Name: Minimizar el sangrado de la vena porta posterior a la infusión durante el trasplante intrahepático de islotes en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprende técnicas quirúrgicas refinadas para el trasplante intraportal de islotes en ratones que previenen el sangrado y reducen la mortalidad. Estos métodos mejoran la seguridad y facilitan la investigación en enfermedades hepáticas.

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Este estudio fue apoyado por el Departamento de Asuntos de Veteranos (VA-ORD BLR & D Merit I01BX004536), y el Instituto Nacional de Salud otorga subvenciones # 1R01DK105183, DK120394, DK118529, a HW. Nos gustaría darles las gracias al Sr. Michael Lee y a la Sra. Lindsay Swaby por la edición del idioma

Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación de los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur y el Centro Médico Ralph H Johnson en Charleston.
1. Inducción de la diabetes usando estreptozotocina (STZ)
<ol><li>Preparación de ratones receptores:<ol>
<li>Pesa todos los ratones individualmente.</li>
		<li>Verifique los niveles de glucosa en la sangre de una muestra de sangre de la vena de la cola usando un glucómetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinación de la dosis de STZ para tres escenarios diferentes:<ol>
<li>Para los ratones con enfermedad del hígado graso, inyecte una dosis de STZ [40 mg/kg/día, inyección intraperitoneal (i.p.)] durante 5 días consecutivos.</li>
		<li>Para los ratones NOD-SCID inyectar 125 mg/kg de STZ, inyección única, i.p. después del ayuno nocturno.</li>
		<li>Para ratones C57BL/6 inyectar 225 mg/kg de STZ, inyección única, i.p.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cálculos para STZ (13,5 mg/ml): NOTA: Este cálculo es para cinco ratones C57BL/6 con pesos corporales de 30 g:<ol>
<li>Peso corporal total: 5 ratones x 30 g/ratón = 150g</li>
		<li>STZ necesario: 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33,75 mg</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación STZ:<ol>
<li>Pesar la STZ después de la dosis precalculada.</li>
		<li>Transfiera el polvo STZ pesado a un vaso de precipitados de 10 ml sobre hielo.</li>
		<li>Agregue 3 ml de solución de citrato de sodio al vaso de precipitados para disolver el STZ.</li>
		<li>Mezcle bien, esterilice el filtro a través de un poro de 0,22 μm y use la solución STZ dentro de los 10 minutos posteriores a la preparación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inyección STZ:<ol>
<li>Cargue la cantidad deseada de solución STZ (suficiente para un ratón) en una jeringa de 1 ml.</li>
		<li>Realice la inyección intraperitoneal en el cuadrante inferior derecho del abdomen del ratón.</li>
		<li>Observe a los ratones durante 5 minutos después de la inyección y verifique si hay signos de incomodidad durante este período de tiempo antes de volver a colocarlos en las jaulas.</li>
		<li>Controle el nivel de glucosa en sangre de una muestra de sangre de la vena de la cola usando un glucómetro diariamente después de la inyección de STZ. NOTA: En este experimento, los ratones se consideran diabéticos cuando la glucosa en sangre no ayunada se > 350 mg / dL durante dos días consecutivos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación de islotes
NOTA: Los islotes humanos fueron cultivados en medios CMRL-1066 suplementados con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) a una densidad de 10.000 islotes equivalentes (IEQ) por plato de cultivo celular de 100 mm9. Los islotes de ratón se cultivaron en DMEM con 10% de FBS y 1% de P/S con la misma densidad13. Los ratones machos NOD-SCID y C57BL/7 entre 6-10 semanas de edad se obtuvieron de fuentes comerciales.
<ol><li>Separe los islotes cultivados de la placa de cultivo celular mediante un rascado suave.</li>
	<li>Seleccione a mano el número deseado de islotes (por ejemplo, 300-350 islotes) utilizando una jeringa de 1 cc y colóquelos en tubos estériles de microcentrífuga de 1,5 ml en hielo.</li>
	<li>Gire el tubo durante 10 segundos con la microcentrífuga.</li>
	<li>Retira el sobrenadante, dejando un poco de líquido para evitar perder el pellet.</li>
	<li>Resuspend el pellet en 200 μL de HBSS con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5%.</li>
	<li>Aspire los islotes resuspendidos en una jeringa de insulina de 0,5 ml.</li>
	<li>Coloque la jeringa en posición vertical. Deje que los islotes se hundan durante 1 min.</li>
	<li>Empuje la jeringa para eliminar todas las burbujas, dejando alrededor de 100-150 μL de líquido que contiene islotes.</li>
	<li>Coloque la cabeza de la jeringa hacia abajo y golpee suavemente el costado de la jeringa para permitir que los islotes se distribuyan equitativamente por todo el líquido. Los islotes ya están listos para la inyección.</li>
</ol>3. Trasplante de islotes
<ol><li>Inducir y mantener al ratón bajo anestesia general con isoflurano al 2%. Compruebe la falta de reflejos del pedal para garantizar la anestesia adecuada del animal.</li>
	<li>Afeitarse y quitar el pelaje en el área del abdomen del ratón.</li>
	<li>Administrar una dosis única preoperatoria de buprenorfina (0,1 mg/kg p.i.).</li>
	<li>Desinfectar la zona quirúrgica con tres toallitas alternas de 2% de yodo y 75% de alcohol.</li>
