Dinámica de formación de proplatlets de explantes de médula ósea fresca de ratón
20 de mayo de 2021
Aquí, detallamos el método de explante de médula ósea, desde la preparación de muestras hasta el análisis microscópico de diapositivas, para evaluar la capacidad de los megacariocitos que se han diferenciado en su entorno fisiológico para formar proplatlets.
El objetivo general de este procedimiento es seguir en tiempo real la formación de proplatelet a partir de megacariocitos de ratón, que maduraron en su entorno nativo. Este método tiene la ventaja de ser simple, reproducible y rápido. Se pueden analizar muchos megacariocitos y visualizar la formación de proplatlets en solo seis horas, en lugar de esperar el primer día de cultivo como para los megacariocitos de ratón in vitro.
Una aplicación interesante de este método es la posibilidad de estudiar el efecto del tratamiento farmacéutico o la mutación genética, específicamente en el paso de extensión proplatelet. Aquí no hay interferencias con el proceso de diferenciación, como en el caso del cultivo in vitro. Este video ayuda a garantizar estos pasos clave para enjuagar y cortar la médula ósea.
También se explica cómo clasificar la morfología y los megacariocitos, lo que es realmente útil para la caracterización de defectos en la enfermedad trombofílica. Para comenzar, caliente el amortiguador de Tyrode a 37 grados centígrados y encienda la cámara de calentamiento del microscopio para llevar la temperatura a 37 grados centígrados. Prepare todas las herramientas necesarias, como un temporizador, cámaras de incubación, jeringas calibre 21 de cinco mililitros, fórceps, una cuchilla de afeitar, pipetas Pasteur, portaobjetos de vidrio y tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Enjuague la médula ósea con dos mililitros del tampón de Tyrode introduciendo una aguja de calibre 21 en la abertura del fémur en el lado de la rodilla, y presione lentamente el émbolo para recuperar un cilindro de médula intacto. Use una pipeta de plástico de tres minutos para transferir cuidadosa y suavemente la médula ósea intacta a un portaobjetos de vidrio. Cortar los extremos de la médula que pueden haber sido comprimidos en el momento del lavado.
Luego corte secciones transversales delgadas de 0,5 milímetros de espesor con una cuchilla de afeitar afilada para evitar dañar los megacariocitos. Usando una pipeta de plástico, recoja 10 secciones en un tubo de un mililitro que contenga el tampón de Tyrode. Transfiera cuidadosamente las secciones a una cámara de incubación con un diámetro de 13 milímetros.
Aspire el tampón y ajuste el volumen a 30 microlitros del tampón de Tyrode complementado con suero de 5% de ratón. Coloque las secciones a distancia. Selle la cámara autoadhesiva con un deslizamiento de cubierta de 22 por 55 milímetros, inclinando el deslizamiento de la cubierta para evitar la formación de burbujas de aire.
Coloque la cámara en la cámara de calentamiento a 37 grados centígrados. Inicie el cronómetro y ejecute el experimento durante seis horas a 37 grados centígrados, haga videos para grabar la transformación de los megacariocitos. Después de 30 minutos, las células de la médula migran gradualmente a la periferia del explante formando una capa mono.
Después de una hora de incubación, los megacariocitos se pueden identificar por su gran tamaño y núcleos polilobulados. El número de megacariocitos aumenta después de tres horas de incubación, y algunos tienen largas extensiones. Dibuja un mapa para localizar cada sección en la cámara de incubación.
Después de una hora, identifique los megacariocitos visibles, que son células polilobuladas gigantes en la periferia de cada sección, y trace sus posiciones en el dibujo. Repita este procedimiento después de tres y seis horas. Los megacariocitos se cuentan manualmente y se clasifican según su morfología a las tres y seis horas después del sellado de la cámara de incubación.
Se clasifican como pequeños, grandes con intención gruesa y proplatelet que se extienden. Con la ayuda del mapeo, su evolución se puede seguir a lo largo del tiempo. Los resultados se expresan como un porcentaje de cada clase en cada momento de observación.
Clásicamente, la mitad de los megacariocitos visibles en la periferia extienden los proplatlets a las seis horas para la médula ósea de ratón de tipo salvaje. El destino de los megacariocitos redondos fue seguido por la captura de imágenes secuenciales a lo largo del tiempo para obtener imágenes de cómo forman los proplatlets. Una cosa importante a recordar al intentar este procedimiento es mantener los explantes a 37 grados Centígrados durante la duración del experimento.
Una temperatura diferente puede cambiar los resultados. Curiosamente, el protocolo de explante se puede utilizar después de experimentos de microscopía introvertidos. Al final, los megacariocitos en los explantes de médula ósea serán naturalmente fluorescentes, y su comportamiento se puede investigar fácilmente.
Esto permite combinar diferentes tratamientos en los mismos animales y así reducir el número de ratones. En conclusión, el método de explante es rápido, simple y proporciona mucha información sobre la capacidad de los megacariocitos naturales a los proplatlets externos. El hallazgo cualitativo y cuantitativo resultante es clave para nuestra comprensión de la enfermedad trombofílica.
en un contexto fisiológico o patológico.
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Descripción general
Este artículo presenta un método de explante rápido y reproducible para visualizar la formación de protoplaquetas a partir de megacariocitos de ratón madurados en su entorno fisiológico de médula ósea. El protocolo permite la observación en tiempo real y el análisis cuantitativo de la extensión de protoplaquetas, aportando información sobre el comportamiento de los megacariocitos en condiciones fisiológicas y patológicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Hematología
- Biología celular
- Microscopía
Antecedentes
- La megacariopoyesis culmina con la formación de preplaquetas a partir de megacariocitos maduros.
