Name: Dinámica de formación de proplatlets de explantes de médula ósea fresca de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprende a visualizar la formación de proplatletos en megacariocitos de médula ósea de ratón en tiempo real. Este método explante simple y reproducible permite analizar la morfología celular y evaluar tratamientos farmacológicos o mutaciones genéticas.

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Los autores desean agradecer a Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert por su asistencia técnica. Este trabajo ha sido apoyado por ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 y ANR-18-CE14-0037.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas europeas 2010/63/EU y el Comité CREMEAS sobre la Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).
1. Preparación de reactivos
<ol><li>Preparar reactivos como se describe en la Tabla 1.<ol>
<li>Para el Stock I, disuelva cada polvo por separado. Asegúrese de que la osmolaridad de la preparación sea superior a 295 mOsm/L. Esta solución se puede almacenar a 4 °C durante un año.</li>
		<li>Para la preparación del tampón de Tyrode, haga la solución como se describe en la Tabla 1,ajuste el volumen a 100 ml con agua destilada y agregue 0,1 g de sacarosa D (+) anhidra. Ajuste a pH 7.3 usando 1 N HCl según sea necesario y la osmolaridad a 295 mOsm/L. Para prevenir el crecimiento bacteriano, agregue penicilina G a 10 U/ml de concentración final y sulfato de estreptomicina a 0,29 mg/ml de concentración final. Filtrar la solución final a través de poros de 0,22 μm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación de la configuración experimental
<ol><li>El día del experimento, caliente el tampón del Tyrode a 37 ° C y encienda la cámara de calentamiento del microscopio para llevar la temperatura a 37 ° C.</li>
	<li>Prepare todas las herramientas necesarias, como un temporizador, cámaras de incubación, jeringas de 5 ml, 21 G, fórceps, cuchilla de afeitar, pipetas Pasteur, portaobjetos de vidrio y tubo centrífugo de 15 ml(Figura 1A).</li>
</ol>3. Aislamiento de la médula ósea del ratón
<ol><li>Eutanasiar ratones C57BL/6 de 8 a 12 semanas de edad por asfixia por CO2 y luxación cervical. Esto debe ser hecho rápidamente por una persona competente y calificada.</li>
	<li>Para evitar la contaminación microbiana, remoje el cuerpo del ratón en etanol al 70% (v / v) antes de eliminar los fémures. Utilizar instrumentos desinfectados en etanol al 70% para la disección. Recoge los dos fémures y límpialos eliminando cualquier tejido adherente. Después de una rápida inmersión en etanol, colóquelos en un tubo centrífugo de 15 ml que contenga 2 ml de tampón de Tyrode.</li>
	<li>Corte las epífisis con una cuchilla de afeitar afilada y enjuague la médula ósea con una jeringa de 5 ml llena de tampón de Tyrdode de 2 ml. Para lograr esto, introduzca una aguja de 21 G en la abertura del fémur (en el lado de la rodilla) y presione lentamente el émbolo para recuperar un cilindro de médula intacto(Figura 1B,C). Mantenga la sesión de recolección de médula lo más breve posible (menos de 10 min).</li>
</ol>4. Seccionamiento de la médula ósea y colocación en la cámara de incubación
<ol><li>Use una pipeta de plástico de 3 ml para transferir cuidadosa y suavemente la médula ósea intacta a un portaobjetos de vidrio. Es importante que las muestras estén cubiertas con tampón para evitar que se sequen (Figura 1D). NOTA: Evite el flujo-reflujo para minimizar las cizallas que podrían disociar el tejido.</li>
	<li>Debajo de un estereomitroscopio (10x), corte los extremos de la médula que pueden haber sido comprimidos en el momento del lavado. Luego corte las secciones transversales con una cuchilla de afeitar afilada. Las secciones deben ser lo suficientemente delgadas como para permitir una observación detallada, pero asegúrese de que los megacariocitos no se dañen por compresión (generalmente con un grosor de alrededor de 0,5 mm)(Figura 1E,F). NOTA: Las secciones están hechas con una cuchilla de afeitar afilada y debajo de una lupa para ajustar su grosor a aproximadamente 0,5 mm. Solo se seleccionan las secciones de espesor uniforme. Este procedimiento no es complicado pero su estandarización requiere cierta experiencia.</li>
	<li>Usando una pipeta de plástico, recolecte 10 secciones en un tubo de 1 ml que contenga el tampón de Tyrode(Figura 1G).</li>
	<li>Transfiera cuidadosamente las secciones a una cámara de incubación con un diámetro de 13 mm (Figura 1H).</li>
	<li>Aspire el tampón y ajuste el volumen a 30 μL del tampón de Tyrode complementado con suero de ratón al 5 %. NOTA: Es en esta etapa que se pueden agregar agentes farmacológicos para evaluar su impacto en la formación de proplatlet.</li>
	<li>Coloque las secciones a distancia. Selle la cámara autoadhesiva con una cubierta de la dimensión 22 x 55 mm. Incline el la cubierta mientras se pega para evitar la formación de burbujas de aire(Figura 1I).</li>
	<li>Coloque la cámara en la cámara de calentamiento a 37 °C. A partir de este momento, se inicia el cronómetro (T= 0 h). El experimento dura 6 h a 37 °C (T = 6 h).</li>
</ol>5. Observación en tiempo real de explantes de médula ósea
<ol><li>Use un microscopio de contraste de fase invertida (lente 40x para aumento) acoplado a una cámara de video para observar los explantes de médula ósea. Deje que las células se incuben durante 30 minutos antes de comenzar la observación. Mientras se observa, es necesario ajustar el enfoque porque los megacariocitos se están moviendo. NOTA: Otros modos de observación son posibles (por ejemplo, DIC, fluorescencia utilizando ratones cuyos megacariocitos expresan un marcador fluorescente endógeno), pero la microscopía de contraste de fase es óptima para visualizar claramente las extensiones de megacariocitos largas y delgadas, lo que permite una cuantificación precisa. Después de 30 min, las células de la médula migran gradualmente a la periferia del explante, formando una monocapa. Después de 1 h de incubación, los megacariocitos pueden ser identificados por su gran tamaño y núcleos polilobulados (Figura 1J,K). Después de 3 h de incubación, el número de megacariocitos aumenta y algunos tienen largas extensiones.</li>
	<li>Realiza vídeos para grabar la transformación de los megacariocitos.</li>
</ol>6. Cuantificación de los megacariocitos extensibles de proplatelet
<ol><li>Dibuje un mapa para localizar cada sección en la cámara de incubación (Figura 1K).</li>
	<li>Después de 1 h, identifique los megacariocitos visibles (es decir, células polilobuladas gigantes) en la periferia de cada sección y trace sus posiciones en el dibujo. Repita este procedimiento después de 3 y 6 h. NOTA: Sobre la base del dibujo, cada megacariocitos puede ser fácilmente localizado a lo largo del tiempo y la evolución de su morfología analizada (por ejemplo, tamaño, deformación, extensión proplatelet, etc.). Otra posibilidad es el uso de un software de navegación específico.</li>
</ol>