	<li>Realizar una laparotomía con micro tijeras para generar una incisión de 1-1,5 cm.</li>
	<li>Abra la cavidad peritoneal con un retractor. Siga con el método A o el método B como se detalla a continuación.</li>
</ol>4. Método A: (detener el sangrado con espuma de gel, Figura 1A)14,15,16 
<ol><li>Preparación del ratón<ol>
<li>Coloque una gasa estéril alrededor de la incisión.</li>
		<li>Extraiga suavemente el intestino con un fórceps y manténgalo en la gasa.</li>
		<li>Identificar la vena porta por su ubicación y exponerla bien.</li>
		<li>Cubra el intestino con una gasa tibia húmeda en solución salina durante toda la cirugía.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inserte la aguja de la jeringa de insulina precargada del islote a través de la vena porta cerca del duodeno (Figura 1B). Para hacerlo, sostenga la aguja con el orificio (bisel) hacia abajo y coloque el ángulo de la superficie de apertura paralela a la pared de la vena porta antes de penetrar a través de la pared.<ol>
<li>Tire del émbolo para extraer un poco de sangre (20-50 μL) en la jeringa para mezclar primero los islotes.</li>
		<li>Infundir los islotes en la vena porta lentamente mientras tira y empuja repetidamente la zambullida.</li>
		<li>Coloque un trozo de espuma de gel (aproximadamente 0,5 cm x 0,5 cm de tamaño) para cubrir el sitio de inyección.</li>
		<li>Presione la espuma de gel hacia abajo con una punta de algodón mientras extrae la aguja de la vena porta.</li>
		<li>Continúe presionando el gel durante aproximadamente 2 minutos para confirmar que no hay sangrado activo.</li>
		<li>Enrolle la punta de algodón sobre y lejos de la espuma de gel para asegurarse de que la espuma de gel cubra bien la vena porta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Método B: (detener el sangrado con almohadilla de grasa, Figura 1C)17
<ol><li>Exponga la vena porta a fondo.<ol>
<li>Use dos puntas de algodón para sostener la vena porta expuesta tanto del lado izquierdo como del derecho.</li>
		<li>Identifique la almohadilla de tejido graso entre el duodeno y la vena porta.</li>
		<li>Penetre a través de la almohadilla de grasa antes de insertar la aguja en la vena porta (Figura 1D).</li>
		<li>Infundir los islotes, siguiendo el procedimiento similar descrito anteriormente en las partes 4.2.1 y 4.2.2 del método A.</li>
		<li>Saque la aguja mientras presiona la grasa con una punta de algodón.</li>
		<li>Continúe presionando la almohadilla de grasa durante 1 minuto después de quitar la aguja.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de confirmar que no hay sangrado de la vena porta, devuelva suavemente el intestino a la cavidad peritoneal en su posición original.</li>
	<li>Dejar 0,5 ml de solución salina tibia (36-37 °C) en la cavidad abdominal antes del cierre. NOTA: La solución salina tibia facilita el movimiento y la recuperación del intestino después de la cirugía y previene la necrosis intestinal.</li>
	<li>Cierre la capa muscular con una sutura 5-0.</li>
	<li>Cierre la capa de la piel con una sutura 4-0.</li>
	<li>Coloque el ratón en una jaula limpia en una almohadilla térmica hasta que se recupere completamente de la anestesia.</li>
	<li>Continúe proporcionando un analgésico (por ejemplo, buprenorfina 0,1 mg/kg i.p.) cada 12 h y calor suplementario durante 48 h después de la cirugía. NOTA: El procedimiento de trasplante de islotes tarda aproximadamente 15-20 minutos en completarse.</li>
</ol>6. Tinción de H&E y fotografía de toda la sección del hígado
<ol><li>Perfusión hepática<ol>
<li>Ponga al ratón bajo anestesia como se describe anteriormente en la parte 3.1.</li>
		<li>Exponga cuidadosamente la vena porta y corte la vena cava inferior.</li>
		<li>Perfundir manualmente el hígado utilizando 20 ml de paraformaldehído al 10% a través de la vena porta durante aproximadamente 5 minutos, utilizando una jeringa de 20 ml con aguja 25G18. NOTA: La perfusión hepática puede eliminar la sangre del tejido hepático y mejorar la fijación hepática sin alterar los injertos de los islotes.</li>
		<li>Diseccionar el hígado entero perfundido de otros órganos.</li>
		<li>Fijar el tejido hepático perfundido en paraformaldehído al 10% durante 24 h.</li>
		<li>Incrustar el tejido en parafina.</li>
		<li>Corte secciones de tejido de 5 μm de espesor cada una y colóquelas en un portaobjetos de vidrio para mancharlas.</li>
		<li>Realizar tinción de H&E, insulina, fibrina y neutrófilos polimorfonucleares (PMN) utilizando métodos estándar15,16.</li>
		<li>Escanee toda la sección del hígado bajo un microscopio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+the+art+of+islet+transplantation+and+cell+therapy+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetology%22%5BJournal%5D)">The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes.</a> Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).</li>
<li>Ballinger, W. F., Lacy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+intact+pancreatic+islets+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of intact pancreatic islets in rats.</a> Surgery. 72 (2), 175-186 (1972).</li>
