</li>
	<li>Proceda a contar las celdas. NOTA: El recuento de células se puede realizar con cualquier hemocitómetro, utilizando Trypan Blue para la evaluación de viabilidad, o con cualquier contador celular automatizado. Un ratón normalmente produce 105 ± 7 x 106 células.</li>
	<li>Apartar 100 μL de la suspensión celular como Médula Ósea Total, añadir 500 μL de PBS-2%NBCS y guardarlo en hielo para el procedimiento de tinción.</li>
	<li>Pellet la suspensión filtrada por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. NOTA: Los glóbulos rojos se pueden lisar resuspiendo el pellet en solución de lisis recién preparada (1/10 en dH2O). Incubar durante 5 min hasta que la suspensión se vuelva clara y de color rojo brillante y añadir 10 volúmenes de PBS estéril. Proceda a lavar las células en PBS-2%NBCS por centrifugación a 400 x g durante 5 minutos a 4 °C. Tenga cuidado al retirar el sobrenadante, ya que el pellet celular está muy suelto. Realice un segundo lavado con PBS-2%NBCS por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 °C y proceda al paso 2.13.</li>
	<li>Resuspend el pellet celular en un cóctel de anticuerpos primarios recién preparado con una proporción de 100 μL por 1 x 107 células. Incubar en hielo durante 30-45 min.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Anticuerpo</td>
			<td>Dilución</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gr-1-biotina</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>B220-biotina</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mac-1-biotina</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3-biotina</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4-biotina</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD5-biotina</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8-biotina</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>TER119-biotina</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD127-biotina</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1.
<ol start="14"><li>Apartar 10 μL de la suspensión celular en un tubo estéril de poliestireno de 5 ml con la etiqueta Lin-Pos Fracción. Agregue 90 μL de PBS-2% NBCS y guárdelo en hielo para el procedimiento de tinción.</li>
	<li>Proceda a lavar las células dos veces con PBS-2% NBCS estéril por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Asegúrese de hacer el último lavado en un tubo estéril de polipropileno de 5 ml.</li>
	<li>Durante los pasos de lavado, prepare las cuentas para el agotamiento magnético.<ol>
<li>Resuspend las perlas en el vial mediante el vórtice completo durante 30 s.</li>
		<li>Transfiera un volumen de perlas correspondiente a dos perlas por celda objetivo en un tubo de polipropileno de 5 ml.</li>
		<li>Lave las perlas dos veces con PBS-2% NBCS colocando el tubo en el imán y retirando el tampón de lavado con una pipeta Pasteur de vidrio estéril.</li>
		<li>Resuspend las perlas en 500 μL de PBS-2NBCS estéril.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vuelva a colocar el pellet de células etiquetadas en 250 μL de perlas y mezcle suavemente durante 5 minutos sobre hielo. Agregue 2 ml de PBS-2% NBCS estéril y mezcle suavemente. No agite el tubo.</li>
	<li>Coloque el tubo sobre el imán durante 2 min.</li>
	<li>Proceda a recoger la fracción no magnética con una pipeta Pasteur de vidrio estéril y agréguela sobre los 250 μL restantes de perlas magnéticas. Selle el tubo con parafilm.</li>
	<li>Coloque el tubo en un rodillo de tubo durante 20 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Agregue 2 ml de PBS-2% NBCS estéril y mezcle suavemente. No agite el tubo.</li>
	<li>Coloque el tubo en el imán durante 2 min.</li>
	<li>Proceda a recoger la fracción no magnética en un tubo estéril de polipropileno de 5 ml etiquetado como Fracción Lin-Neg con una pipeta Pasteur de vidrio estéril.</li>
	<li>Peletizar las células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspend las células no magnéticas en 500 μL de PBS-2%NBCS estéril.</li>
	<li>Proceda a contar las celdas. NOTA: Un ratón normalmente produce 3,9 ± 1,1 x 106 celdas. La tinción típica del linaje antes y después del agotamiento se presenta en la Figura 2B.</li>
</ol>3. Clasificación celular de progenitores de megacariocitos por citometría de flujo
<ol><li>Tome los tubos etiquetados como Médula ósea total, fracción Lin-Pos y fracción Lin-Neg.</li>
	<li>Proceda a dividir el contenido del tubo de médula ósea total por igual en seis tubos estériles de poliestireno de 5 ml. Etiquete los tubos con los números 1-6.</li>
	<li>Proceda a etiquetar el tubo Lin-Pos Fracción con el número 7.</li>
	<li>Proceda a dividir el contenido de la fracción Lin-Neg del tubo de la siguiente manera.<ol>
