Name: Los filtros de leucodepleción derivan de células CD34+ como fuente celular para estudiar la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprende a aislar células CD34+ de filtros de leucodepleción para estudiar la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas in vitro. Este método eficiente permite investigar la megacariopoiesis humana.

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Este trabajo ha sido apoyado por la ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1.

Se obtuvieron muestras humanas de control de donantes de sangre voluntarios que dieron su consentimiento informado por escrito reclutados por el centro de transfusión de sangre donde se realizó la investigación (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Todos los procedimientos fueron registrados y aprobados por el Ministerio de Educación Superior e Investigación de Francia y registrados con el número AC_2015_2371.Los donantes dieron su aprobación en el formulario de consentimiento CODHECO número AC- 2008 - 562, para que las muestras se utilicen con fines de investigación. Los estudios en humanos se realizaron de acuerdo con la declaración de Helsinki.
1. Extracción y selección de células CD34+ (HP) de LRF
<ol><li>
Preparación del reactivo (para un LRF)<ol>
<li>Preparar 25 mL de tampón de elución filtrada: 21,25 mL de Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS), 2,5 mL de Ácido-Citrato-Dextrosa (ACD) y 1,25 mL de Suero Fetal Bovino (FBS) descomplementado. Filtrar sobre 0,22 μm y colocar a 37 °C.</li>
		<li>Preparar 500 mL de PBS con 2 mM de ácido etilendiaminatetraacético (EDTA).</li>
		<li>Disponer 25 mL de medio gradiente de densidad (DGM) (1.077 g/mL) en dos tubos de 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Modalidades de retro-lavado LRF (Figura 1) NOTA: Este paso requiere una máquina de soldadura de tubos estériles, lo que permite la conexión estéril de tubos termoplásticos.<ol>
<li>Primero, conecte el LRF a una bolsa de transferencia vacía de 600 ml y el LRF a un conjunto de tubos(Figura 1A). Debajo del gabinete de bioseguridad, inyecte el volumen total de tampón de elución filtrado y preparado correspondiente al número de LRF manipulados (xLRF x 25 mL) en la bolsa vacía. Luego, usando una jeringa de 30 ml para aspirar suavemente todo el contenido de la bolsa a través del LRF, retroflush y transfiera las células a un nuevo tubo de 50 ml(Figura 1B).</li>
		<li>A la sedimentación de los glóbulos rojos, diluya la suspensión celular a la mitad con Dextran 2% y mezcle bien para agregar glóbulos rojos. Espere 30 minutos a temperatura ambiente (RT).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62499/62499fig01.jpg"> Figura 1: Modalidades de lavado posterior del LRF. (A) Esquema representativo de (i) la conexión estéril de la bolsa de transferencia al LRF y (ii) el conjunto de tubos al LRF. (B) Esquema representativo de la conexión de las jeringas para la recolección de células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62499/62499fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="3"><li>
Colección PBMC
	<ol>
<li>Después de la sedimentación de los glóbulos rojos, retire y transfiera el sobrenadante a un tubo de 50 ml y llénelo con PBS-EDTA 2 mM. Superponga suavemente el sobrenadante sobre el DGM preparado anteriormente. Deje que el sobrenadante fluya suavemente sin romper el plano superficial del gradiente de densidad. Centrifugar a 400 x g en RT durante 30 min en modo de apagado de freno.</li>
		<li>Recoja la capa de PBMC con una pipeta de transferencia desechable. Transfiera las células de cada tubo DGM a un nuevo tubo estéril de 50 ml. Llene cada tubo con PBS-EDTA 2 mM y lave dos veces en 50 mL de PBS-EDTA 2 mM a 200 x g durante 10 min en RT en modo de freno encendido.</li>
		<li>Pipetee y acumule el pellet celular con 50 mL PBS-EDTA 2 mM. NOTA: Existe la posibilidad de detener el procedimiento manteniendo las células recolectadas bajo agitación a 4 ° C durante la noche. Luego, filtre la suspensión con un colador de células de 40 μm para eliminar los agregados formados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selección de células CD34+
	<ol>
<li>Determine el número de celda y la centrífuga a 400 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos con la rotura encendida.</li>
		<li>Aspirar el sobrenadante completamente y resuspend en el volumen apropiado de PBS-EDTA 2 mM detallado por el fabricante del kit de selección CD34 (300 μL de PBS-EDTA para 108 celdas). Añadir el reactivo bloqueador FcR y las microperlas CD34 en la concentración adecuada (50 μL para 108 células).</li>
		<li>Después de 30 min a 4 °C, lavar la suspensión celular y volver a suscripción en el volumen apropiado de PBS-EDTA 2 mM detallado por el fabricante del kit de selección CD34 (500 μL por 108 celdas). NOTA: La selección se realiza en la ordenación de columnas para el paso de un máximo de 2 x 109 celdas por columna.</li>
		<li>Pase la muestra sobre la columna húmeda del imán. Lavar dos veces con 3 mL de PBS-EDTA 2 mM y eluar las células con 5 mL de PBS-EDTA 2 mM. Es necesaria una segunda ejecución en una nueva columna siguiendo el mismo procedimiento para mejorar la pureza de la muestra. NOTA: Un número esperado de 6.1 x 105 celdas/LRF (Figura 2A). Para números LRF más altos, amplíe los reactivos y métodos en consecuencia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Evaluación de la pureza de las células CD34+
	<ol>
<li>Añadir a una alícuota de 100 μL de suspensión obtenida tras la seleccióncd34+, 2 μL de anticuerpo CD34-PE humano o 2 μL de IgG-PE (control). Mezclar bien e incubar durante 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Lavar las células añadiendo 2 mL de PBS y centrifugar a 400 x g durante 5 min. Aspirar sobrenadante completamente y resuspend en 200 μL de PBS.</li>
		<li>Analizar la pureza por citometría de flujo como se muestra en la Figura 2A y en la Discusión. NOTA: Se espera una pureza de células CD34+ superior al 90%(Figura 2Bii).</li>