<li>Wright, J. R., Hauptfeld, V., Lacy, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Ia+antigen+expression+on+murine+islet+parenchymal+cells+does+not+diminish+islet+allograft+survival%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Induction of Ia antigen expression on murine islet parenchymal cells does not diminish islet allograft survival.</a> American Journal of Pathology. 134 (2), 237-242 (1989).</li>
<li>Toyofuku, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+T-cells+participate+in+rejection+of+islet+allografts+in+the+liver+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Natural killer T-cells participate in rejection of islet allografts in the liver of mice.</a> Diabetes. 55 (1), 34-39 (2006).</li>
<li>Goss, J. A., Nakafusa, Y., Finke, E. H., Flye, M. W., Lacy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tolerance+to+islet+xenografts+in+a+concordant+rat-to-mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Induction of tolerance to islet xenografts in a concordant rat-to-mouse model.</a> Diabetes. 43 (1), 16-23 (1994).</li>
<li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+studying+intrahepatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A mouse model for studying intrahepatic islet transplantation.</a> Transplantation. 78 (4), 615-618 (2004).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-1+antitrypsin+enhances+islet+engraftment+by+suppression+of+instant+blood-mediated+inflammatory+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Alpha-1 antitrypsin enhances islet engraftment by suppression of instant blood-mediated inflammatory reaction.</a> Diabetes. 66 (4), 970-980 (2017).</li>
<li>Gou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-1+antitrypsin+suppresses+macrophage+activation+and+promotes+islet+graft+survival+after+intrahepatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Alpha-1 antitrypsin suppresses macrophage activation and promotes islet graft survival after intrahepatic islet transplantation.</a> American Journal of Transplantation. , (2020).</li>
<li>Contreras, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+protein+C+preserves+functional+islet+mass+after+intraportal+transplantation%3A+A+novel+link+between+endothelial+cell+activation%2C+thrombosis%2C+inflammation%2C+and+islet+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Activated protein C preserves functional islet mass after intraportal transplantation: A novel link between endothelial cell activation, thrombosis, inflammation, and islet cell death.</a> Diabetes. 53 (11), 2804-2814 (2004).</li>
<li>Moberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tissue+factor+by+pancreatic+islet+cells+as+a+trigger+of+detrimental+thrombotic+reactions+in+clinical+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation.</a> Lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).</li>
<li>Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+islet+transplant+in+the+mouse%3A+functional+and+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization.</a> Cell Transplantation. 17 (12), 1361-1370 (2008).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+treatment+with+carbon+monoxide+can+yield+islet+allograft+survival+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Donor treatment with carbon monoxide can yield islet allograft survival and tolerance.</a> Diabetes. 54 (5), 1400-1406 (2005).</li>
<li>Desai, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+liver+histopathology+on+islet+cell+engraftment+in+the+model+mimicking+autologous+islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Effect of liver histopathology on islet cell engraftment in the model mimicking autologous islet cell transplantation.</a> Islets. 9 (6), 140-149 (2017).</li>
<li>Cui, W., Angsana, J., Wen, J., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+formulations+of+thrombomodulin+increase+engraftment+after+intraportal+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Liposomal formulations of thrombomodulin increase engraftment after intraportal islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 19 (11), 1359-1367 (2010).</li>
<li>Cui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin+improves+early+outcomes+after+intraportal+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).</li>
<li>Proto, C., Grasso, G., Fassio, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatoparenchymal+clearance+of+indocyanine+green+in+infectious+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Giornale+di+Malattie+Infettive+e+Parassitarie%22%5BJournal%5D)">Hepatoparenchymal clearance of indocyanine green in infectious hepatitis.</a> Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 20 (9), 845-851 (1968).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56993(2018).</li>
<li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraportal+transplantation+of+pancreatic+islets+in+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559(2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+mesenchymal+stem+cell+and+islet+cotransplantation%3A+Safety+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Autologous mesenchymal stem cell and islet cotransplantation: Safety and efficacy.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (1), 11-19 (2018).</li>
</ol>

