Modificaciones del método de Langendorff para el aislamiento simultáneo de miocitos auriculares y ventriculares de ratones adultos
May 13th, 2021
Este protocolo describe modificaciones del método de Langendorff, incluida la profundidad de la canulación de la aorta para el aislamiento simultáneo de miocitos auriculares y ventriculares de ratones adultos.
Este protocolo podría ayudar a mejorar el rendimiento auricular de un corazón de ratón perfundido. La principal ventaja de este método es que el miocito auricular y ventricular se puede aislar simultáneamente bajo la misma condición de digestión. Este método podría proporcionar información sobre los mecanismos de la enfermedad cardíaca a nivel celular y subcelular.
Después de la eutanasia de un ratón macho C57 negro de seis de ocho a 10 semanas de edad, use fórceps de tejido para levantar la piel del xifoide. Luego, usando tijeras de tejido, haga una incisión lateral menor a través de la piel. Realizar una disección contundente entre la piel y la fascia.
Extienda la incisión de la piel hacia las axilas en forma de V en ambos lados y continúe la incisión a través de la caja torácica. Luego, con fórceps de tejido, sujete el esternón y desvíe la caja torácica hacia arriba para exponer completamente el corazón y los pulmones. Usando fórceps curvas, despegue el pericardio.
Si la glándula del timo cubre los grandes vasos, use dos pinzas curvas para desgarrar la glándula del timo hacia ambos lados, luego tire suavemente de la base del corazón hacia la cola hasta que la aorta y sus arterias ramificadas sean visibles como un vaso sanguíneo en forma de Y. Transecte la aorta en la arteria carótida común izquierda, luego corte la arteria braquiocefálica. Extirpa el corazón e inmediatamente sumérgelo en una placa de Petri que contenga la solución de Tyrode para lavar y bombear la sangre residual.
Luego transfiera el corazón a otra placa de Petri que contenga la solución uno. Bajo un microscopio estereoscópico, usando tijeras finas de Iris, recorte cualquier tejido excedente. Expulse las burbujas de aire de la jeringa.
Luego, con la ayuda de dos pinzas de amarre rectas, realice la canulación aórtica retrógrada, cuidando que todo el proceso de canulación se realice debajo de la superficie líquida. Ajuste la profundidad de la canulación de tal manera que la punta de la cánula esté en la aorta ascendente, teniendo cuidado de no penetrar en las válvulas aórticas. Luego, con una sutura 3-O pre-nudo, ligar la aorta a la muesca de la cánula.
Inyecte suavemente la solución uno de la jeringa para eliminar la sangre residual. Luego conecte el corazón canulado al aparato de Langendorff, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en el corazón. Después de conectar el corazón canulado al aparato de Langendorff, perfunda el corazón con la solución uno durante aproximadamente dos minutos.
Usando una pipeta de polietileno estéril de un solo uso, extraiga aproximadamente 2,5 mililitros de solución tres y precalentarla en el baño de agua para su uso posterior. Luego, para digerir los tejidos, perfunda el corazón con la solución restante tres durante aproximadamente 11 a 12 minutos. Después de los primeros dos minutos de perfusión con la solución tres, recicle la solución perfundida a los depósitos de perfusato por la bomba peristáltica para su reutilización hasta que se complete la digestión.
Cuando el corazón se hincha, se vuelve ligeramente pálido y flácido, usando pinzas dentadas, pellizque suavemente el miocardio. Si una huella es visible, termine la digestión y separe el corazón del aparato. Para aislar los miocitos arteriales y ventriculares, use fórceps para eliminar los ventrículos y las aurículas y colóquelos en diferentes placas de Petri.
Luego agregue la solución tres precalentada a ambos platos. Usando fórceps contundentes, triture los tejidos en una textura turbia, luego pipetee suavemente el tejido para una digestión uniforme sin introducir burbujas de aire. Para detener la actividad enzimática restante, usando una pipeta, transfiera el tejido digerido turbio a la solución cuatro, luego centrífuga durante 20 segundos a 192 veces G.Después de eliminar el sobrenadante, vuelva a suspender el sedimento celular en la solución cinco.
Para evitar la paradoja del calcio y la sobrecarga de calcio, reintroduzca el calcio de manera gradual agregando gradualmente un total de 50 microlitros de cloruro de calcio de 100 milimolares por litro a la suspensión celular. Una vez que se haya agregado todo el cloruro de calcio, almacene las células en la solución de Tyrode para el estudio de la pinza de parche. La profundidad de la canulación se asocia con la perfusión de las aurículas y sus apéndices.
