Name: In Vivo Imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprende a visualizar megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón mediante microscopía de dos fotones. Este protocolo permite estudiar la formación de plaquetas en condiciones fisiológicas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer a Florian Gaertner (Instituto de Ciencia y Tecnología de Austria, Klosterneuburg, Austria) por su asesoramiento experto sobre experimentos de microscopía de dos fotones en el momento en que establecimos la técnica en el laboratorio, e Yves Lutz en el Centro de Imágenes IGBMC / CBI (Illkirch, Francia) por su experiencia y ayuda con el microscopio de dos fotones. También agradecemos a Jean-Yves Rinkel por su ayuda técnica e Ines Guinard por el dibujo del esquema en la Figura 1. Agradecemos a ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) su apoyo en la adquisición del microscopio de dos fotones. AB fue apoyado por becas postdoctorales de Etablissement Français du Sang (APR2016) y de la Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).

<ol><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels%3A+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimenal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+kinase+2+%28Sphk2%29+regulates+platelet+biogenesis+by+providing+intracellular+sphingosine+1-phosphate+%28S1P%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P).</a> Blood. 122 (5), 791-802 (2013).</li>
<li>Kowata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+demand+modulates+the+type+of+intravascular+protrusion+of+megakaryocytes+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow.</a> Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1alpha+induces+thrombopoiesis+through+megakaryocyte+rupture+in+response+to+acute+platelet+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs.</a> Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).</li>
<li>Lefrancais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lung+is+a+site+of+platelet+biogenesis+and+a+reservoir+for+haematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors.</a> Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).</li>
<li>Potts, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+budding+is+a+major+mechanism+of+in+vivo+platelet+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206(2020).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683(2014).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pf4-Cre+transgenic+mice+allow+the+generation+of+lineage-restricted+gene+knockouts+for+studying+megakaryocyte+and+platelet+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo.</a> Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).</li>
<li>Pertuy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broader+expression+of+the+mouse+platelet+factor+4-cre+transgene+beyond+the+megakaryocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).</li>
<li>Calaminus, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+Pf4-Cre+marks+hematopoietic+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny.</a> PLoS One. 7 (12), 51361(2012).</li>
<li>Stegner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoiesis+is+spatially+regulated+by+the+bone+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 127(2017).</li>
<li>Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+particle+velocity+from+space-time+images+using+the+Radon+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform.</a> Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).</li>
<li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+suppresses+platelet+aggregation+possibly+by+suppressed+inositol+triphosphate+formation+and+subsequent+suppression+of+cytosolic+calcium+increase%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase.</a> Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).</li>
<li>Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+time-lapse+in+vivo+imaging+of+tibia+bone+marrow+to+visualize+dynamic+hematopoietic+stem+cell+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment.</a> Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).</li>
<li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).</li>
<li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cellular+imaging+pinpoints+the+role+of+reactive+oxygen+species+in+the+early+steps+of+adult+hematopoietic+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li>
<li>Reismann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+intravital+imaging+of+the+femoral+bone+marrow+reveals+plasticity+within+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 2153(2017).</li>
<li>Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femur+window+chamber+model+for+in+vivo+cell+tracking+in+the+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205(2016).</li>
<li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Light+Science+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light Science & Applications. 7, 12(2018).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li>
<li>Kim, J., Bixel, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+the+bone+and+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment.</a> Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Los mecanismos de formación de plaquetas son altamente dependientes del entorno de la médula ósea. Por lo tanto, la microscopía intravital se ha convertido en una herramienta importante en el campo para visualizar el proceso en tiempo real. Los ratones con megacariocitos fluorescentes se pueden obtener cruzando ratones que expresan la cre recombinasa en megacariocitos con cualquier ratón reportero floxed que contenga un casete de expresión génica fluorescente condicional. Aquí, se utilizaron ratones reporteros mTmG (B6.1...