Todos los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

En este estudio, se han demostrado dos procedimientos mejorados que pueden prevenir el sangrado y pueden reducir la mortalidad del ratón durante el IIT del ratón. Este estudio permite a los investigadores visualizar el modelo de trasplante de islotes que es único en el estudio de la respuesta inflamatoria instantánea mediada por la sangre después del trasplante. El modelo IIT es un modelo distintivo para estudiar la supervivencia de las células de los islotes y las lesiones isquémicas hepáticas en respuesta al trasplante...

El trasplante intraportal de islotes (IIT) a través de la vena porta es el método más utilizado para el trasplante de islotes humanos en entornos clínicos. El modelo IIT de ratón ofrece una gran oportunidad para estudiar el trasplante de islotes y probar enfoques intervencionistas prometedores que pueden mejorar la eficacia del trasplante de islotes1. El IIT fue descrito por primera vez en la década de 1970 y utilizado por varios grupos1,2,3,4,5. Recuperó popularidad después del avance en el trasplante de islotes humanos en el año 20006,7. Sin embargo, la mayoría de los estudios de trasplante de islotes utilizaron la cápsula renal como un sitio preferido para el trasplante experimental de islotes debido a su fácil éxito. Por el contrario, el IIT es más desafiante técnicamente y se utiliza con menos frecuencia para los estudios de trasplante de islotes8,9. Sin embargo, a diferencia del IIT, los islotes trasplantados debajo de la cápsula renal no sufren la reacción inflamatoria inmediata mediada por la sangre caracterizada por trombosis, inflamación e isquemia del tejido hepático y, por lo tanto, tienen una mejor función que los islotes trasplantados al hígado. El modelo de cápsula renal, por lo tanto, puede no imitar completamente las tensiones encontradas por los islotes en el trasplante de islotes humanos10,11,12.
Una de las principales complicaciones de la IIT en ratones es el sangrado del lugar de inyección después del trasplante, lo que podría causar un 10-30% de mortalidad entre diferentes cepas de ratón12. En este documento, se han desarrollado dos enfoques refinados para detener el sangrado de manera más rápida y segura y para reducir la mortalidad del ratón después de un IIT. La demostración visual de estos detalles refinados ayudará a los investigadores a identificar los pasos clave de este procedimiento técnicamente desafiante. Además, la ubicación de los injertos de islotes en el hígado del receptor se determinó mediante el examen histológico del tejido hepático teñido de hematoxilina y eosina (H&E) (sección completa) que lleva islotes trasplantados.