<li>Transfiera 50 μL a un tubo estéril de poliestireno de 5 ml que contenga 250 μL de PBS-2%NBCS estéril. Luego, divida su contenido por igual en 3 tubos estériles de poliestireno de 5 ml. Etiquete estos tubos con los números 8-10.</li>
		<li>Los 450 μL restantes de suspensión celular de fracción Lin-Neg corresponden al tubo con el número 11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir los anticuerpos a los tubos como se describe en la Tabla 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tubo</td>
			<td>Etiqueta</td>
			<td>Cóctel de anticuerpos</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Médula ósea total</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Control no manchado</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Control de mancha única</td>
			<td>CD45-FITC (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Control de mancha única</td>
			<td>CD45-PE (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Control de mancha única</td>
			<td>TER119-APC (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Control de mancha única</td>
			<td>CD45-PECy7 (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Control de mancha única</td>
			<td>Biotina CD45-APC-Cy7 (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Fracción Lin-Pos</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Control de mancha única</td>
			<td>Control de mancha única. Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Fracción Lin-Neg</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>Control FMO FITC</td>
			<td>c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>Control FMO PE</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>Control FMO PECy7</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>Tubo positivo para clasificación</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2.
<ol start="6"><li>Incubar en hielo durante 30-45 minutos en la oscuridad.</li>
	<li>Lavar las células con PBS-2%NBCS estéril por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Resuspenda los gránulos celulares de la siguiente manera.<ol>
<li>Para los tubos 1 a 10, resusped el pellet en 300 μL de PBS-2%NBCS estéril suplementado con 7AAD (2,5 μg/mL final) (PBS-7AAD). PRECAUCIÓN: 7AAD es un intercalante de ADN y, por lo tanto, debe manipularse con los EPI (guantes) adecuados.</li>
		<li>Para el tubo 11, vuelva a colocar el pellet en PBS-7AAD estéril a una concentración máxima de 5 x 106 células por ml y un volumen mínimo de 1 ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare dos tubos de recolección de polipropileno etiquetados como MEP y MKp que contengan 2 ml de PBS-2% NBCS. NOTA: Alternativamente, las células se pueden recolectar en medio de cultivo o tampón de lisis celular dependiendo de la aplicación posterior para las células clasificadas. No se recomienda el uso de tubos de poliestireno debido a la posible interferencia con las gotas cargadas que contienen las células de interés.</li>
	<li>Mantenga todos los tubos en hielo en la oscuridad.</li>
	<li>Vaya a la configuración del clasificador de celdas.<ol>
<li>Utilice los tubos 1-7 para configurar el voltaje y la compensación, los tubos 7-10 para determinar las compuertas de clasificación para las poblaciones celulares de interés y el tubo 11 para la clasificación celular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Los primeros pasos de la estrategia de gating tienen como objetivo excluir los dobletes y las células muertas del análisis, como se describe en la Figura 3. Identifique células viables individuales y muestre el diagrama de puntos SSC-vs Lin-APC-Cy7 para confirmar la eficiencia del agotamiento del linaje. Desde las celdas Linse establece una puerta para seleccionar celdas positivas para c-kit y negativas o tenues para Sca-1 y CD16/32. Un diagrama de puntos de expresión CD9 vs CD150 para las celdas seleccionadas permite la identificación de cuatro poblaciones. NOTA: Las células MEP y MKp son positivas para CD150. Se pueden definir tres niveles de expresión para CD9 (neg, dim y high). MKp expresa un alto nivel de CD9 y MEP expresa CD9 a un nivel intermedio de intensidad de fluorescencia. La población MEP corresponde a Lin- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/dim CD150+ CD9dim y la población MKp corresponde a Lin- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/dim CD150+ CD9brillante. La discriminación entre las poblaciones CD9 alta y CD9 tenue para las células CD150 positivas se establece en función del nivel máximo de expresión de CD9 en la población CD150 negativa. Un ratón normalmente produce 5,3 ± 0,6 x 103 MKp y 27,2 ± 2,4 x 103 MEP.</li>
</ol>