<ol><li>Thiery, J. P., Bessis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+platelet+genesis%3B+in+vitro+study+by+cinemicrophotography%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography.</a> Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).</li>
<li>Becker, R. P., De Bruyn, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transmural+passage+of+blood+cells+into+myeloid+sinusoids+and+the+entry+of+platelets+into+the+sinusoidal+circulation%3A+A+scanning+electron+microscopic+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation.</a> American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).</li>
<li>Muto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scanning+and+transmission+electron+microscopic+study+on+rat+bone+marrow+sinuses+and+transmural+migration+of+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archivum+Histologicum+Japonicum%22%5BJournal%5D)">A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells.</a> Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).</li>
<li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Kaushansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+megakaryocyte+progenitor+expansion+and+differentiation+by+the+c-Mpl+ligand+thrombopoietin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin.</a> Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li>
<li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).</li>
<li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li>
<li>Ortiz-Rivero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C3G%2C+through+its+GEF+activity%2C+induces+megakaryocytic+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101(2018).</li>
<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease%3A+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238-250 (2012).</li>
<li>Malara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+structure+and+nano-mechanics+determine+megakaryocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function.</a> Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).</li>
<li>Balduini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+receptors%2C+extracellular+proteins+and+myosin+IIA+orchestrate+proplatelet+formation+by+human+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Aquí describimos un método in vitro simple y de bajo costo para evaluar la eficiencia de los megacariocitos para extender los proplatlets que han crecido en la médula ósea. El modelo de explante de médula ósea para ratón tiene cuatro ventajas principales. En primer lugar, no se requieren habilidades técnicas avanzadas. En segundo lugar, el tiempo necesario para obtener proplatlets extensibles de megacariocitos es bastante corto, solo 6 horas para el método de explante, en comparación con un mínimo de 4 días para...