		<li>Use las células CD34+ directamente o congele para su uso posterior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Congelación de células CD34+ NOTA: La congelación de células CD34+ se realiza a una densidad de 106 células por ml.<ol>
<li>Después de la determinación del número de células CD34+, prepare los siguientes medios de criopreservación: (1) 60% Stemspan + 40% FBS, (2) 40% Stemspan + 40% FBS + 20% Dimetilsulfóxido (DMSO) y permita el enfriamiento a 4 °C.</li>
		<li>Centrifugar las células CD34+ a 400 x g a temperatura ambiente durante 5 min y volver a suspender el pellet en solución fría 1 y luego añadir inmediatamente a la solución fría 2 (v/v).</li>
		<li>Coloque los criotubos inmediatamente en un congelador de -80 °C durante 24 horas y luego transfiera los criotubos al tanque de nitrógeno líquido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultivo y diferenciación de células CD34+ para producir megacariocitos maduros portadores de proplatlet
NOTA: El protocolo de cultivo celular (Figura 3A), esquema representativo del procedimiento de cultivo celular se detallan en esta sección.
<ol><li>
Descongelación de células CD34+ (si es necesario)
	<ol>
<li>Preparar la solución de descongelación: 13 mL de PBS-20% FBS y colocar a 37 °C durante 15 min. Transfiera rápidamente los criotubos a un baño de agua de 37 ° C hasta que solo un pequeño cristal de hielo. Debajo del gabinete de cultivo biológico, pipetee todo el contenido y transfiera lentamente en 13 ml de solución de descongelación precalentada.</li>
		<li>Determine el número de celda y la viabilidad de la celda.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocolo de cultivo, paso 1: del día 0 al día 7 NOTA: Generalmente los cultivos se realizan en placas de 24 pozos con 1 mL de medio por pozo a una densidad de 40.000 células viables/ml, lo que corresponde a 20.000 células viables/cm2. Es crucial respetar esta densidad si se planea alguna ampliación.<ol>
<li>Preparación del medio de crecimiento: En medios de expansión de células hematopoyéticas libres de suero (previamente calentados a 37 °C) agregue Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (PSG) 1x, Lipoproteína de Baja Densidad Humana (hLDL) a 20 μg/mL, cóctel de citoquinas de expansión de megacariocitos 1x y Stemregenina 1 (SR1) a 1 μM.</li>
		<li>Siembra celular: Centrifugar las células CD34+ descongeladas a 400 x g a temperatura ambiente durante 5 min. Retire completamente el sobrenadante y resuspante el pellet celular en 1 ml de medio de cultivo y realice una numeración celular y viabilidad para determinar el volumen apropiado para sembrar las células.</li>
		<li>Centrifugar las células 400 x g a temperatura ambiente durante 5 min y volver a colocar el pellet en el volumen apropiado del medio de crecimiento caliente. Incubar las células a 37 °C con 5% de CO2 durante 7 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocolo de cultivo, paso 2: del día 7 al día 13(Figura 3B,imágenes representativas en el día 13) NOTA: Generalmente los cultivos se realizan en placas de 24 pozos con 1 mL de medio por pozo a una densidad de 50.000 células viables/ml, lo que corresponde a 25.000 células viables/cm². Es crucial respetar esta densidad si se planea alguna ampliación.<ol>
<li>Preparación del medio de maduración: En medios de expansión de células hematopoyéticas libres de suero (previamente calentados a 37 °C), agregue PSG 1x, hLDL a 20 μg/mL, TPO a 50 ng/mL y SR1 a 1 μM.</li>
		<li>Examine las células bajo el microscopio. En el día 7, las células muestran un aspecto redondo y homogéneo al llenar los pozos o los matraces sin ser demasiado confluentes.</li>
		<li>Debajo de un gabinete de bioseguridad, transfiera suavemente las células en un tubo de 15 ml. Lavar los pozos con PBS. Luego, determine el número de células y su viabilidad para calcular el volumen apropiado para sembrar las células.</li>
		<li>Centrifugar las células a 400 x g a temperatura ambiente durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a colocar las celdas en el volumen apropiado de medios calientes calculado en el paso anterior. Incubar las células a 37 °C, 5% CO2 durante 6 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Liberación de plaquetas cultivadas en el día 13
	<ol>
<li>Añadir 0,5 μM de prostaglandina I2 (IGP2) y 0,02 U/ml de apirasa al cultivo y realizar pipeteos sucesivos cinco veces con una pipeta de 1 ml. NOTA: Las plaquetas ahora se liberan en el medio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análisis de citometría de flujo (fenotipado MK y recuento de plaquetas cultivadas)
NOTA: Este protocolo se puede aplicar al fenotipado de las células en los días de cultivo seleccionados. También permite determinar el número de liberación plaquetaria cultivada(Figura 4A,B).
<ol><li>
Preparación para el análisis MK
	<ol>
<li>Etiquete cuatro juegos de tubos de microcentrífuga de la siguiente manera: Células sin etiquetar como control, células + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Células + 5 μL CD34 - PECy7, Células + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 μL CD34 - PECy7. Use un mínimo de 1.105 celdas por tubo, no exceda de 1.106 celdas por tubo. Añadir a 100 μL de suspensión celular por tubo de citometría y los diferentes anticuerpos. Incubar en la oscuridad durante 30 min a 4 °C.</li>
		<li>Luego, agregue 2 ml de PBS-EDTA 2 mM por tubo y centrífuga a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Durante la centrifugación, prepare una solución de PBS-EDTA 2 mM + 7-Aminoactinomycin-D (7AAD) (1/100), permita una solución de 300 μL por tubo.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y tome el pellet en 300 μL de PBS-EDTA 2 mM con 7AAD. Pase las muestras a través del citómetro de flujo dentro de los 30 minutos. NOTA: La estrategia de análisis para la citometría de flujo se muestra en la Figura 3C y en la Discusión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de tubos para análisis de plaquetas cultivadas
	<ol>
