Name: Cultivo de megacariocitos en hidrogel 3D a base de metilcelulosa para mejorar la maduración celular y estudiar el impacto de la rigidez y el confinamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprende a cultivar megacariocitos en hidrogel 3D de metilcelulosa para estudiar la rigidez y confinamiento mecánico del médula ósea. Este método mejora la maduración celular y la formación de proplaquetas in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer a Fabien Pertuy y Alicia Aguilar que inicialmente desarrollaron esta técnica en el laboratorio, así como a Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Estrasburgo) que caracterizó las propiedades viscoelásticas del hidrogel de metilcelulosa. Este trabajo fue apoyado por ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) y por una beca ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher es beneficiaria de la Fondation pour la Recherche Médicale (número de subvención FRM FDT202012010422).

<ol><li>Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+of+Mechanical+Confinement+by+Mesenchymal-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Stiffness+Modulates+Patient-Derived+Glioblastoma+Cell+Fates+in+Three-Dimensional+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2020).</li>
<li>Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+via+cell-matrix+adhesions+in+3D+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments.</a> Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Choi, J. S., Harley, B. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combined+influence+of+substrate+elasticity+and+ligand+density+on+the+viability+and+biophysical+properties+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).</li>
<li>Shin, J. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+forces+sustain+and+polarize+hematopoiesis+from+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells.</a> Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).</li>
<li>Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+platelet+formation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Blood platelet formation at a glance.</a> Journal of cell science. 133 (20), (2020).</li>
<li>Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+in+a+methylcellulose-based+hydrogel+to+study+the+impact+of+stiffness+on+megakaryocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).</li>
<li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128, 2022-2032 (2016).</li>
<li>Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoietin+from+beginning+to+end%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Thrombopoietin from beginning to end.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).</li>
<li>Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+stiffness+in+megakaryocyte+and+platelet+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function.</a> American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).</li>
<li>Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+intact+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanics of intact bone marrow.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En la década anterior, la mecanobiología ha despertado cada vez más interés en muchas áreas de la biología. Ahora se reconoce comúnmente que el entorno mecánico que rodea a las células juega un papel en su comportamiento, enfatizando la importancia de estudiar cómo los megacariocitos detectan y responden a las señales mecánicas extracelulares. Es difícil medir con precisión la rigidez del tejido de la médula ósea in situ11,especialmente si consideramos la médula roja hematopoyética, ya qu...

Las células en el cuerpo experimentan un microambiente 3D complejo y están sujetas a la interacción entre las señales químicas y mecanofísicas, incluida la rigidez del tejido y el confinamiento debido a las células vecinas y la matriz circundante 1,2,3. La importancia de la rigidez y el confinamiento para el comportamiento celular solo se ha reconocido en las últimas décadas. En 2006, el trabajo seminal de Engler et al. 4 destacó la importancia del entorno mecánico para la diferenciación celular. Los autores demostraron que la variación en la rigidez del sustrato celular resultó en la orientación de las células madre hacia varios linajes de diferenciación. Desde entonces, el impacto de las señales mecánicas en el destino y el comportamiento celular se ha vuelto cada vez más reconocido yestudiado. A pesar de ser uno de los tejidos más blandos del organismo, la médula ósea tiene una organización estructural 3D que está confinada dentro del hueso. La rigidez de la médula, aunque técnicamente difícil de medir con precisión, se estima que se encuentra entre 15 y 300 Pa 5,6. Dentro del estroma, las células están estrechamente confinadas entre sí. Además, la mayoría de ellos están migrando hacia los vasos sinusoides para entrar en la circulación sanguínea. Estas condiciones crean restricciones mecánicas adicionales en las células adyacentes, que tienen que adaptarse a estas fuerzas. Las señales mecánicas representan un parámetro importante cuyas consecuencias sobre la diferenciación de megacariocitos y la formación de proplatlets se han explorado recientemente. Aunque los megacariocitos pueden diferenciarse in vitro en el cultivo líquido tradicional, no alcanzan el grado de maduración observado in vivo,en parte debido a la ausencia de las señales mecánicas del entorno 3D 7. El crecimiento de progenitores incrustados en hidrogel trae señales mecánicas 3D que carecen del entorno líquido.
Los hidrogeles se han utilizado ampliamente durante varias décadas en el campo hematológico, especialmente para cultivar células en ensayos de formación de colonias para cuantificar los progenitores hematopoyéticos. Sin embargo, tales hidrogeles rara vez se han utilizado para explorar el impacto biológico del entorno mecánico 3D en la maduración y diferenciación de las células hematopoyéticas. En los últimos años nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo de cultivo 3D utilizando un hidrogel a base de metilcelulosa 8. Este gel físico no reactivo es una herramienta útil para imitar las limitaciones físicas del entorno nativo de megacariocitos. Se deriva de la celulosa mediante la sustitución de residuos de hidroxilo (-OH) por grupos metóxido (-OCH3). Tanto el grado de sustitución de metilo como la concentración de metilcelulosa determinan la rigidez del hidrogel una vez que se ha gelatinado. Durante la etapa de desarrollo de esta técnica, se demostró que un módulo de Young en el rango de 30 a 60 Pa es la rigidez óptima del gel para el crecimiento de megacariocitos 9.
El siguiente protocolo describe un método para cultivar progenitores megacariocíticos de ratón en un hidrogel de metilcelulosa 3D. Se ha demostrado previamente que en comparación con el cultivo líquido estándar, este cultivo de hidrogel aumenta el grado de poliploidización de megacariocitos, mejora la maduración y la organización intracelular, y aumenta la capacidad de los megacariocitos para extender los proplatitos una vez resuspendidos en un medio líquido 9. Este manuscrito describe en detalle el protocolo para el aislamiento de células Lin− de médula ósea de ratón y su incrustación en un hidrogel de metilcelulosa para cultivo 3D, así como la cuantificación de su capacidad para producir proplatelets y la recuperación de las células para análisis posteriores.