La técnica de explante de médula ósea fue desarrollada por primera vez por Thiéry y Bessis en 1956 para describir la formación de extensiones citoplasmáticas de megacariocitos de rata como un evento inicial en la formación de plaquetas1. Utilizando contraste de fase y técnicas cinematográficas, estos autores caracterizaron la transformación de megacariocitos redondos maduros en células trombocitogénicas "parecidas a calamares" con extensiones citoplasmáticas que muestran movimientos dinámicos de elongación y contracción. Estos brazos se vuelven progresivamente más delgados hasta que se vuelven filiformes con pequeñas hinchazones a lo largo de los brazos y en las puntas. Estas elongaciones típicas de megacariocitos, obtenidas in vitro y en medios líquidos, tienen ciertas similitudes con las plaquetas observadas en la médula ósea fija, donde los megacariocitos sobresalen largas extensiones a través de las paredes sinusoides en la circulación sanguínea2,3. El descubrimiento y clonación de TPO en 1994, permitió diferenciar megacariocitos en cultivo capaces de formar extensiones proplatletas similares a las descritas en los explantes de médula ósea4,5,6. Sin embargo, la maduración de los megacariocitos es mucho menos eficiente en condiciones de cultivo, en particular la extensa red de membrana interna de los megacariocitos maduros de la médula ósea está subdesarrollada en los megacariocitos cultivados, lo que dificulta los estudios sobre los mecanismos de la biogénesis plaquetaria7,8.
Detallamos aquí el modelo de explante de médula ósea, basado en Thiéry y Bessis, para seguir en tiempo real la formación de proplatlet de megacariocitos de ratón, que han madurado completamente en su entorno nativo, eludiendo así posibles artefactos in vitro y malas interpretaciones. Los resultados obtenidos en ratones adultos de tipo salvaje se presentan para ilustrar la capacidad de los megacariocitos para extender los proplatlets, su morfología y la complejidad de los proplatlets. También introducimos una estrategia de cuantificación rápida para la validación de la calidad para garantizar la precisión y robustez de los datos durante el proceso de registro de megacariocitos. El protocolo aquí presentado es la versión más reciente del método publicado como libro capítulo anteriormente9.