<li>Etiquete cuatro juegos de tubos de microcentrífuga de la siguiente manera: Células sin etiquetar como control, Células + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Células + 20 μL CD42a - PE, Células + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 μL CD42a - PE. Después de cinco pipeteos sucesivos en el pozo de cultivo, transfiera 300 μL de la suspensión en el tubo para citometría que contiene un número calibrado de perlas fluorescentes.</li>
		<li>Agregue anticuerpos e incube en la oscuridad a RT durante 30 min.</li>
		<li>Pase las muestras a través del citómetro de flujo dentro de los 30 minutos y configure la adquisición para el paso de 5,000 cuentas. NOTA: La estrategia de análisis para la citometría de flujo se muestra en la Figura 4B y en la Discusión.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Deutsch, V. R., Tomer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocyte+development+and+platelet+production%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Megakaryocyte development and platelet production.</a> British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).</li>
<li>Lefrancais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lung+is+a+site+of+platelet+biogenesis+and+a+reservoir+for+haematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors.</a> Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).</li>
<li>de Sauvage, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+megakaryocytopoiesis+and+thrombopoiesis+by+the+c-Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand.</a> Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).</li>
<li>Almomani, M. H., Mangla, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlmomani%2C+MH+%22StatPearls%22">StatPearls</a>. , (2020).</li>
<li>Strassel, C., Hechler, B., Bull, A., Gachet, C., Lanza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+mice+lacking+the+GPIb-V-IX+complex+question+the+role+of+this+receptor+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Studies of mice lacking the GPIb-V-IX complex question the role of this receptor in atherosclerosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (11), 1935-1938 (2009).</li>
<li>Delalat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+ex+vivo+expansion+of+human+umbilical+cord+blood-derived+CD34%2B+stem+cells+and+their+cotransplantation+with+or+without+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%22%5BJournal%5D)">Isolation and ex vivo expansion of human umbilical cord blood-derived CD34+ stem cells and their cotransplantation with or without mesenchymal stem cells.</a> Hematology. 14 (3), 125-132 (2009).</li>
<li>Yin, T., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+niches+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The stem cell niches in bone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1195-1201 (2006).</li>
<li>Salunkhe, V., Papadopoulos, P., Gutiérrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+megakaryocytes+from+human+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Culture of megakaryocytes from human peripheral blood mononuclear cells.</a> Bio-protocol. 5 (21), 1639(2015).</li>
<li>Peytour, Y., Villacreces, A., Chevaleyre, J., Ivanovic, Z., Praloran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discarded+leukoreduction+filters%3A+a+new+source+of+stem+cells+for+research%2C+cell+engineering+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Discarded leukoreduction filters: a new source of stem cells for research, cell engineering and therapy.</a> Stem Cell Research. 11 (2), 736-742 (2013).</li>
<li>Lapostolle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulating+hematopoietic+stem+cells+from+steady-state+blood+before+and+after+ex+vivo+culture+are+enriched+in+the+CD34%28%2B%29CD133%28%2B%29CXCR4%28low%29+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Repopulating hematopoietic stem cells from steady-state blood before and after ex vivo culture are enriched in the CD34(+)CD133(+)CXCR4(low) fraction.</a> Haematologica. 103 (10), 1604-1615 (2018).</li>
<li>Ivanovic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-blood+leuko-depletion+filters+as+a+source+of+CD+34%2B+progenitors+potentially+usable+in+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Whole-blood leuko-depletion filters as a source of CD 34+ progenitors potentially usable in cell therapy.</a> Transfusion. 46 (1), 118-125 (2006).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor-dependent+enrichment+of+a+megakaryocytic+precursor+with+a+high+potential+to+produce+proplatelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets.</a> Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).</li>
<li>Do Sacramento, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+platelets+derived+in+vitro+from+CD34%28%2B%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human platelets derived in vitro from CD34(+) cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 914(2020).</li>
<li>Blin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+model+of+the+platelet-generating+organ%3A+beyond+bone+marrow+biomimetics%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microfluidic model of the platelet-generating organ: beyond bone marrow biomimetics.</a> Scientific Reports. 6, 21700(2016).</li>
<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbulence+activates+platelet+biogenesis+to+enable+clinical+scale+ex+vivo+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production.</a> Cell. 174 (3), 636-648 (2018).</li>
<li>Pallotta, I., Lovett, M., Kaplan, D. L., Balduini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+system+for+the+in+vitro+study+of+megakaryocytes+and+functional+platelet+production+using+silk-based+vascular+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un método para producir MK capaz de emitir proplatelets a partir de HP derivados de la sangre y liberar plaquetas del medio de cultivo. Los HP se obtienen de LRF, un subproducto de los bancos de sangre, utilizado para eliminar los leucocitos contaminantes de los productos sanguíneos celulares y evitar reacciones adversas. Aunque este método es relativamente simple, algunos puntos merecen una atención especial.
La deposición de la suspensión celular en el medio de gradie...