Cuando la punta de la cánula está en la aorta ascendente, ambos apéndices auriculares se inflan, lo que indica suficiente perfusión de aurículas. Sin embargo, cuando la punta de la cánula está en la raíz aórtica, ambos apéndices auriculares se enjuagan, lo que indica una perfusión insuficiente. Los miocitos auriculares aislados por canulación en la aorta ascendente tuvieron tasas de supervivencia más altas que los aislados por canulación en la raíz aórtica tanto antes como después de la reintroducción de calcio.
Por el contrario, no hubo diferencias en las tasas de supervivencia de los miocitos ventriculares aislados por canulación en la aorta ascendente o en la raíz aórtica antes y después de la reintroducción del calcio. El registro de la pinza de parche de células enteras de la corriente de sodio en los miocitos auriculares y ventriculares aislados, así como las densidades actuales confirman que la calidad de las células aisladas cumple con los requisitos para los experimentos electrofisiológicos. Al transectar la aorta, asegúrese de retener una glándula suficiente para la ligadura.
De lo contrario, la cánula puede penetrar en la válvula aórtica después de la ligadura.
Descripción general
Este protocolo describe modificaciones del método de Langendorff para el aislamiento simultáneo de miocitos auriculares y ventriculares de ratones adultos. El método mejora el rendimiento de los miocitos auriculares mientras mantiene la calidad de las células aisladas para estudios electrofisiológicos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Fisiología cardiovascular
- Biología celular
- Electrofisiología
Antecedentes
- El método de Langendorff es una técnica ampliamente utilizada para la perfusión del corazón.
- Aislar simultáneamente miocitos auriculares y ventriculares puede proporcionar mejores conocimientos sobre la función cardíaca.
- Entender el comportamiento de los miocitos es crucial para el estudio de las enfermedades cardíacas.
- Mejorar el rendimiento de los miocitos auriculares es esencial para resultados experimentales precisos.
Propósito del estudio
- Mejorar el rendimiento de los miocitos auriculares de corazones de ratón.
- Permitir el aislamiento simultáneo de miocitos auriculares y ventriculares.
- Investigar los mecanismos celulares subyacentes a las enfermedades cardíacas.
Métodos utilizados
- Se eutanasiaron ratones machos adultos C57BL/6 para la extracción del corazón.
- Se realizó una canulación aórtica retrógrada para la perfusión.
- Los corazones se perfundieron con soluciones específicas para la digestión.
- Los miocitos se aislaron y prepararon para estudios electrofisiológicos.
Principales resultados
- Los miocitos auriculares aislados utilizando el método modificado mostraron tasas de supervivencia más altas.
- El aislamiento simultáneo no afectó la calidad de los miocitos ventriculares.
- Los registros electrofisiológicos confirmaron la viabilidad de las células aisladas.
- La profundidad óptima de canulación fue crítica para una perfusión auricular efectiva.
Conclusiones
- El método de Langendorff modificado mejora el rendimiento de los miocitos auriculares.
- El aislamiento simultáneo mejora las capacidades de investigación en fisiología cardíaca.
- Este protocolo puede facilitar una mejor comprensión de los mecanismos de las enfermedades cardíacas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Simultaneous isolation of atrial and ventricular myocytes using a modified Langendorff method addresses a critical bottleneck in cardiac target validation and mechanistic de-risking. This protocol enables high-quality, reproducible cell preparations essential for predictive electrophysiological assays and translational cardiac research. The approach supports robust early discovery and preclinical workflows by ensuring reliable access to both atrial and ventricular cell types from a single preparation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of atrial and ventricular mechanisms in disease-relevant systems.
- Supports functional target validation by providing viable myocytes for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in cardiac safety and efficacy assessments.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability cardiomyocytes for downstream electrophysiological assays.
- Improves assay reproducibility by controlling for cell source and preparation conditions.
- Enables scalable preparation of both atrial and ventricular cells for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cellular models with disease-relevant atrial and ventricular pathologies.
- Ensures continuity from early discovery through preclinical cardiac safety studies.
- Reduces biological risk by validating cell quality for patch clamp and functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical cardiac research, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification and safety de-risking.
- Discovery Biology: Provides robust cellular substrates for mechanistic hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for electrophysiological assay development.
- Analytics: Enables direct measurement of sodium currents and cell viability for comparative studies.
- Translational Research: Bridges cellular findings to preclinical cardiac models by ensuring cell quality and relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable protocol for consistent cardiomyocyte isolation across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in cardiac dissection and Langendorff perfusion.
- Needs access to specialized perfusion apparatus and patch clamp infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of cannulation and digestion steps.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or cardiac disease models.
- Careful control of cannulation depth is critical for optimal atrial cell yield and viability.