<table><tbody><tr><td>Agujas de calibre 18</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001735825</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de calibre 21</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de calibre 23</td><td>Terumo</td><td>AN*2332R1</td><td></td></tr><tr><td>Neeldes de calibre 25</td><td>BD Microlance</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 4 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>jeringas de 5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS+05S1</td><td></td></tr><tr><td>Cytoclips</td><td>Microm Microm Microtech</td><td>F/CLIPSH</td><td></td></tr><tr><td>Cytofunnels equipados con tarjetas de filtro</td><td>Microm Microtech</td><td>F/JC304</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Cytospin</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Cytospin 4</td></tr><tr><td>Dakopen</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>41 966-029</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>Dulbecco estéril' Solución salina tamponada con fosfato EasySep</td></tr><tr><td>Imanes Stem</td><td>Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Ratón Hematopoyético Kit de aislamiento de células progenitoras</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19856A</td><td>anticuerpos biotinilados (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7&ndash; 4) y perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Healthcare Life Science</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Luer lock 1 mL jeringas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>o 309628 de BD MEDICAL</td></tr><tr><td>Jeringas Luer lock conectores</td><td>Fisher Scientific</td><td>11891120</td><td></td></tr><tr><td>MC 3%</td><td>R& amperio; D systems</td><td>HSC001</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos recubiertos de polilisina</td><td>Thermo Scientific</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PSG 100x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>1037-016</td><td>10.000 unidades/mL de penicilina, 10.000 &mu; g/mL de estreptomicina y 29,2 mg/mL de glutamina</td></tr><tr><td>Suero de rata</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>hirudin recombinante</td><td>Transg&egrave; ne</td><td>rHV2-Lys47</td><td></td></tr><tr><td>Trombopoyetina humana recombinante (rhTPO)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>2822</td><td>10.000 unidades/mL</td></tr><tr><td>Tubos de plastique de 10 mL de fondo redondo Falcon</td><td></td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de fondo redondo de</td><td></td><td></td><td></td> 5 mL</tr></tbody></table>

cultivo de megacariocitos en hidrogel 3d a base de metilcelulosa para mejorar la maduración celular y estudiar el impacto de la rigidez y el confinamiento