Las plaquetas sanguíneas provienen de células poliploides grandes especializadas, los megacariocitos (MK), que se originan en un proceso de producción constante y ajustado conocido como megacaropoyesis (MKP). En el ápice de este proceso se encuentran las células madre hematopoyéticas que, en contacto con el entorno de la médula ósea (citoquinas, factores de transcripción, nicho hematopoyético), serán capaces de proliferar y diferenciarse en progenitores hematopoyéticos (HP) capaces de comprometerse hacia la vía megacariocítica, dando lugar a MKs inmaduros1. Bajo la influencia de varias citoquinas, y en particular la trombopoyetina (TPO), que es la citoquina principal de MKP; el MK se someterá entonces a dos etapas principales de maduración: endomitosis y el desarrollo de membranas de demarcación (DMS). Esta MK completamente madura aparece entonces cerca de un vaso sinusoide en el que puede emitir extensiones citoplasmáticas, los proplatlets, que se liberarán bajo el flujo sanguíneo y posteriormente se remodelarán en plaquetas funcionales2. La clonación de TPO en 19943 proporcionó un impulso en el estudio de MKP al acelerar el desarrollo de técnicas de cultivo in vitro que permiten la diferenciación de HP y la maduración de MK.
Existen muchas patologías que afectan a las plaquetas sanguíneas, tanto en cuanto al número de plaquetas (aumento o disminución) como a la función4,5. Ser capaz de recapitular MKP in vitro a partir de HP humano podría mejorar la comprensión de los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a este proceso y, en última instancia, el manejo terapéutico de los pacientes.
Varias fuentes de HP humano son adecuadas: sangre del cordón umbilical, médula ósea y sangre periférica6,7,8. La recolección de HP de la sangre periférica plantea menos problemas logísticos y éticos que su recuperación de la sangre del cordón umbilical o la médula ósea. HP se puede recuperar de la leucoféresis o el pelaje buffy, pero estas fuentes son caras y no siempre están disponibles en los centros sanguíneos. Otros protocolos, menos costosos y más fáciles de realizar, permiten la recuperación directa de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) sin necesidad de aislamiento previo impulsado por CD344,8. Sin embargo, la pureza de los megacariocitos no es satisfactoria con este método y se recomienda una selección de células CD34 + de PBMC para una diferenciación óptima en MK. Esto nos llevó a implementar una purificación HP a partir de filtros de leucorreducción (LRF), utilizados rutinariamente en los bancos de sangre para eliminar los glóbulos blancos y así evitar reacciones inmunológicas adversas9. De hecho, desde 1998, los concentrados de plaquetas se han agotado automáticamente en Francia. Al final de este proceso, se descartan los LRF y se destruyen todas las células retenidas en el LRF. Las células en los LRF están, por lo tanto, fácilmente disponibles sin costo adicional. Los LRF tienen un contenido celular cercano al obtenido por leucoféresis o en pelajes buffy, notablemente en su composición de CD34+ HP convirtiéndolos en una fuente notablemente atractiva10. LRF como fuente humana de HP ya se ha demostrado que proporciona a las células capacidades funcionales intactas11. Esta fuente tiene la ventaja de ser abundante y asequible para la investigación de laboratorio. En este contexto, este artículo describe sucesivamente: i) la extracción y selección de CD34+ HP a partir de LRFs; ii) un cultivo optimizado de dos fases, que recapitula el compromiso de HP en la vía megacariocítica y la maduración de MK capaz de emitir proplatelets; iii) un método para liberar eficientemente las plaquetas de estas MK; y iv) un procedimiento para fenotipar MK y plaquetas cultivadas.