<ol><li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+review%3A+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li>
<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li>
<li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li>
<li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegué, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2%2Fflt3%2B+multipotent+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li>
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<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li>
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<li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li>
<li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14(2014).</li>
<li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.

El método descrito en este documento permite la extracción y purificación de MEP y MKp de ratón. Un parámetro importante en la optimización del protocolo fue obtener un número suficiente de células que fueran compatibles con la mayoría de los ensayos moleculares y celulares. La práctica general de la recolección de hueso de ratón para la extracción de células hematopoyéticas generalmente consiste en cosechar tanto los fémures como las tibias de cada ratón. Por lo tanto, el hueso pélvico, otra fuente de material hematopoy...

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Figure 2 was updated from:
<img alt="Hematopoietic cell separation diagram with flow cytometry result, showing Lin+ and Lin- fractions." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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<img alt="Hematopoietic cell separation process diagram with antibody labeling and magnet use, flow cytometry results." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.

Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Las plaquetas sanguíneas son producidas por los megacariocitos. Estas grandes células poliploides se localizan en la médula ósea y como para todas las células sanguíneas se derivan de las Células Madre Hematopoyéticas (HSC)1. La vía clásica de producción de megacariocitos en la médula ósea se origina a partir de HSC e implica la generación de diferentes progenitores que restringen progresivamente su potencial de diferenciación2. El primer progenitor que firma el compromiso con el linaje megacariocítico es el Progenitor Megacariocito-Eritrocito (MEP), un progenitor bipotente capaz de producir tanto células eritroides como megacariocitos3,4,5. El MEP produce entonces un progenitor/precursor unipotente (MKp) que se diferenciará en un megacariocito maduro capaz de producir plaquetas. Los mecanismos implicados en la generación de estos progenitores, así como su diferenciación y maduración en megacariocitos son complejos y sólo parcialmente comprendidos. Además, la heterogeneidad de la población DE MEP en términos de potencial de diferenciación y el nivel de compromiso intrínseco de estas células aún no están claros. Para descifrar estos procesos, es esencial obtener (o tener acceso a) poblaciones purificadas de MEP y MKp para análisis moleculares finos y unicelulares.
Varios estudios han demostrado combinaciones particulares de marcadores de superficie celular para la identificación de progenitores comprometidos con el linaje megacariocítico en elratón 6,7,8. A partir de estos se ideó un método que permite la purificación de MEP y MKp de ratones. Este método fue optimizado para obtener células en número y calidad adecuados para un gran número de ensayos. Con consideraciones éticas en mente, y con el fin de minimizar el número de animales involucrados en los experimentos, obtuvimos la recolección de la médula ósea del fémur y la tibia, y también de la cresta ilíaca. Este hueso contiene una alta frecuencia y número de progenitores hematopoyéticos y la mayoría de las veces se daña durante la recolección ósea larga. Aquí se presenta un método detallado para la recolección confiable de este hueso.
El segundo criterio de optimización es producir poblaciones celulares altamente purificadas. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) es un método de elección para obtener poblaciones purificadas de células de interés. Sin embargo, los bajos rendimientos se alcanzan cuando la población celular de interés es muy rara. Por lo tanto, son necesarios procedimientos de enriquecimiento. En este protocolo, se optó por un procedimiento de selección negativa utilizando perlas magnéticas.