Las plaquetas son producidas por células especializadas en megacariocitos ubicadas en la médula ósea. La forma precisa en que los megacariocitos liberan plaquetas en la circulación ha permanecido poco clara durante mucho tiempo debido al desafío técnico en la observación de eventos en tiempo real a través del hueso. La microscopía de dos fotones ha ayudado a superar este desafío y ha llevado a grandes avances en la comprensión del proceso de formación de plaquetas. Las primeras observaciones in vivo de megacariocitos fueron realizadas por von Andrian y sus colegas en 2007, con la visualización de megacariocitos fluorescentes a través del cráneo1. Esto fue posible porque la capa ósea en el cráneo frontoparietal de ratones adultos jóvenes tiene un grosor de unas pocas decenas de micras y es lo suficientemente transparente como para permitir la visualización de células fluorescentes en la médula ósea subyacente2.
Los estudios posteriores aplicaron este procedimiento para evaluar la formación de proplatlets en diversas condiciones y para descifrar los mecanismos subyacentes3,4,5,6. Estos estudios proporcionaron evidencia definitiva de que los megacariocitos extienden dinámicamente las protuberancias, llamadas proplatlets, a través de la barrera endotelial de los vasos sinusoides(Figura 1). Estos proplatlets se liberan como fragmentos largos que representan varios cientos de plaquetas en volumen. Las plaquetas se formarán después de la remodelación de los proplatlets en la microcirculación de los órganos aguas abajo, especialmente en los pulmones7. Hasta la fecha, sin embargo, el proceso preciso y los mecanismos moleculares siguen siendo objeto de debate. Por ejemplo, el papel propuesto de las proteínas citoesqueléticas en el alargamiento de los proplatlets difiere entre las condiciones in vitro e in vivo 3, y las diferencias en la formación de proplatlet se han demostrado en condiciones inflamatorias6. Para complicar aún más las cosas, un estudio reciente cuestionó el concepto impulsado por proplatelets y propuso que in vivo,las plaquetas se forman esencialmente a través de un mecanismo de gemación de membrana en el nivel de megacariocitos8.
Este trabajo presenta un protocolo para la observación de megacariocitos y proplatlets en la médula ósea a partir del hueso del cráneo en ratones vivos, utilizando un procedimiento mínimamente invasivo. Se han descrito enfoques similares para visualizar otras células de la médula, en particular las células madre y progenitoras hematopoyéticas9. El enfoque aquí está en la observación de megacariocitos y plaquetas para detallar algunos parámetros que se pueden medir, en particular las morfologías propallet y la velocidad plaquetaria. Este protocolo presenta cómo insertar un catéter en la vena yugular para inyectar trazadores fluorescentes y medicamentos y observar a través del hueso del cráneo. El hueso calvarial se expone mediante cirugía menor para que se pegue un anillo al hueso. Este anillo sirve para inmovilizar la cabeza y evitar movimientos debidos a la respiración y formar una copa llena de solución salina como medio de inmersión de la lente. Esta técnica es muy adecuada para i) observar en tiempo real la geometría sinusoide y los megacariocitos interactuando con la pared del vaso; ii) seguir a los megacariocitos en el proceso de formación, elongación y liberación de proplatlet; y iii) medir los movimientos plaquetarios para monitorear el flujo sanguíneo sinusoide complejo. Los datos obtenidos mediante este protocolo han sido publicados recientemente3.