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>Biolegend</td><td>558819</td><td></td></tr><tr><td>ACD</td><td>EFS-Alsacia</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34-PE&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-081-002</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD41-Alexa Fluor 488</td><td>Biolegend</td><td>303724</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD42a-PE</td><td>BD Bioscience</td><td>559919</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>EFS-Alsace</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>BD Trucount Tubos</td><td>BD Bioscience</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit UltraPure, humano&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-100-453</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 1.OR</td><td>O material equivalente</td></tr><tr><td>Compteur ADAM&nbsp;</td><td>DiagitalBio</td><td>NA</td><td>O material equivalente</td></tr><tr><td>Criotubos</td><td>Dutscher</td><td>55002</td><td>O material equivalente</td></tr><tr><td>Dextrano de leuconostoc spp&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>31392-50g</td><td>O material equivalente</td></tr><tr><td>DMSO Hybri-max&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15575-039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 mL&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>616201</td><td>o material equivalente</td></tr><tr><td>Unidad de filtración Steriflip PVDF</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD Bioscience</td><td>Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologías de células madre</td> <td>LDL humanas</td><td>#02698</td><td></td></tr><tr><td>ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL</td><td>Insertos de MA038EX</td><td></td><td></td>Bayer</tr><tr><td>Fenwal</td><td>R4R1401</td><td></td><td>O material equivalente</td></tr><tr><td>Campana de flujo laminar&nbsp;</td><td>Holten</td><td>NA</td><td>Producto archivado</td></tr><tr><td>LS Columms&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell</td><td>7861</td><td></td></tr><tr><td>Pluma Estreptococo Glutamina (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&nbsp;</td><td>O material equivalente</td></tr><tr><td>PGi2</td><td>Sigma</td><td>P6188</td><td></td></tr><tr><td>Poches de transferts 600ml&nbsp;</td>Filtros de preseparación <td>VSE4001XA</td><td></td> <td>Macopharma</td></tr><tr><td>(30&micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>StemRegenin 1 (SR1)</td><td>Tecnologías de células madre#</td><td>72344</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de expansión de StemSpan (100x)</td><td>Tecnologías de células madre#</td><td>02696</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan-SFEM&nbsp;</td><td>Tecnologías de células madre#</td><td>09650</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Durapore 0,22&micro; m PVDF</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>SVF Hyclone&nbsp;</td><td>Termo científico</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>jeringues 30 mL&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>SS*30ESE1</td><td>O material equivalente</td></tr><tr><td>Filtros de jeringa Millex 0,22&micro; M PVDF</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>#02822</td><td></td></tr><tr><td>Tubos 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.548.004 PP</td><td>O material equivalente</td></tr><tr><td>Tubos 15 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.001 PP</td><td>O material equivalente</td></tr><tr><td>Tubulures</td><td>B Braun</td><td>4055137</td><td>O material equivalente</td></tr></tbody></table>