- Los sistemas tradicionales de cultivo in vitro pueden no reflejar con precisión los procesos de diferenciación y maduración in vivo.
- Pueden surgir artefactos e interpretaciones erróneas a partir de los métodos convencionales de cultivo.
- Estudiar los megacariocitos en su entorno natural es fundamental para comprender las enfermedades trombófilas.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método para observar la formación de preplquetas a partir de megacariocitos nativos en tiempo real.
- Permitir la evaluación cualitativa y cuantitativa de la morfología de los megacariocitos y la extensión de las preplquetas.
- Facilitar el estudio de mutaciones genéticas y tratamientos farmacológicos que afectan específicamente la formación de preplquetas.
Métodos Utilizados
- Obtención de médula ósea fresca de fémures de ratón mediante lavado con tampón de Tyrode.
- Seccionado de la médula en cortes transversales de 0,5 mm e incubación a 37 °C en un tampón fisiológico con suero de ratón.
- Colocación de los cortes en una cámara de incubación bajo un microscopio invertido equipado con una cámara de video.
- Mapa manual, conteo y clasificación morfológica de megacariocitos en múltiples puntos temporales (1, 3 y 6 horas).
Resultados Principales
- Los megacariocitos se vuelven visibles en la periferia del explante y pueden observarse hasta por 6 horas.
- Las células muestran cambios morfológicos dinámicos, incluyendo formas esféricas, prolongaciones gruesas y una extensa ramificación de proplacetas.
- Aproximadamente la mitad de los megacariocitos emiten proplacetas dentro de las 6 horas, en comparación con los 4 días en cultivo estándar.
- El método permite tanto el análisis cualitativo como cuantitativo del comportamiento de los megacariocitos y la formación de proplacetas.
Conclusiones
- El método de explante es sencillo, rápido y reproducible para estudiar la formación de protoplaquetas en megacariocitos nativos.
- Evita los artefactos asociados con la diferenciación in vitro y permite la evaluación directa de intervenciones farmacológicas o genéticas.
- Este enfoque mejora la comprensión de la función de los megacariocitos y de los mecanismos de las enfermedades trombófilas en contextos fisiológicos y patológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La visualización directa de la formación de proplastocitos a partir de explantes nativos de médula ósea de ratón aborda un vacío crítico en la modelización de la megacariopoyesis en etapa tardía para la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas. Este método permite una evaluación rápida y cuantitativa de la función de los megacariocitos bajo perturbaciones fisiológicas y farmacológicas, lo que fortalece la confiabilidad predictiva en la investigación de la trombopoyesis. Su reproducibilidad y rapidez facilitan decisiones sólidas en las etapas de descubrimiento y programas preclínicos centrados en hematología.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la verificación de hipótesis terapéuticas relacionadas con la producción de plaquetas y la biología de los megacariocitos.
- Apoya la validación funcional de dianas al aislar el paso de extensión de proplaquetas en un contexto tisular natural.
- Facilita la reducción del riesgo mecanicista al distinguir los efectos sobre los procesos de maduración frente a los de extensión.
- Proporciona resultados cuantitativos para la clasificación de carteras y decisiones tempranas de avance o interrupción.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara sistemas de explantes validados y fisiológicamente relevantes para la selección de compuestos.
- Proporciona lecturas cuantitativas reproducibles de la formación de preplacetas en seis horas.
- Permite la estandarización de la clasificación morfológica y el mapeo para el desarrollo de ensayos.
- Facilita la evaluación confiable de agentes farmacológicos sin artefactos de diferenciación que interfieran.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la investigación de trastornos trombofílicos.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir la evaluación directa de intervenciones genéticas y farmacológicas.
- Reduce la ambigüedad biológica en estudios traslacionales de biomarcadores de formación plaquetaria.
- Apoya el avance ajustado al riesgo de activos en hematología.
Integración de la Canalización y del Flujo de Trabajo
Este método de explante se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al permitir un análisis rápido y cuantitativo de la función de los megacariocitos y la respuesta a fármacos en un contexto de tejido nativo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en la megacariopoiesis de etapa tardía.
- Cribado: Proporciona sistemas de explantes listos para ensayos, reproducibles, con resultados morfológicos cuantitativos.
- Análisis: Permite la clasificación, mapeo manual y comparación estadística de la extensión de proplastocitos entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con relevancia in vivo en modelos de enfermedades trombofílicas.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma escalable y estandarizada para estudios farmacológicos y genéticos repetidos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación de la biología de las plaquetas.
- Valor operativo: Proporciona resultados rápidos, reproducibles y estandarizados para flujos de trabajo entre equipos.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance/no avance y la eficiencia del capital en programas hematológicos de fase inicial.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos dirigidos a la trombopoyesis.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de médula ósea y microscopía de células vivas.
- Necesita acceso a microscopía invertida con captura de video e incubación controlada por temperatura.
- Exige estandarización entre equipos de los protocolos de clasificación morfológica y de mapeo.
- Adaptable a estudios de mutantes genéticos e intervenciones farmacológicas en modelos de ratón.
- La sensibilidad a la temperatura y la clasificación manual pueden limitar el rendimiento en análisis a gran escala.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:22
Preparation of the Experimental Set Up
1:51
Bone Marrow Sectioning and Placement into the Incubation Chamber
3:13
Real-Time Observation of Marrow Explants and Quantification of the Proplatelet-Extending Megakaryocytes
4:02
Results: Morphological Assessment of Megakaryocytes in Explants
4:45
Conclusion