<table><tbody><tr><td>GNU Octave software</td><td>Proyecto</td><td></td> GNU <td>https://www.gnu.org/software/octave/</td></tr><tr><td>&nbsp; Histoacryl 5 x 0,5 mL</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>solución inyectable de pegamento quirúrgico</td></tr><tr><td>Detectores híbridos HyD Leica Microsystems 4tunes</td> Proyecto <td></td> ImageJ GNU de Leica Microsystems <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Se requiere una versión mínima Imalgene</td>/Ketamine 1000 fl/10 mL Boehring 03661103003199 protección ocular <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Leica SP8 MP DIVE equipado con un objetivo de agua de 25x, apertura numérica de 0,95</td><td>Excitación simultánea de Leica Microsystems</td><td></td><td>de AlexaFluor-488 y Qtracker-655</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>Ocrygel 10 g</td><td>Laboratoires T.V.M.</td><td>03700454505621</td><td>Pasta dental de silicona azul y amarillo</td></tr><tr><td>Picodent twinsin speed</td><td>Rotec</td><td>13001002</td><td></td></tr><tr><td>Qtracker 655 etiqueta vascular</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td>solución inyectable</td></tr><tr><td>Escáner resonante, 8 o 12 kHz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun Xilacina 2% fl/25 mL</td><td>Gel</td><td></td> Bayer 04007221032311 <td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td></td><td></td><td>para pegar el anillo al hueso</td></tr><tr><td>Catéter Surflo IV - Azul 22 G</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2225C1</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Láser pulsante Saph (Coherente) (femtosegundo)</td><td>Coherente</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Las plaquetas son producidas por megacariocitos, células especializadas ubicadas en la médula ósea. La posibilidad de obtener imágenes de megacariocitos en tiempo real y su entorno nativo se describió hace más de 10 años y arroja nueva luz sobre el proceso de formación de plaquetas. Los megacariocitos extienden protuberancias alargadas, llamadas proplatletas, a través del revestimiento endotelial de los vasos sinusoides. Este artículo presenta un protocolo para obtener imágenes simultáneas en tiempo real de megacariocitos etiquetados fluorescentemente en la médula ósea del cráneo y los vasos sinusoides. Esta técnica se basa en una cirugía menor que mantiene el cráneo intacto para limitar las reacciones inflamatorias. La cabeza del ratón se inmoviliza con un anillo pegado al cráneo para evitar que los movimientos respiren.
Utilizando microscopía de dos fotones, los megacariocitos se pueden visualizar hasta por unas pocas horas, lo que permite la observación de protuberancias celulares y proplatlets en el proceso de elongación dentro de los vasos sinusoides. Esto permite cuantificar varios parámetros relacionados con la morfología de las protuberancias (anchura, longitud, presencia de zonas de constricción) y su comportamiento de elongación (velocidad, regularidad, o presencia de pausas o fases de retracción). Esta técnica también permite el registro simultáneo de plaquetas circulantes en los vasos sinusoides para determinar la velocidad plaquetaria y la dirección del flujo sanguíneo. Este método es particularmente útil para estudiar el papel de los genes de interés en la formación de plaquetas utilizando ratones modificados genéticamente y también es susceptible de pruebas farmacológicas (estudiar los mecanismos, evaluar medicamentos en el tratamiento de trastornos de producción de plaquetas). Se ha convertido en una herramienta invaluable, especialmente para complementar los estudios in vitro, ya que ahora se sabe que la formación de proplatlet in vivo e in vitro se basa en diferentes mecanismos. Se ha demostrado, por ejemplo, que los microtúbulos in vitro son necesarios para el alargamiento proplalet per se. Sin embargo, in vivo,más bien sirven como un andamio, el alargamiento es promovido principalmente por las fuerzas del flujo sanguíneo.

Usando este protocolo, el trazador fluorescente, Qtracker-655, se administró por vía intravenosa para obtener imágenes de los vasos sinusoides de la médula ósea anastomosados en la médula ósea del cráneo y la dirección del flujo como se muestra en las flechas(Figura 4A,izquierda). Usando ratones mTmG, las plaquetas fluorescentes eGFP se registraron a lo largo de 20 s en cada rama del vaso, y su velocidad se midió utilizando el software ImageJ y GNU Octave(Figura 4A,</str...

Describimos aquí el método para obtener imágenes de megacariocitos y proplatados en la médula del hueso del cráneo de ratones vivos utilizando microscopía de dos fotones.