<table><tbody><tr><td>Agujas de calibre 21</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9400</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Gr-1-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-85</td><td>Depleción magnética</td></tr><tr><td>Anticuerpo B220-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-0452-85</td><td>Depleción magnética</td></tr><tr><td>Anticuerpo Mac-1-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-85</td><td>Magnético depleción</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD3e-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-0031-85</td><td>Depleción magnética</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD4-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-9766-82</td><td>Depleción magnética</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD5-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-85</td><td>Depleción magnética</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD8a-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-0081-85</td><td>Depleción magnética</td></tr><tr><td>Anticuerpo TER119-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-85</td><td>Depleción magnética</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD127-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-1271-85</td><td>Depleción magnética</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>Clasificación celular</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD45-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td>Clasificación celular</td></tr><tr><td>Anticuerpo TER119-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5921-83</td><td>Clasificación de celdas</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD45-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0451-82</td><td>Clasificación celular</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD45-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td>Clasificación celular</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD9-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0091-82</td><td>Clasificación celular</td></tr><tr><td>Anticuerpo&nbsp; c-kit-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>Clasificación celular</td></tr><tr><td>Anticuerpo Sca-1-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5981-83 Clasificación de</td><td>células</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD16/32-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0161-83</td><td>Clasificación de células</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD150-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-1502-82</td><td>Clasificación de células</td></tr><tr><td>Medio de cultivo StemSpan-SFEM</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>#09650</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla de disección</td><td>Fisher Scientific</td><td>10452395</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>vWR Productos químicos</td><td>83813.360</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Euronexia</td><td>P-120-AS</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de vidrio</td><td>Dutscher</td><td>42011</td><td></td></tr><tr><td>Imán :&nbsp; DynaMag-5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Perlas magnéticas: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Megacult</td><td>Tecnologías de células madre#</td><td>04970</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult SF M3436</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>#03436</td><td></td></tr><tr><td>Suero para terneros recién nacidos</td><td>Dutscher</td><td>50750-500</td><td></td></tr><tr><td>Lisis de glóbulos rojos solución</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td> Bisturíes Tijeras 12308009 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td></td><td>Euronexia</td><td>C-165-ASB</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas estériles de 1 mL</td><td>BD Bioscience</td><td></td> 303172 <td></td></tr><tr><td>Tubos estériles de 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Tubos estériles de polipropileno de 5 ml</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tubos estériles de poliestireno de 5 ml</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Tubos estériles con 70&micro; m tapón de filtro de células</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri estéril</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina-APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>554063</td><td>Clasificación de células</td></tr><tr><td>Rodillo de tubo</td><td>Benchmark Scientific</td><td>R3005</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Los megacariocitos de la médula ósea son células poliploides grandes que aseguran la producción de plaquetas sanguíneas. Surgen de las células madre hematopoyéticas a través de la megacariopoyesis. Las etapas finales de este proceso son complejas y clásicamente involucran a los progenitores bipotentes de megacariocitos-eritrocitos (MEP) y los progenitores de megacariocitos unipotentes (MKp). Estas poblaciones preceden a la formación de megacariocitos de buena fe y, como tales, su aislamiento y caracterización podrían permitir el análisis robusto e imparcial de la formación de megacariocitos. Este protocolo presenta en detalle el procedimiento para recolectar células hematopoyéticas de la médula ósea de ratón, el enriquecimiento de progenitores hematopoyéticos a través del agotamiento magnético y, finalmente, una estrategia de clasificación celular que produce poblaciones MEP y MKp altamente purificadas. Primero, las células de la médula ósea se recolectan del fémur, la tibia y también la cresta ilíaca, un hueso que contiene un alto número de progenitores hematopoyéticos. El uso de huesos de la cresta ilíaca aumenta drásticamente el número total de células obtenidas por ratón y, por lo tanto, contribuye a un uso más ético de los animales. Se optimizó un agotamiento del linaje magnético utilizando perlas magnéticas de 450 nm que permiten una clasificación celular muy eficiente por citometría de flujo. Finalmente, el protocolo presenta la estrategia de etiquetado y gating para la clasificación de las dos poblaciones progenitoras de megacariocitos altamente purificadas: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim)y MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9brillante) ). Esta técnica es fácil de implementar y proporciona suficiente material celular para realizar i) caracterización molecular para un conocimiento más profundo de su identidad y biología, ii) ensayos de diferenciación in vitro, que proporcionarán una mejor comprensión de los mecanismos de maduración de los megacariocitos, o iii) modelos in vitro de interacción con su microambiente.

El análisis fenotípico de las células identificadas como MEP y MKp se realizó mediante citometría de flujo. Las células fueron etiquetadas con anticuerpos conjugados de fluorescencia a CD41a y CD42c, marcadores clásicos de los linajes megacariocítico y plaquetario. Ambos marcadores fueron expresados por las células de la población MKp mientras que estos marcadores aún no se detectan en la superficie de las células de la población MEP (Figura 4Ai,4Aii). La poliploidía es un s...

Este método describe la purificación por citometría de flujo de MEP y MKp de fémures, tibias y huesos pélvicos de ratones.

Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

El aislamiento de poblaciones clave de progenitores de megacariocitos permite el análisis fino de la jerarquía de linaje en cultivo celular en ensayos moleculares, hasta el nivel de una sola célula. Este protocolo combina una práctica más ética al minimizar el número de animales requeridos, en un proceso eficiente para la clasificación celular de las poblaciones MEP y MKP. Para el hueso, rocíe el cuerpo de un ratón negro C57 de seis de ocho a 12 semanas de edad, con 70% de etanol.Use tijeras para hacer una incisión de cinco a un centímetro de la piel, perpendicular a la columna vertebral. Y rasgar la piel alrededor de todo el cuerpo, tirando de ella hacia abajo. Coloque el ratón boca abajo en la almohadilla de disección, luego ubique los huesos pélvicos deslizando los dedos o tijeras, a lo largo de la columna vertebral expuesta, de arriba a abajo.Para localizar la cresta ilíaca, identifique la pequeña protuberancia en la región lumbar cerca de las extremidades posteriores. Después de colocar las tijeras paralelas a la columna vertebral, contra las vértebras, y cerca de la protuberancia de la cresta ilíaca, proceda a cortar los músculos a lo largo del lado de la columna vertebral por encima del hueso pélvico, deslizando las tijeras a lo largo de las vértebras, hasta la cola. Luego corte entre las vértebras y la cresta ilíaca, permaneciendo lo más cerca posible de las vértebras.Y corte los músculos restantes para separar la extremidad del cuerpo. Transfiera las extremidades desprendidas a una superficie limpia. Después de desechar el resto del cuerpo de acuerdo con las pautas institucionales, use pórceps y bisturíes para exponer los huesos pélvicos, femorales y tibiales, mediante la eliminación del tejido circundante.Use forrceps para sostener el extremo distal del fémur y disloque cuidadosamente la cabeza femoral del hueso pélvico, cortando suavemente los músculos alrededor de la articulación con un bisturí. Raspe el músculo restante del hueso pélvico y corte en el medio de la cavidad que sostenía la cabeza femoral. Mantenga el ilion y deseche el lado delgado triangular del hueso.Usando un bisturí, retire los tejidos residuales alrededor del ilion y coloque el hueso limpio en PBS estéril suplementado con 2% Newborn Calf Serum. Luego use tijeras para cortar el pie de la pierna en el tobillo. Sosteniendo la parte inferior de la tibia con las pórceps, raspe el músculo hacia la rodilla.Deseche el peroné. Luego haga un corte a través de la meseta tibial con el bisturí y coloque la tibia en PBS estéril 2% NBCS. Después de extraer los tejidos residuales alrededor del fémur, sostenga la parte superior del fémur con bórceps y coloque la hoja del bisturí en la base de la rótula.Aplique una fuerza hacia la rótula, paralela al fémur para separar la rótula. Luego coloque el fémur, en PBS estéril 2% NBCS. En un gabinete de flujo laminar, transfiera los huesos a una placa de Petri estéril llena de PBS estéril 2% NBCS.Use un bisturí para cortar la cabeza de los fémures. Llene una jeringa de un mililitro con PBS estéril 2% NBCS y conecte una aguja de calibre 21 a la salida. Luego llene un tubo de polipropileno de cinco mililitros con dos mililitros de PBS estéril 2% NBCS.Sosteniendo el fémur con fórceps, inserte la aguja en el surco izquierdo, después de la extracción de la rótula aplicando rotación, asegurándose de que la aguja se inserte completamente en el hueso, hasta el bisel. Después de la inserción de la aguja, transfiera el hueso con la aguja al tubo que contiene dos mililitros de PBS 2%NBCS. Luego dispense y aspire el PBS 2% NBCS, desde la jeringa hasta que el hueso esté claro.Retire la aguja del fémur e insértela en el orificio del lado opuesto, donde estaba la cabeza del fémur. Después de dispensar y aspirar el tampón, deseche el hueso. Para la cresta ilíaca y la tibia, use forrceps para sostener el hueso e inserte suavemente la aguja en el lado abierto, aplicando rotación.Asegurarse de que la aguja esté completamente insertada en el hueso, hasta el bisel. Luego transfiera el hueso con la aguja al tubo que contiene dos mililitros de PBS 2% NBCS. Dispense y aspire el PBS 2%NBCS de la jeringa hasta que el hueso esté claro.Pase toda la suspensión celular a través de una tapa de colador de células de 40 micras, colocada en un tubo estéril de poliestireno de cinco mililitros, y agregue 500 microlitros de PBS 2% NBCS. Reservar 100 microlitros de la suspensión celular como médula ósea total. Luego guárdelo en hielo para el procedimiento de tinción.Pellet la suspensión filtrada por centrifugación. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a colocar el pellet en un cóctel de anticuerpos primarios recién preparado, con la incubación en hielo, durante 30 a 45 minutos. Apartar 10 microlitros de la suspensión celular en un tubo estéril de poliestireno de cinco mililitros, etiquetado como Lin Pores Fraction, y añadir 90 microlitros de PBS 2%NBCS.Mientras tanto, prepare una cuenta para el agotamiento magnético, resuspendiéndolas en el vial, con un vórtice completo durante 30 segundos. Transfiera un volumen de perlas correspondiente a dos perlas por celda objetivo, en un tubo de polipropileno de cinco mililitros, y lave las perlas dos veces, con PBS 2% NBCS, colocando el tubo en el imán. Después de retirar el tampón de lavado con una pipeta pasteur de vidrio estéril, vuelva a colocar las perlas en 500 microlitros de PBS estéril 2% NBCS.Para el primer paso del agotamiento magnético, agregue 250 microlitros de perlas sobre el pellet de células lavadas e incube con una mezcla suave durante cinco minutos en hielo. Luego agregue dos mililitros de PBS estéril 2% NBCS, con una mezcla suave, y coloque el tubo en el imán durante dos minutos. Proceda a recoger la fracción no magnética con una pipeta pasteur de vidrio estéril.Y para el segundo paso del agotamiento magnético, agréguelo a los 250 microlitros restantes de cuentas magnéticas. Coloque el tubo sellado con parafina en un rodillo de tubo, durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Luego agregue dos mililitros de PBS estéril 2% NBCS con una mezcla suave.Y coloque el tubo con el imán durante dos minutos. Recoja la fracción no magnética en un tubo estéril de polipropileno de cinco mililitros, etiquetado, fracción Lin Neg no magnética, con una pipeta pastreur de vidrio estéril, y proceda con la clasificación celular de los progenitores de megacariocitos, como se describe en el manuscrito de texto. Para la estrategia de gating para la clasificación celular, en la población de Lin Neg, se seleccionan las células que expresan C-kit y una expresión baja o nula del antígeno Sca-1 o CD16/32.En esta población, los MEP se identifican como células CD150 positivas y CD9 dim. El MKP como CD150 positivo, y las células brillantes CD9. En el Análisis de Citometría de Flujo representativo, las células identificadas como MEP y Mkp, fueron etiquetadas con anticuerpos conjugados de fluorescencia para cd41a, y marcadores clásicos CD42c, de los linajes megacariocítico y plaquetario.Ambos marcadores fueron expresados por las células de la población MKp, y no fueron detectados en la superficie de las células de la población MEP. El contenido de ADN de los megacariocitos clasificados, demostró que las células son en su mayoría 2n para la población MEP. Y una pequeña porción de las células MKp son extrañas.Las células de ploidy más altas no se detectaron significativamente en estas poblaciones. En ensayos clonogénicos semisólidos, se detectó UFC-MK en poblaciones de MEP y MKp. BFU-E no se detectó en la población MKp, pero se detectó en MEP y, la población de células progenitoras CD9 negativas CD150.La observación microscópica en el tercer día de diferenciación, muestra que MEP y MKp produjeron principalmente megacariocitos, identificados como células grandes. Los megacariocitos obtenidos después de tres días de cultivo, se identificaron utilizando la expresión de CD41 y CD42c, y representan el 54, y el 82% de las células producidas a partir de poblaciones de células MEP y MKp, respectivamente. La ploidía de los megacariocitos producidos, fue mayor a partir del megacariocito derivado de la población MKp, en comparación con la población MEP.Solo las células derivadas de la población MKp, fueron capaces de emisión de proplatelet, lo que sugiere una etapa de maduración más avanzada para la población MKp. El uso del hueso pélvico, aumenta drásticamente al número de células, mientras que el agotamiento magnético de dos pasos mejora la eficacia del agotamiento del linaje. Este protocolo permite el posterior cultivo de la población MEP y MKp de células individuales, que, junto con el análisis transcriptómico y proteómico, sin duda tendrá que descifrar los mecanismos implicados, implementados en la biogénesis.

isolation-of-mouse-megakaryocyte-progenitors

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Método para la disociación enzimática, el etiquetado de superficie y la purificación por citometría de flujo de fibro / adipogénico y progenitores miogénica del músculo esquelético murino.