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

El entorno 3D que conduce tanto al confinamiento como a las restricciones mecánicas se reconoce cada vez más como un determinante importante del comportamiento celular. Por lo tanto, el cultivo 3D se ha desarrollado para abordar mejor la situación in vivo. Los megacariocitos se diferencian de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) en la médula ósea (BM). El BM es uno de los tejidos más blandos del cuerpo, confinado dentro del hueso. Al ser el hueso poco extensible a escala celular, los megacariocitos están sometidos concomitantemente a una rigidez débil y un alto confinamiento. Este protocolo presenta un método para la recuperación de HSPCs de linaje de ratón negativo (Lin-) mediante clasificación inmunomagnético y su diferenciación en megacariocitos maduros en un medio 3D compuesto de metilcelulosa. La metilcelulosa no es reactiva a los megacariocitos y su rigidez puede ajustarse a la de la médula ósea normal o aumentarse para imitar una médula fibrótica patológica. El proceso para recuperar los megacariocitos para análisis celulares adicionales también se detalla en el protocolo. Aunque la extensión del proplatelet se impide dentro del entorno 3D, se describe a continuación cómo resuspendir los megacariocitos en medio líquido y cuantificar su capacidad para extender los proplatlets. Los megacariocitos cultivados en hidrogel 3D tienen una mayor capacidad para formar proplatlets en comparación con los cultivados en un entorno líquido. Este cultivo 3D permite i) diferenciar progenitores hacia megacariocitos que alcanzan un mayor estado de maduración, ii) recapitular fenotipos que pueden observarse in vivo pero que pasan desapercibidos en cultivos líquidos clásicos, y iii) estudiar vías de transducción inducidas por las señales mecánicas proporcionadas por un entorno 3D.

Los datos obtenidos utilizando este protocolo fueron publicados originalmente en Blood en 20169.
De acuerdo con el protocolo, las células se sembraron en medio de hidrogel líquido o metilcelulosa. Las células en medio líquido se han sedimentado en el fondo del pozo, en contacto con la superficie plástica rígida y, en algún momento, con otras células. Por el contrario, las células incrustadas en el hidrogel de metilcelulosa se distribuyen homogéneamente en el gel y se aí...

Ahora se reconoce que el entorno tridimensional de las células puede desempeñar un papel importante en su comportamiento, maduración y/o diferenciación. Este protocolo describe un modelo de cultivo celular tridimensional diseñado para estudiar el impacto de la contención física y las restricciones mecánicas en los megacariocitos.

Cultivo de megacariocitos en hidrogel 3D a base de metilcelulosa para mejorar la maduración celular y estudiar el impacto de la rigidez y el confinamiento

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...