In Vivo Imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Este método permite la visualización en tiempo real de diferentes eventos, que tienen lugar en la médula ósea del cráneo del ratón, como los megacariocitos, extendiendo los proplatatos dentro de los vasos sinusoides. La principal ventaja de esta técnica es una cirugía menor necesaria minimizando la reacción inflamatoria, permitiendo una visualización in vivo de los eventos en las condiciones casi de fábrica. Para comenzar, transporte el ratón a la sala de imágenes.Encienda el microscopio y la computadora y configure los parámetros requeridos. Una vez que el ratón haya anestesiado por completo, coloque el ratón en un plato caliente, calentado a 37 grados centígrados para todas las manipulaciones posteriores, afeite la cabeza y la garganta del ratón y aplique el gel en los ojos para evitar la sequedad. Coloque el ratón sobre su espalda y fije las patas anteriores con cinta quirúrgica para estirar la garganta.Después de desinfectar la garganta, haga una incisión de 0,7 a 1 centímetro sobre la vena yugular derecha o izquierda con tijeras y estire el tejido conectivo adyacente para exponer la vena malabarista externa en la parte superior del músculo pectoral. Llene el catéter con solución salina fisiológica tibia y estéril. Penetre el catéter a través del músculo pectoral y luego inserte el catéter en la vena.Retire suavemente la aguja, conecte la jeringa con los trazadores fluorescentes e inyecte el volumen muerto del catéter. Coloque una gota de pegamento quirúrgico para estabilizar el catéter. Devuelva con cuidado el ratón a una posición prona.Desinfecte el cuero cabelludo con etanol al 70% con una toalla de papel mientras elimina el vello suelto. Use tijeras y pinzas finas estériles para hacer una incisión en forma de T en la línea media hasta un centímetro entre las orejas en el cuero cabelludo para exponer el calvario. Exponga el cráneo con pinzas, luego use tijeras y pinzas para quitar cuidadosamente el periostio.Use un hisopo de algodón estéril empapado y solución salina fisiológica para eliminar todo el periostio y cualquier residuo o cabello que pueda alterar la imagen. Enjuague el cráneo con solución salina para eliminar cualquier rastro de sangre y seque rápidamente el hueso con un hisopo de algodón. Aplique el gel de pegamento al anillo, coloque el anillo sobre el hueso expuesto y manténgalo durante unos segundos para permitir que el anillo se adhiera firmemente al cráneo.Humedezca ligeramente el cráneo con un hisopo de algodón con solución salina. Prepare la pasta dental de silicio mezclando cuidadosamente los componentes azul y amarillo en una proporción de uno a uno. Selle el anillo aplicando la pasta dental para evitar fugas durante las imágenes.Retire con cuidado cualquier pasta dental o pegamento que pueda haber entrado en el anillo. Luego llene el anillo con solución salina para verificar la fuga. Coloque el ratón en el soporte y coloque una compresa doblada debajo de la cabeza del animal para levantar la cabeza y evitar el desprendimiento del anillo del cráneo cuando se une al soporte.Atornille el anillo en el soporte del bloque. Coloque el soporte y el conjunto del ratón en la cámara del microscopio calentada. Establezca las longitudes de onda láser apropiadas para los cuatro cuatro elegidos y recupere las luces emitidas.Utilizando el catéter inter malabarista inyectar 50 microlitros de solución micromolar 0,2 del trazador fluorescente para etiquetar la vasculatura. Coloque la etapa del microscopio con el soporte y el mouse debajo del objetivo del microscopio. Asegúrese de que el anillo esté siempre lleno de solución salina y vuelva a llenarlo si es necesario, y sumerja el objetivo y la solución salina.Use la epifluorescencia para localizar los vasos de la médula ósea y observar los megacariocitos alineados a lo largo de los vasos sinusoides. Para adquisiciones largas, configure una adquisición espacio-temporal en 3D con una imagen de 384 por 384 píxeles utilizando un escáner de resonancia de ocho kilos de Hertz y un modo bidireccional. Use el promedio de línea con buena resolución, luego elija el tamaño de paso Z optimizado y configure el intervalo de tiempo necesario antes de comenzar la adquisición.Para adquisiciones cortas y rápidas, elija un tipo de adquisición de espacio, tiempo y minimice el tamaño de la imagen. Si es necesario, ajuste la imagen al vaso girando el campo de imágenes. Utilice la velocidad de escaneo y el escaneo bidireccional más altos disponibles.Minimice el promedio de línea para encontrar el compromiso óptimo entre la definición de la imagen y la rapidez de la adquisición. Adquiera solo un plan Z y minimice el intervalo de tiempo para la adquisición. Para medir la velocidad plaquetaria, de 10 a 20 segundos de adquisición deben ser suficientes.El marcador fluorescente se administró por vía intravenosa para obtener imágenes de los vasos sinusoides de la médula anastomosada en la médula ósea del cráneo, con la dirección del flujo representada por la flecha. Se registró la velocidad plaquetaria fluorescente en cada rama del vaso y se observó variación. Los vasos sinusoides presentan flujos complejos debido a las anastomosis, con presencia de reflujo de flujo e incluso estasis.Las flechas indicaban la dirección opuesta del flujo en la bifurcación. También se midió la velocidad plaquetaria para las ramas de los vasos izquierdo y derecho indicó irregularidad a lo largo del tiempo en cada rama del vaso con fases de aceleración, estasis y desaceleración. Se observaron diferentes morfologías de proplatelets, incluyendo proplatelets con márgenes irregulares, luego proplatelets largos y proplatelets gruesos y cortos.Cuando los megacariocitos extendieron los proplatlets en las áreas de flujos complejos, los proplalets se volcaron de una rama del vaso a la otra, de acuerdo con la dirección del flujo. Al detener el flujo sanguíneo, los proplatlets se relajaron y el ratón inesperadamente sufrió un paro cardíaco, lo que indica la importancia de las fuerzas hidrodinámicas en el alargamiento del proplatelet. También se midió el ancho y la longitud de los proplatlets de 5,2 micrómetros y se observó una longitud máxima media de aproximadamente 185 micrómetros.Trazar la longitud del proplatelet en función del tiempo permite la visualización del comportamiento de los proplatelets durante las fases de elongación, estasis o incluso retracción. Se observó la velocidad media de elongación de aproximadamente 10 micrómetros por minuto. La instalación del catéter, permitió la inyección de fármacos para estudiar los efectos sobre la formación de proplatlet u otros eventos de interés en tiempo real.