los filtros de leucodepleción derivan de células cd34+ como fuente celular para estudiar la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas

Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation

La expansión y diferenciación in vitro de progenitores hematopoyéticos humanos en megacariocitos capaces de alargar proplatelets y liberar plaquetas permite un estudio en profundidad de los mecanismos subyacentes a la biogénesis plaquetaria. Los protocolos de cultivo disponibles se basan principalmente en progenitores hematopoyéticos derivados de la médula ósea o la sangre del cordón umbilical que plantean una serie de preocupaciones éticas, técnicas y económicas. Si ya existen protocolos disponibles para obtener células CD34 de sangre periférica, este manuscrito propone un protocolo sencillo y optimizado para obtener células CD34+ a partir de filtros de leucodepleción fácilmente disponibles en los centros sanguíneos. Estas células se aíslan de los filtros de leucodepleción utilizados en la preparación de productos de transfusión de sangre, correspondientes a ocho donaciones de sangre. Estos filtros están destinados a ser descartados. Se describe un procedimiento detallado para recolectar progenitores hematopoyéticos identificados como células CD34 + de estos filtros. También se detalla el método para obtener megacariocitos maduros que extienden los proplatlets mientras se discute su evolución fenotípica. Finalmente, el protocolo presenta un método de pipeteo calibrado, para liberar eficientemente plaquetas que son morfológica y funcionalmente similares a las nativas. Este protocolo puede servir como base para evaluar compuestos farmacológicos que actúan en varios pasos del proceso para diseccionar los mecanismos subyacentes y abordar los rendimientos plaquetarios in vivo.

Extracción y selección de células CD34+ de LRFs Aquí, el método, derivado de Peytour et al.9,describe la extracción y selección de células CD34+ de LRF descartados disponibles en bancos de sangre después de la eliminación de leucocitos. Después del procedimiento de retrolavado, generalmente se recuperan 1,03 x10 9 ± 2,45 x10 8 células/LRF (Media±EM; n = 155) con una viabilidad de 94,88 ± 0,10% (Figura 2A i</...

Este protocolo describe en detalle todos los pasos implicados en la obtención de progenitores hematopoyéticos CD34+ derivados de leucofiltros y su diferenciación y maduración in vitro en megacariocitos portadores de proplatlet que son capaces de liberar plaquetas en el medio de cultivo. Este procedimiento es útil para el análisis en profundidad de los mecanismos celulares y moleculares que controlan la megacaripoyesis.

Los filtros de leucodepleción derivan de células CD34+ como fuente celular para estudiar la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas

The in vitro expansion and differentiation of human hematopoietic progenitors into megakaryocytes capable of elongating proplatelets and releasing ...