Purificación de los progenitores del músculo esquelético

Un método para analizar la distribución de progenitores hematopoyéticos de médula ósea en citometría de flujo, así como para aislar eficazmente altamente purificadas células madre hematopoyéticas (HSC) se describe. El procedimiento de aislamiento se basa esencialmente en el enriquecimiento magnética de c-kit + células y células de clasificación para purificar las CMH para los estudios celulares y moleculares.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

Aquí presentamos un protocolo que genera grandes cantidades de monocitos murinos a partir de médula ósea heterogénea para aplicaciones traslacionales. En comparación con otros, este nuevo método ayuda a reducir el número de animales sacrificados y reduce los costos al evitar métodos costosos como la separación de células magnéticas (MACS) de alto gradiente.

Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) se derivan de las células endoteliales especializadas (hemogenic) durante el desarrollo, sin embargo, se sabe poco sobre el proceso por el cual algunas células endoteliales especifican a convertirse en la formación de la sangre. Demostramos un método basado en citometría de flujo permite el aislamiento simultáneo de las células endoteliales y hemogenic HSPC de tejidos embrionarios murinos.

Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

Aquí describimos un protocolo optimizado y altamente reproducible para aislar células progenitoras mesodérmicas (MPCs) de médula ósea humana (hBM). Las MPC se caracterizaron por citometría de flujo y expresión de nestina. Demostraron la capacidad de dar lugar a cultivos celulares similares a MSC en crecimiento exponencial mientras conservan su potencial angiogénico.

Células Progenitoras de aislamiento Mesangiogenic (PSM) de Humana de Médula Ósea

Describimos el aislamiento Inmunomagnética de los oligodendrocitos primario de ratón, que permite el aislamiento rápido y específico de las células para el cultivo en vitro .

Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón

Demostramos cómo identificar y aislar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de médula murine usando una combinación de magnético y fluorescencia clasificación (MACS y FACS). Este protocolo puede ser utilizado para RNA/proteína análisis, experimentos de transferencia adoptiva en vivo y en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido).

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Aquí, detallamos el método de explante de médula ósea, desde la preparación de muestras hasta el análisis microscópico de diapositivas, para evaluar la capacidad de los megacariocitos que se han diferenciado en su entorno fisiológico para formar proplatlets.

Dinámica de formación de proplatlets de explantes de médula ósea fresca de ratón

Ahora se reconoce que el entorno tridimensional de las células puede desempeñar un papel importante en su comportamiento, maduración y/o diferenciación. Este protocolo describe un modelo de cultivo celular tridimensional diseñado para estudiar el impacto de la contención física y las restricciones mecánicas en los megacariocitos.

Cultivo de megacariocitos en hidrogel 3D a base de metilcelulosa para mejorar la maduración celular y estudiar el impacto de la rigidez y el confinamiento

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y purificar la microglía primaria en modelos animales de enfermedades desmielinizantes, utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente columnares.

Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización

Este estudio ha establecido un método estable y eficiente para el aislamiento, cultivo y determinación funcional de células madre CD34+ residentes en la pared vascular (CD34+ VW-SCs). Este método de aislamiento fácil de seguir y eficaz en el tiempo puede ser utilizado por otros investigadores para estudiar los posibles mecanismos implicados en las enfermedades cardiovasculares.

Aislamiento inmunomagnético de células madre CD34+ residentes en la pared vascular de ratones

Aprende a aislar progenitores de megacariocitos (MEP y MKp) de médula ósea de ratón mediante depleción magnética y citometría de flujo. Este protocolo optimizado incluye la cresta ilíaca para aumentar el rendimiento celular y reducir el uso de animales.

Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón

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