Este protocolo permite evaluar in vitro el impacto del confinamiento y la rigidez media a la que están expuestos los megacariocitos nativos en la médula ósea sobre su comportamiento y maduración. La principal ventaja de esta técnica es un modelo simplificado que elimina las interacciones célula-célula y matriz celular y se centra en los aspectos mecánicos. Deben observarse estrictamente las buenas prácticas de laboratorio y las condiciones de trabajo estériles.De hecho, incluso una ligera contaminación del hidrogel puede tener un impacto dramático en la diferenciación de megacariocitos. Para obtener un solo pozo de cultivo de células de hidrogel, comience descongelando dos alícuotas de un mililitro de metilcelulosa al 3% a temperatura ambiente, luego cubra una jeringa de bloqueo Luer de un mililitro con la metilcelulosa extrayendo primero un mililitro y luego expulsándola toda. A continuación, con la misma jeringa y aguja, extraiga 333 microlitros de metilcelulosa de una alícuota fresca.Después de retirar cuidadosamente la aguja, use forzadores esterilizados para atornillar un conector de bloqueo Luer en el extremo de la jeringa, luego conecte una segunda jeringa de bloqueo Luer de un mililitro sin recubrimiento al conector. Distribuya por igual la metilcelulosa entre las dos jeringas y diséchelas a un lado. A continuación, resuspend las células madre y progenitoras hematopoyéticas negativas del linaje de ratón previamente aisladas en el medio de cultivo concentrado a una densidad de una vez 10 a las seis células por 167 microlitros.Desconecte una de las jeringas del conector y pipetee 167 microlitros de la suspensión de la celda directamente en el conector mientras extrae simultáneamente el émbolo de la jeringa lentamente para dejar espacio para la suspensión de la celda. Después de agregar toda la suspensión de la celda en el conector, extraiga el émbolo para retirar la suspensión del conector y vuelva a conectar cuidadosamente la segunda jeringa, teniendo cuidado de no perder ninguna suspensión en la rosca del tornillo. Para homogeneizar el medio de metilcelulosa con la suspensión celular, mueva lentamente los émbolos hacia adelante y hacia atrás entre las dos jeringas 10 veces, luego extraiga el volumen total en una jeringa y desconecte las dos jeringas, dejando el conector en la vacía.Vacíe el contenido de la jeringa en un pozo de una placa de cuatro pozos e incube la placa a 37 grados bajo 5% de dióxido de carbono. Para analizar los proplatlets, en el tercer día de cultivo, transfiera cuidadosamente todas las células de un pozo a un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de DMEM con 1% PSG. Resuspend las células mediante pipeteo suave para diluir completamente la metilcelulosa, luego centrifugar el tubo durante cinco minutos a 300 veces G a temperatura ambiente.Después de desechar el sobrenadante, vuelva a colocar el pellet celular en un mililitro de medio de cultivo completo y vuelva a sembrar las células a 500 microlitros por pozo de una placa de cuatro pozos. Incubar la placa a 37 grados centígrados bajo 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, utilizando un microscopio Brightfield con un objetivo 20X, adquiera aleatoriamente 10 imágenes por pozo, asegurándose de no tener demasiadas células en el campo de visión y capturando al menos cinco megacariocitos por campo.Usando ImageJ, cuente el número total de megacariocitos y los que extienden proplatelets en cada imagen para calcular la proporción de megacariocitos que extienden proplatelets. Para fijar las células para futuros análisis, agregue la solución fijadora sobre la metilcelulosa sin interrumpir el gel. Después de esperar un tiempo apropiado dependiendo del fijador utilizado, use una pipeta P1000 para pipetear suavemente el fijador y el gel hasta que la metilcelulosa se haya diluido homogéneamente.Y usando la misma punta de pipeta, transfiera todo el contenido del pozo a un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de DPBS y homogeneice mezclando. Centrifugar la mezcla. Deseche el sobrenadante y resuspante el pellet de megacariocitos en un medio apropiado para el análisis deseado.Para el tercer día de cultivo, los megacariocitos en el medio líquido se han sedimentado en el fondo del pozo y están en contacto con la superficie plástica rígida, así como con otras células. En contraste, las células incrustadas en el hidrogel de metilcelulosa están distribuidas homogéneamente y aisladas de las células vecinas. Un análisis del diámetro medio de los megacariocitos en diferentes condiciones de cultivo muestra que el 2% de metilcelulosa aumenta ligeramente el diámetro medio de los megacariocitos en comparación con el cultivo líquido.Sin embargo, el aumento de la concentración de metilcelulosa en un 0,5% perjudica la diferenciación de megacariocitos como lo indica un diámetro medio más pequeño. En imágenes representativas de microscopía electrónica de transmisión, las membranas intracitoplasmáticas en los megacariocitos diferenciados in vivo dentro de la médula ósea parecen estar estrechamente opuestas con los territorios citoplasmáticos delineados. En cultivo líquido, las membranas tienen en su mayoría una pequeña apariencia ovalada redonda o vesículas alargadas sin delimitación de territorios citoplasmáticos.Por el contrario, el cultivo de metilcelulosa al 2% tiene membranas estrechamente opuestas con territorios citoplasmáticos delimitadores que se asemejan a la estructura in situ. Para el cuarto día de cultivo, los megacariocitos previamente cultivados en hidrogel muestran una mayor formación de proplatlet en comparación con los cultivados en medio líquido. La proporción media de proplatados extensibles de megacariocitos suele ser de alrededor del 15 al 20% con un precultor líquido en comparación con el 35 al 40% con un precultor de hidrogel de metilcelulosa.Al intentar este procedimiento, es importante pipetear los volúmenes apropiados con mucha precisión, ya que un cambio menor en la concentración final de metilcelulosa puede modificar significativamente la rigidez del medio. Después de la maduración celular en el hidrogel, los megacariocitos pueden ser recuperados para el análisis de ploidía y marcadores celulares por citometría de flujo o fijados para microscopía electrónica o inmunotinción de proteínas de interés.

megakaryocyte-culture-3d-methylcellulose-based-hydrogel-to-improve

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se presenta un protocolo para obtener matrices derivadas de células ricas en proteínas de la matriz extracelular, utilizando Crowders macromoleculares (MMC). Además, se presenta un protocolo que incorpora MMC en 3D generación de la piel de co-cultivo organotípicos, lo que reduce el tiempo de cultivo, manteniendo la madurez del constructo.