Este protocolo propone un método sencillo para la obtención de progenitores hematopoyéticos humanos, y para inducir su diferenciación en megacariocitos. Puede servir como base para una mejor comprensión de la megacaropoyesis Esta técnica utiliza una fuente, pero ofrece la ventaja de ser asequible y abundante para la investigación de laboratorio en hematopoyesis. Este método se utiliza para comprender mejor la megacaropoyesis para que la célula se utilice en la terapia, deberá prepararse en las condiciones GMP, lo que actualmente no es el caso.Comprender los pasos, incluida la colección PBMC, solo puede completarse completamente con una demostración visual. Antes de comenzar un experimento, conecte un filtro de leucorreducción a una bolsa de transferencia vacía de 600 mililitros y a un juego de tubos. En un gabinete de bioseguridad, inyecte 25 mililitros de tampón de elución filtrado por filtro de leucorreducción en la bolsa vacía y use una jeringa de 30 mililitros para aspirar suavemente el contenido de la bolsa a través del filtro.Transfiera los glóbulos rojos recolectados a un nuevo tubo de 50 mililitros y diluya la suspensión celular a la mitad con 2% de dextrano. Mezcle bien para agregar las células sanguíneas y permita que las células se sedimenten durante 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando los glóbulos rojos se hayan asentado, transfiera el sobrenadante a un tubo de 50 mililitros y llene el tubo con dos solución milimolar de PBS EDTA.Superponga suavemente la mitad del sobrenadante sobre 25 mililitros de medio de gradiente de densidad en cada uno de los dos tubos de 50 mililitros sin perturbar la superficie del gradiente y separe las celdas mediante centrifugación por gradiente de densidad. Utilice una pipeta desechable para transferir las células de cada interfaz a un nuevo tubo de 50 mililitros. Lave las células dos veces en 50 mililitros de PBS EDTA milimolar por lavado.Después del segundo lavado, vuelva a gastar los gránulos en un solo volumen de 50 mililitros de PBS EDTA fresco para contar. Aquí es posible detener el procedimiento manteniendo las células recolectadas bajo agitación a cuatro grados centígrados durante la noche. Para la selección de células CD34+, determine el número de células y recoja las células por centrifugación y resuspiva el pellet celular en 300 microlitros de dos milimolares PBS EDTA por 10 a la octava célula.Agregue el volumen apropiado de reactivo bloqueador del receptor FC y 50 microlitros de microperlas CD34 por 10 a las octavas células. Después de 30 minutos a cuatro grados centígrados, lave las células con dos PBS EDTA milimolares y vuelva a gastar el pellet en 500 microlitros de PBS EDTA fresco de dos milimolares, por 10 a las ocho células. Humidifique y dimensione adecuadamente la columna magnética con PBS EDTA y, a continuación, agregue la muestra a la columna.Lave la columna dos veces con tres mililitros de pbS EDTA milimolar por lavado. Antes de eludir las células CD34+, con dos volúmenes de cinco mililitros de dos milimolares PBS EDTA por elución. Para evaluar la pureza de las células seleccionadas de perlas magnéticas, agregue dos microlitros de un anticuerpo humano anti CD34 apropiado a una alícuota de 100 microlitros de las células aisladas y mezcle bien antes de incubar durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.Después de la incubación, lave las células en PBS y resuspenda el pellet en 200 microlitros de PBS para el análisis de la pureza de la muestra celular por citometría de flujo. Después de contar, recoja las células CD34 + por centrifugación e inmediatamente vuelva a suspender el pellet en solución fría uno a una densidad de 10 a las seis celdas por mililitro antes de agregar rápidamente la suspensión celular a la solución fría dos. Luego, coloque inmediatamente el tubo criogénico en un congelador de menos 80 grados Celsius durante 24 horas antes de transferir el tubo criogénico al almacenamiento de nitrógeno líquido.En este estudio representativo, las células fueron recuperadas por filtración de leucorreducción como se demostró con una viabilidad aproximada del 95%. Después de la selección de perlas magnéticas, se obtuvo una población de células CD34+ puras superior al 90%. La proliferación celular generalmente disminuye después de una semana de cultivo, pero sin cambios significativos en la viabilidad celular.Para el séptimo día, las células CD34+ deben comenzar a expresar CD41, un marcador específico y temprano o para el desarrollo de megacariocitos y plaquetas. Para el día 10, la mayoría de las células en el cultivo generalmente se convierten en megacariocitos cd41 maduros que expresan. Para el día 13, la extensión plaquetaria pro megacariocito y la liberación de plaquetas se pueden observar mediante microscopía de luz.El número total de CD41, CD42, 8 plaquetas positivas liberadas en el cultivo se puede cuantificar utilizando un número calibrado de perlas fluorescentes. Este método allana el camino para mejorar los mecanismos subyacentes de la megacaripoyoyesis y para aumentar los rendimientos de plaquetas en visual. Incluso si este método parece tedioso, es muy simple, solo necesita ser paciente y preparar todas las regiones con anticipación.Aunque nuestra megacaropoyesis de preocupaciones críticas, obtenemos células CD42 que se pueden usar en vías hematopoyéticas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

A continuación se describe el aislamiento de CD133 que expresan las células madre del hígado y las células madre del cáncer de hígado en su totalidad murino, un proceso que requiere de digestión de los tejidos, el enriquecimiento celular y citometría de flujo aislamiento. Se incluyen métodos para el aislamiento avanzado de células individuales y la expansión clonal.