<table><tbody><tr><td>Jeringas de 5 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+05S1</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de calibre 21</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>Cámaras de incubación Coverwall</td><td>Microscopy Sciences</td><td>70324-02</td><td>Profundidad : 0,2 mm</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-3375</td><td>pH ajustado hasta 7.5</td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana</td><td>Medicamento autorizado VIALEBEX</td><td>: n&deg; 3400956446995</td><td>20% (200mg/mL -100mL)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>BVBW8448</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glass</td><td>Microscopía de Microscopía Ciencias</td><td>72200-40 Microscopio</td> de 22 <td>mm x 55 mm</td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems SA, Westlar, Alemania</td><td>DMI8 - Cámara</td> microscópica con <td>lente de aire</td></tr><tr><td></td><td>514341 Leica Microsystems SA, Westlar, Alemania</td><td>K5 CMS GmbH -14401137</td><td>resolución de imagen : 4,2 megapíxeles</td></tr><tr><td>Suero de ratón</td><td>BioWest</td><td>S2160-010</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>PSG 100x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>1037-016</td><td>10.000 unidades/mL de penicilina, 10.000 &mu; g/mL de estreptomicina y 29,2 mg/mL de glutamina</td></tr><tr><td>Hoja de afeitar</td><td>Microscopía Electrónica Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa D (+)</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr></tbody></table>

dinámica de formación de proplatlets de explantes de médula ósea fresca de ratón

Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

La última etapa de la megacaropoyesis conduce a extensiones citoplasmáticas de megacariocitos maduros, los llamados proplatlets. Mucho se ha aprendido sobre la formación de proplatlet utilizando megacariocitosdiferenciados in vitro; sin embargo, existe una creciente evidencia de que los sistemas de cultivo convencionales no recapitulan fielmente el proceso de diferenciación/maduración que tiene lugar dentro de la médula ósea. En este manuscrito, presentamos un método de explante descrito inicialmente en 1956 por Thiéry y Bessis para visualizar megacariocitos que han madurado en su entorno nativo, evitando así posibles artefactos y malas interpretaciones. Las médulas óseas frescas se recogen enjuagando los fémures de los ratones, se cortan en secciones transversales de 0,5 mm y se colocan en una cámara de incubación a 37 ° C que contiene un tampón fisiológico. Los megacariocitos se hacen gradualmente visibles en la periferia del explante y se observan hasta 6 horas bajo un microscopio invertido acoplado a una cámara de video. Con el tiempo, los megacariocitos cambian su forma, con algunas células que tienen una forma esférica y otras que desarrollan extensiones gruesas o extienden muchos proplatelets delgados con ramificaciones extensas. Se llevan a cabo investigaciones cualitativas y cuantitativas. Este método tiene la ventaja de ser simple, reproducible y rápido, ya que numerosos megacariocitos están presentes, y clásicamente la mitad de ellos forman proplalets en 6 horas en comparación con 4 días para los megacariocitos de ratón cultivados. Además del estudio de ratones mutantes, una aplicación interesante de este método es la evaluación directa de los agentes farmacológicos en el proceso de extensión del proplatelet, sin interferir con el proceso de diferenciación que puede ocurrir en los cultivos.

Resultados cualitativos. Al comienzo del experimento, todas las células se compactan en la sección de médula ósea. Las células tardan 30 minutos en hacerse claramente visibles en la periferia de los explantes. Los megacariocitos son entonces reconocibles por su gran tamaño y su evolución puede ser estudiada a lo largo del tiempo (tamaño, forma, dinámica, extensión proplatelet y liberación plaquetaria)(Figura 2A). Los megacariocitos pequeños tienen un diámetro entre 20 y 30 μ...

Aquí, detallamos el método de explante de médula ósea, desde la preparación de muestras hasta el análisis microscópico de diapositivas, para evaluar la capacidad de los megacariocitos que se han diferenciado en su entorno fisiológico para formar proplatlets.

Dinámica de formación de proplatlets de explantes de médula ósea fresca de ratón

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the ...