<table><tbody><tr><td>10% Formalina tamponada neutra v/v</td><td>Fisher Scientific</td><td>23426796</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Jeringa con aguja</td><td>AHS</td><td>AH01T</td><td></td></tr><tr><td>20 mL Jeringa</td><td>BD</td><td>301031</td><td></td></tr><tr><td>25G x 5/8" agujas hipodérmicas</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación con alcohol, estériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Anestesia animal sistema</td><td>VetEquip, Inc.</td><td></td><td></td>901806</tr><tr><td>Clorhidrato de buprenorfina, inyección</td><td>Par Sterile Products, LLC</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Corning</td><td>15110CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, absoluto (200 pruebas), grado de biología molecular</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>BP2818500</tr><tr><td>Tijeras de micro disección extra finas 4" rectas y afiladas</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle&nbsp; Medidor de glucosa</td><td>Abbott</td><td>Lite</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle Tiras reactivas de glucosa en sangre</td><td>Abbott</td><td>Lite</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam (esponja de gelatina absorbible, USP)</td><td>Pharmacia & Upjohn Company</td><td>34201</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Graefe 4" punta extra delicada</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5136</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Amazon</td><td>B07HMKMBKM</td><td></td></tr><tr><td>Hegar-Baumgartner Portaagujas 5.25"</td><td>Roboz Instrumento Quirúrgico Co.</td><td>RS-7850</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina con aguja de calibre 27</td><td>BD</td><td>879588</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación de yodo</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027048</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal Cuidados Críticos</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina (P/S)</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de polipropileno 4-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8683</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de polipropileno 5-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8661</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio, solución intravenosa al 0,9%</td><td>VWR</td><td>2B1322Q</td> Estreptozocina <td></td></tr><tr><td>(STZ)</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Paño quirúrgico, estéril</td><td>Med-Vet International</td><td>DR1826</td><td></td></tr><tr><td>Cassette de tejidos</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-272416</td><td></td></tr></tbody></table>

minimizar el sangrado de la vena porta posterior a la infusión durante el trasplante intrahepático de islotes en ratones

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Aunque el hígado se acepta actualmente como el sitio de trasplante primario para islotes humanos en entornos clínicos, los islotes se trasplantan debajo de la cápsula renal en la mayoría de los estudios preclínicos de trasplante de islotes en roedores. Este modelo se usa comúnmente porque el trasplante de islotes intrahepáticos murinos es técnicamente desafiante, y un alto porcentaje de ratones podría morir por complicaciones quirúrgicas, especialmente sangrado del sitio de inyección después del trasplante. En este estudio, se demuestran dos procedimientos que pueden minimizar la incidencia de sangrado de la vena porta después de la infusión. El primer método aplica una esponja de gelatina hemostática absorbible al sitio de inyección, y el segundo método consiste en penetrar la aguja de inyección de islotes a través del tejido graso primero y luego en la vena porta mediante el uso del tejido graso como una barrera física para detener el sangrado. Ambos métodos podrían prevenir eficazmente la muerte del ratón inducida por sangrado. Se presentó toda la sección hepática que muestra la distribución de los islotes y la evidencia de trombosis de los islotes después del trasplante, una característica típica del trasplante intrahepático de los islotes. Estos protocolos mejorados refinan los procedimientos de trasplante intrahepático de islotes y pueden ayudar a los laboratorios a establecer el procedimiento para estudiar la supervivencia y la función de los islotes en entornos preclínicos.

Se realizaron trasplantes singénicos y xenogénicos de islotes a través de la vena porta. La función del injerto de islotes se observó de manera dependiente de la dosis en ambos modelos de trasplante de islotes. En el modelo de trasplante de islotes singénicos utilizando ratones C57BL/6, el trasplante de 250 islotes condujo a normoglucemia transitoria antes de que los ratones volvieran a la hiperglucemia. Los ratones que recibieron 500 islotes alcanzaron y mantuvieron la normoglucemia más allá de los 30 días posteriores a...

Aquí presentamos procedimientos quirúrgicos refinados para realizar con éxito el trasplante intraportal de islotes, un procedimiento quirúrgico clínicamente relevante pero técnicamente desafiante, en ratones.