La mejora en 2D y 3D de la piel<em&gt; In Vitro</em&gt; Uso de modelos macromoleculares hacinamiento

Este es un método para crear un andamio de cultivo celular de 3 dimensiones de la matriz extracelular pulmonar. pulmonar intacta se procesa en hidrogeles que pueden apoyar el crecimiento de células en tres dimensiones.

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

Este protocolo describe la fabricación de microcryogels elástico macroporoso 3D integrando microfabricación con tecnología cryogelation. A cargar con las células, se generan microtissues 3D, que puede ser fácilmente inyectados en vivo para facilitar la terapia regenerativa o montado en arreglos de discos para en vitro screening de drogas de alto rendimiento.

Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento

Adjunto, presentamos un protocolo para el cultivo 3D de rata células glia derivado del cerebro, incluyendo astrocitos, microglia y oligodendrocitos. Demostramos cultivo celular primario, síntesis de hidrogel desarrolla el ácido hialurónico (HAMA), encapsulación HAMAphoto-polimerización y de la célula y muestra de procesamiento para la proyección de imagen microscópica electrónica de barrido y confocal.

Mejora 3D hidrogel culturas de células Glial primarias para In Vitro modelado de neuroinflamación

Aquí, presentamos un protocolo para obtener sistemas 3D-cultura en uno mismo-montaje de andamios péptido para promover la diferenciación de condrocitos articulares humanos dedifferentiated en tejido similar al cartílago.

Cultivo de células de mamífero en andamios tridimensionales péptido

Se presenta un protocolo para preparar polivinilos hidrogeles de ácido itacónico-co-alcohol con rigidez variable, que han sido injertadas con y sin oligopéptidos, para investigar el efecto de la rigidez de los biomateriales en la diferenciación y proliferación de células madre. La rigidez de los hidrogeles fue controlada por el tiempo de reticulación.

Cultura de células madre humanas pluripotentes en polivinilos hidrogeles ácidos itacónico-Co-Alcohol con rigidez variable en condiciones libres de Xeno

Hidrogeles de ingeniería de la proteína recombinantes son ventajosos para el cultivo celular 3D ya que permiten completa afinabilidad de la espina dorsal del polímero y por lo tanto, el microambiente de la célula. Aquí, describimos el proceso de purificación de proteína recombinante como elastina y su aplicación en la encapsulación de la célula de hidrogel 3D.

Producción de la proteína elastina como hidrogeles para encapsulación y el Immunostaining de células en 3D

En este trabajo, se presenta un inserto impreso en 3D de nuevo diseño como modelo de cocultivo y se valida mediante el estudio de la comunicación intercelular paracrina entre las células endoteliales y los queratinocitos.

Un innovador inserto impreso en 3D diseñado para permitir cultivos celulares sencillos en 2D y 3D

Se establece un modelo in vitro del nicho vascular de la médula ósea mediante la siembra de células mesenquimales y endoteliales en hidrogeles PEG 3D prefabricados. Las redes endoteliales, los componentes de ECM y la actividad ALP de los nichos varían según el factor de crecimiento utilizado. La plataforma se puede utilizar para modelos avanzados de cáncer.

Establecimiento simple de un nicho de médula ósea osteogénica vascularizada utilizando hidrogeles de poli(etilenglicol) (PEG) prefabricados en una microplaca de imágenes

Este protocolo describe la fabricación de construcciones óseas 3D utilizando osteocitos humanos incrustados en hidrogelatinas metacriladas (GelMA) suplementadas con matriz extracelular descelularizada. El método es de bajo coste, escalable y compatible con equipos básicos de laboratorio, proporcionando una plataforma traslacional para estudiar los procesos de enfermedad musculoesquelética.

Una plataforma de cultivo óseo 3D que utiliza osteocitos humanos y matriz extracelular descelularizada para modelar enfermedades musculoesqueléticas

Aprende a cultivar megacariocitos en hidrogel 3D de metilcelulosa para estudiar la rigidez y confinamiento mecánico del médula ósea. Este método mejora la maduración celular y la formación de proplaquetas in vitro.

Cultivo de megacariocitos en hidrogel 3D a base de metilcelulosa para mejorar la maduración celular y estudiar el impacto de la rigidez y el confinamiento (Video) | JoVE Journal

Cultivo de megacariocitos en hidrogel 3D a base de metilcelulosa para mejorar la maduración celular y estudiar el impacto de la rigidez y el confinamiento

Explorar más videos