El objetivo general de este procedimiento es seguir en tiempo real la formación de proplatelet a partir de megacariocitos de ratón, que maduraron en su entorno nativo. Este método tiene la ventaja de ser simple, reproducible y rápido. Se pueden analizar muchos megacariocitos y visualizar la formación de proplatlets en solo seis horas, en lugar de esperar el primer día de cultivo como para los megacariocitos de ratón in vitro.Una aplicación interesante de este método es la posibilidad de estudiar el efecto del tratamiento farmacéutico o la mutación genética, específicamente en el paso de extensión proplatelet. Aquí no hay interferencias con el proceso de diferenciación, como en el caso del cultivo in vitro. Este video ayuda a garantizar estos pasos clave para enjuagar y cortar la médula ósea.También se explica cómo clasificar la morfología y los megacariocitos, lo que es realmente útil para la caracterización de defectos en la enfermedad trombofílica. Para comenzar, caliente el amortiguador de Tyrode a 37 grados centígrados y encienda la cámara de calentamiento del microscopio para llevar la temperatura a 37 grados centígrados. Prepare todas las herramientas necesarias, como un temporizador, cámaras de incubación, jeringas calibre 21 de cinco mililitros, fórceps, una cuchilla de afeitar, pipetas Pasteur, portaobjetos de vidrio y tubo de centrífuga de 15 mililitros.Enjuague la médula ósea con dos mililitros del tampón de Tyrode introduciendo una aguja de calibre 21 en la abertura del fémur en el lado de la rodilla, y presione lentamente el émbolo para recuperar un cilindro de médula intacto. Use una pipeta de plástico de tres minutos para transferir cuidadosa y suavemente la médula ósea intacta a un portaobjetos de vidrio. Cortar los extremos de la médula que pueden haber sido comprimidos en el momento del lavado.Luego corte secciones transversales delgadas de 0,5 milímetros de espesor con una cuchilla de afeitar afilada para evitar dañar los megacariocitos. Usando una pipeta de plástico, recoja 10 secciones en un tubo de un mililitro que contenga el tampón de Tyrode. Transfiera cuidadosamente las secciones a una cámara de incubación con un diámetro de 13 milímetros.Aspire el tampón y ajuste el volumen a 30 microlitros del tampón de Tyrode complementado con suero de 5% de ratón. Coloque las secciones a distancia. Selle la cámara autoadhesiva con un deslizamiento de cubierta de 22 por 55 milímetros, inclinando el deslizamiento de la cubierta para evitar la formación de burbujas de aire.Coloque la cámara en la cámara de calentamiento a 37 grados centígrados. Inicie el cronómetro y ejecute el experimento durante seis horas a 37 grados centígrados, haga videos para grabar la transformación de los megacariocitos. Después de 30 minutos, las células de la médula migran gradualmente a la periferia del explante formando una capa mono.Después de una hora de incubación, los megacariocitos se pueden identificar por su gran tamaño y núcleos polilobulados. El número de megacariocitos aumenta después de tres horas de incubación, y algunos tienen largas extensiones. Dibuja un mapa para localizar cada sección en la cámara de incubación.Después de una hora, identifique los megacariocitos visibles, que son células polilobuladas gigantes en la periferia de cada sección, y trace sus posiciones en el dibujo. Repita este procedimiento después de tres y seis horas. Los megacariocitos se cuentan manualmente y se clasifican según su morfología a las tres y seis horas después del sellado de la cámara de incubación.Se clasifican como pequeños, grandes con intención gruesa y proplatelet que se extienden. Con la ayuda del mapeo, su evolución se puede seguir a lo largo del tiempo. Los resultados se expresan como un porcentaje de cada clase en cada momento de observación.Clásicamente, la mitad de los megacariocitos visibles en la periferia extienden los proplatlets a las seis horas para la médula ósea de ratón de tipo salvaje. El destino de los megacariocitos redondos fue seguido por la captura de imágenes secuenciales a lo largo del tiempo para obtener imágenes de cómo forman los proplatlets. Una cosa importante a recordar al intentar este procedimiento es mantener los explantes a 37 grados Centígrados durante la duración del experimento.Una temperatura diferente puede cambiar los resultados. Curiosamente, el protocolo de explante se puede utilizar después de experimentos de microscopía introvertidos. Al final, los megacariocitos en los explantes de médula ósea serán naturalmente fluorescentes, y su comportamiento se puede investigar fácilmente.Esto permite combinar diferentes tratamientos en los mismos animales y así reducir el número de ratones. En conclusión, el método de explante es rápido, simple y proporciona mucha información sobre la capacidad de los megacariocitos naturales a los proplatlets externos. El hallazgo cualitativo y cuantitativo resultante es clave para nuestra comprensión de la enfermedad trombofílica.en un contexto fisiológico o patológico.