Minimizar el sangrado de la vena porta posterior a la infusión durante el trasplante intrahepático de islotes en ratones

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

El hígado es un sitio primario para el trasplante en el entorno clínico de los islotes humanos. El trasplante intrahepático de islotes de ratón es técnicamente desafiante, y un alto porcentaje de ratones podría morir por complicaciones quirúrgicas, especialmente sangrado. En este estudio, los dos métodos que mostramos podrían prevenir eficazmente la muerte del ratón inducida por sangrado.Nuestro método se puede aplicar a la investigación en cáncer de hígado y otras enfermedades hepáticas al permitir la inyección de células cancerosas, células madre mesenquimales y hepatocitos directamente al hígado. Para comenzar, separe una cultura de islotes humanos con un rascado suave. Use una jeringa de 1 centímetro cúbico para recoger de 300 a 350 islotes en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mililitros en hielo.Cuando se hayan recogido todos los islotes, centrífugue los tubos durante 10 segundos para sedimentar las células. Deseche todos menos un pequeño volumen de sobrenadante para evitar la pérdida de pellets y resuspenda los islotes en 200 microlitros HBSS que contienen 5% de BSA. Cargue los islotes resuspendidos en una jeringa de insulina de 5 mililitros y gire el extremo de la aguja de la jeringa durante 1 minuto para dejar que los islotes se asienten en el émbolo.Presione el émbolo para eliminar cualquier burbuja, manteniendo aproximadamente de 100 a 150 microlitros de solución en la jeringa e invierta la jeringa con un golpeteo suave para distribuir uniformemente los islotes. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, aplique ungüento en los ojos para evitar que se sequen. Afeitar el abdomen del ratón anestesiado para retirar el pelaje y desinfectar la zona quirúrgica con tres toallitas alternas de 2% de yodo y 75% de alcohol.A continuación, haga una incisión de 1 a 1,5 centímetros en el abdomen y abra la cavidad peritoneal. Coloque un trozo estéril de gasa alrededor de la incisión y use fórceps o puntas de algodón para transferir suavemente el intestino a la gasa. Luego cubren el intestino con un trozo de gasa empapada en solución salina y exponen la vena porta.Para detener el sangrado inducido por la transferencia de islotes usando espuma de gel, sostenga la aguja con el bisel hacia abajo y coloque la punta de la aguja con la abertura paralela a la pared de la vena porta antes de insertar la aguja en la vena porta. Retraiga el émbolo para extraer de 20 a 50 microlitros de sangre en la jeringa para mezclarlos con los islotes antes de infundir los islotes en la vena porta mientras presiona y retrae repetidamente el émbolo. Cuando se hayan entregado todos los islotes, coloque una pieza de espuma de gel de aproximadamente 5 por 5 centímetros sobre el sitio de inyección.Use una punta de algodón para presionar la espuma de gel hacia abajo mientras retira la aguja de la vena porta. Mantenga el gel en su lugar durante aproximadamente 2 minutos, enrollando la espuma de gel para asegurarse de que cubra la vena porta. Una vez que se detiene el sangrado, devuelva suavemente el intestino a la cavidad peritoneal en la posición original e inyecte 500 microlitros de solución salina tibia en la cavidad abdominal.Use suturas para cerrar las capas musculares y de la piel. Luego coloque el ratón en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica con monitoreo hasta la recuperación completa de la anestesia, administrando analgesia cada 12 horas y calentando durante 48 horas. Para detener el sangrado inducido por la transferencia de islotes usando una almohadilla de grasa, después de exponer la vena porta como se ha demostrado, use dos puntas de algodón para sostener la vena expuesta en los lados izquierdo y derecho y ubicar la almohadilla de tejido graso entre el duodeno y la vena porta.Penetre la almohadilla de grasa con la punta de la aguja antes de insertarla en la vena porta. Infundir los islotes en la vena porta como se ha demostrado. Cuando se hayan entregado todos los islotes, presione el tejido graso con una punta de algodón durante aproximadamente 1 minuto mientras retira la aguja de la vena.Luego devuelva el intestino a la cavidad abdominal y realice el resto de los procedimientos de atención postquirúrgica como se ha demostrado. Los efectos del trasplante de islotes dependen de la dosis, ya que la glucemia normal se observa 30 días después del trasplante de islotes singénicos cuando se transfieren 500 islotes, pero solo se observa normoglucemia transitoria cuando se administran 250 islotes, y los ratones vuelven a la hiperglucemia a los 10 días después del trasplante. Se observa un aumento del peso corporal en ambos grupos y respuestas idénticas observadas cuando los islotes humanos se trasplantan a ratones diabéticos NOD-SCID, con normoglucemia observada cuando se trasplantan un mayor número de equivalentes de islotes, pero no un número menor.La mayoría de los ratones que tienen sangrado después de la transferencia mueren después de la cirugía, mientras que los ratones sin sangrado sobreviven. A los 28 días después del trasplante, la tinción de insulina revela una distribución uniforme del islote humano en todo el hígado, principalmente cerca de los vasos sanguíneos. Además de la insulina, la fibrina y la filtración de células polimorfonucleares también se observan dentro de los islotes humanos trasplantados.El trasplante intrahepático de islotes generará un gran orificio en la vena porta que puede causar sangrado. El uso de nuestros dos procedimientos mejorados puede prevenir el sangrado y reducir la mortalidad después del trasplante de islotes. El modelo de trasplante intraportal de islotes puede imitar el trasplante clínico de islotes humanos.Nuestros procedimientos refinados pueden conducir a tasas de supervivencia más altas para los receptores, lo que permite un mayor estudio de la función de los islotes después del trasplante.