El aislamiento de células madre CD133 + hígado para la expansión clonal

Este video muestra una técnica para la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas. Las células progenitoras madre hematopoyéticas, aisladas de la sangre del cordón umbilical humano, se diferencian en megacariocitos maduros en presencia de trombopoyetina. Los megacariocitos maduros producen extensiones citoplasmáticas denominadas proplaquetas, que dan lugar a plaquetas individuales.

Un método in vitro para la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas

Aquí, demostramos cómo se aíslan los monocitos mediante la separación magnética de perlas de las células mononucleares de sangre periférica después de la centrifugación en gradiente de densidad de la sangre humana anticoagulada. Después de la incubación durante 5 días, los monocitos humanos se diferencian en células dendríticas inmaduras y están listos para procedimientos experimentales en un entorno no clínico.

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Aquí, presentamos pluripotentes humanas protocolos de cultura de la célula de vástago (hPSC), solía diferenciarse hPSCs a CD34+ de progenitores hematopoyéticos. Este método utiliza la manipulación de la fase específica de canónica WNT de señalización especificar las células exclusivamente ya sea definitivo o primitiva hematopoyética programa.

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

Una población altamente pura de megacariocitos puede obtenerse de cable derivadas de sangre CD34+ las células. Un método para CD34+ aislamiento y del megakaryocyte diferenciación se describe aquí.

Diferenciación de megacariocitos y plaquetas formación de humanos CD34 derivadas de sangre de la cuerda+ de las células

Demostramos cómo identificar y aislar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de médula murine usando una combinación de magnético y fluorescencia clasificación (MACS y FACS). Este protocolo puede ser utilizado para RNA/proteína análisis, experimentos de transferencia adoptiva en vivo y en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido).

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Aquí, presentamos un protocolo para la caracterización inmunophenotípica y la diferenciación inducida por citoquinas de la sangre de cordón umbilical derivada CD34+ células madre hematopoyéticas y células progenitoras a los cuatro linajes mieloides. Las aplicaciones de este protocolo incluyen investigaciones sobre el efecto de mutaciones de la enfermedad mieloide o moléculas pequeñas en la diferenciación mieloide de las células CD34+.

Diferenciación panmieloide de la sangre de cordón humano derivada CD34+ Células hematopoyéticas del tallo y progenitor

Este método describe la purificación por citometría de flujo de MEP y MKp de fémures, tibias y huesos pélvicos de ratones.

Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón

Aquí, presentamos una estrategia de inmunofenotipificación para la caracterización de la diferenciación de megacariocitos, y mostrar cómo esa estrategia permite la clasificación de megacariocitos en diferentes etapas con un clasificador de células activado por fluorescencia. La metodología se puede aplicar a tejidos primarios humanos, pero también a megacariocitos generados en cultivo in vitro.

Inmunofenotipado Y Clasificación Celular De MKs Humanos De Fuentes Primarias Humanas O Diferenciados In Vitro De Progenitores Hematopoyéticos

Se presenta un protocolo único y completo para generar células dendríticas derivadas de monocitos humanos desialiladas (mo-DC) a partir de células mononucleares aisladas de sangre periférica (PBMC) utilizando un tratamiento con siaridasa. Además, se describen métodos para evaluar la caracterización fenotípica y funcional de las mo-DC y evaluar cómo el tratamiento con sialidasa mejora el nivel de maduración de las mo-DC.

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos con diferentes fenotipos sialilados

Aprende a aislar células CD34+ de filtros de leucodepleción para estudiar la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas in vitro. Este método eficiente permite investigar la megacariopoiesis humana.

Los filtros de leucodepleción derivan de células CD34+ como fuente celular para estudiar la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas (Video) | JoVE Journal

Los filtros de leucodepleción derivan de células CD34+ como fuente celular para estudiar la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas

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