proplatelet-formation-dynamics-of-mouse-fresh-bone-marrow-explants

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra una técnica para la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas. Las células progenitoras madre hematopoyéticas, aisladas de la sangre del cordón umbilical humano, se diferencian en megacariocitos maduros en presencia de trombopoyetina. Los megacariocitos maduros producen extensiones citoplasmáticas denominadas proplaquetas, que dan lugar a plaquetas individuales.

Un método in vitro para la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas

En este video, demostramos la activación de macrófagos derivados de la médula ósea en respuesta al lipopolisacárido bacteriano y la inmunoglobulina intravenosa.

Activación de macrófagos derivados de la médula ósea de ratón en respuesta a anticuerpos

Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Una población altamente pura de megacariocitos puede obtenerse de cable derivadas de sangre CD34+ las células. Un método para CD34+ aislamiento y del megakaryocyte diferenciación se describe aquí.

Diferenciación de megacariocitos y plaquetas formación de humanos CD34 derivadas de sangre de la cuerda+ de las células

Este manuscrito describe un protocolo para aislar y la cultura osteoclastos en vitro de médula ósea de ratón y para estudiar el papel de lo mamíferos/mecanicista Diana de la rapamicina 1 complejo en la formación de osteoclastos.

Una base de RANKL osteoclasto cultura ensayo de médula ósea de ratón para investigar el papel de mTORC1 en la formación de osteoclastos

Leucocitos con avidez interactúan con las células vasculares y las plaquetas después de lesión de pared del recipiente o durante la inflamación. Aquí, describimos un análisis sencillo basado en el flujo laminar para caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares.

Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

Este método describe la purificación por citometría de flujo de MEP y MKp de fémures, tibias y huesos pélvicos de ratones.

Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón

Describimos aquí el método para obtener imágenes de megacariocitos y proplatados en la médula del hueso del cráneo de ratones vivos utilizando microscopía de dos fotones.

In Vivo Imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón

Aquí, describimos un protocolo simple para el aislamiento y tinción de células murinas de médula ósea para fenotipo de células madre hemopoyéticas y progenitoras junto con las células madre endoteliales y mesenquimales de nicho de soporte. También se incluye un método para enriquecer las células ubicadas en las áreas endosteal y central de la médula ósea.

Análisis por citometría de flujo de células madre y progenitoras hematopoyéticas de médula ósea murina y células de nicho estromal

Aquí, describimos un sistema microfisiológico estandarizado y fácil de implementar que refleja la complejidad de la estructura in vivo de la médula ósea humana, proporcionando un modelo pertinente para estudiar finamente una amplia gama de eventos normales y patológicos.

Un modelo 3D de médula ósea humana para investigar la dinámica y las interacciones entre células residentes en contextos fisiológicos o tumorales

El presente protocolo describe un método rentable para purificar, expandir y caracterizar células madre mesenquimales de médula ósea (BMSC) altamente homogéneas de ratones. Este enfoque facilita la adquisición de grandes cantidades de BMSCs con alto potencial de proliferación y diferenciación, apoyando modelos de ratón y avanzando en la investigación preclínica.

Fenotipado basado en purificación, expansión y citometría de flujo de células madre mesenquimales de médula ósea derivadas de ratón

Aprende a visualizar la formación de proplatletos en megacariocitos de médula ósea de ratón en tiempo real. Este método explante simple y reproducible permite analizar la morfología celular y evaluar tratamientos farmacológicos o mutaciones genéticas.

Dinámica de formación de proplatlets de explantes de médula ósea fresca de ratón

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