in-vivo-two-photon-imaging-megakaryocytes-proplatelets-mouse-skull

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, describimos un procedimiento quirúrgico para implantar un conjunto de anillo craneal en el hueso del cráneo expuesto e inmovilizar aún más la cabeza del ratón para obtener imágenes cerebrales de alta resolución durante mucho tiempo.

Instalación de ensamblaje de anillo craneal en modelo de ratón: un procedimiento quirúrgico para implantar un ensamblaje de ventana de visualización en un cráneo murino para obtener imágenes de médula ósea del cráneo de alta resolución

Las imágenes de lapso de tiempo en el animal vivo proporcionan información valiosa sobre la reorganización estructural en el cerebro intacto. Aquí, presentamos una preparación de cráneo adelgazado que permite la obtención de imágenes transcraneales de estructuras sinápticas marcadas con fluorescencia en la corteza del ratón vivo mediante microscopía de dos fotones.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

La naturaleza de las interacciones entre las células madre hematopoyéticas y progenitoras (hspCs) y nichos de la médula ósea es poco conocido. Modificaciones de hardware personalizados y un protocolo de adquisición de múltiples pasos permiten el uso de dos fotones y microscopía confocal a la imagen ex vivo HSPCs etiquetados alojados dentro de las áreas de la médula ósea, las interacciones de seguimiento y el movimiento.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Los monocitos son reguladores clave de la inmunidad innata y desempeñan un papel crítico en la renovación del sistema fagocítico mononuclear periférico y en caso de inflamación. Este manuscrito describe el procedimiento de obtención de imágenes en tiempo real de la médula ósea calvaria del ratón para estudiar el mecanismo de movilización de monocitos.

Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos<em&gt; En Vivo</em

Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

El protocolo describe un novedoso modelo de cámara de ventana de fémur murino que se puede utilizar para rastrear el movimiento de las células en la médula ósea femoral in vivo. La microscopía de fluorescencia multifotónica intravital se utiliza para obtener imágenes de tres componentes de la médula ósea femoral (vasculatura, matriz de colágeno y neutrófilos) a lo largo del tiempo.

Fémur Window Cámara Modelo de<em&gt; En Vivo</em&gt; Seguimiento de la célula de la médula ósea murina

Microscopía de fluorescencia intravital (IVFM) de la bóveda craneal se aplica en combinación con la genéticos modelos animales para estudiar el autoguiado hacia el blanco y el engraftment de células hematopoyéticas en la médula (BM) nichos.

Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la ultraestructura de los megacariocitos in situ utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las médulas óseas murinas se recogen, se fijan, se incrustan en resina epoxi y se cortan en secciones ultrafinas. Después de la tinción por contraste, la médula ósea se observa bajo un microscopio TEM a 120 kV.

In situ Exploración de la megacariopoyesis murina mediante microscopía electrónica de transmisión

Aquí, detallamos el método de explante de médula ósea, desde la preparación de muestras hasta el análisis microscópico de diapositivas, para evaluar la capacidad de los megacariocitos que se han diferenciado en su entorno fisiológico para formar proplatlets.

Dinámica de formación de proplatlets de explantes de médula ósea fresca de ratón

La microscopía intravital permite el estudio de procesos biológicos dinámicos como la regeneración de tejidos y el desarrollo de tumores. La médula ósea del calvario, un tejido altamente dinámico, ofrece información sobre la hematopoyesis y la función vascular. El uso de un implante de fijación de cabeza biocompatible impreso en 3D permite obtener imágenes longitudinales repetitivas, lo que mejora nuestra comprensión de la dinámica de los tejidos y el microambiente tumoral.

Imagen longitudinal intravital de la dinámica vascular en la médula ósea del calvario

Aprende a visualizar megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón mediante microscopía de dos fotones. Este protocolo permite estudiar la formación de plaquetas en condiciones fisiológicas.

In Vivo Imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón

Explorar más videos