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Investigación

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Medicina

Este video describe un procedimiento quirúrgico para administrar células tumorales mamarias al hígado murino mediante inyección en la vena porta. Este modelo permite la investigación de estadios tardíos de la metástasis hepática.

Inyección de vena porta: un método para estudiar la metástasis del cáncer en el hígado

En este video, describimos un procedimiento para infundir células de los islotes pancreáticos en la vena porta hepática, seguido de la aplicación de espuma de gel para prevenir con éxito el sangrado. La hemorragia postoperatoria es una causa frecuente de alta mortalidad durante el trasplante de islotes.

Modelo murino de trasplante de islotes: un método quirúrgico para infundir islotes pancreáticos en la vena porta y prevención de la hemorragia postoperatoria

Las herramientas utilizadas para visualizar la regeneración vascular requieren métodos para contrastar los árboles vasculares. Esta película demostró una delicada técnica de inyección utilizada para lograr un contraste óptimo de los árboles vasculares e ilustra los beneficios potenciales resultantes de un análisis detallado de la muestra resultante utilizando μCT y secciones histológicas seriadas.

La visualización del parénquima vascular y la regeneración después del 70% hepatectomía parcial en ratones normales

Este protocolo demuestra el aislamiento de los islotes murinos y la siembra en un andamio decelularizado. Los islotes soportados por el andamio fueron trasplantados en la almohadilla de grasa epididimal de ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ). Los islotes sobrevivieron en el sitio del trasplante e invirtieron la condición hiperglucémica.

Transplante de islotes en el cojín de grasa epididimal de ratones diabéticos

Se introduce un método para el trasplante omental de islotes en un ratón. Los islotes aislados se mezclan con hidrogel y la mezcla se coloca en la bolsa omental de un ratón diabético. Luego, se controla la glucosa en la sangre, y se realiza el análisis inmuno-histoquímico.

Un método para el trasplante de islotes pancreáticos para el epiplón en ratón

Trasplante de islotes pancreáticos es una manera de lograr normoglycemia en diabetes tipo 1. Este artículo se centra en la técnica de trasplante vía intraportal para mantener niveles normales de glucosa en ratones diabéticos.

Intraportal trasplante de islotes pancreáticos en modelo murino

En este protocolo, se describe un método de aislamiento de islotes murinos y trasplante en el tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal. Los islotes murinos sinémicos aislados se trasplantan en un receptor murino utilizando un hidrogel de membrana del sótano. Se controla el nivel de glucosa en sangre de los receptores y se realiza un análisis histológico de los injertos de islos.

Modelo de trasplante de tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal (ISWAT) de islotes murinos

El objetivo de este protocolo es monitorear continuamente la dinámica del proceso de injerto de islotes pancreáticos humanos y el huésped contribuyente frente a las células del donante. Esto se logra trasplantando islotes humanos en la cámara anterior del ojo (ACE) de un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receptor del ratón seguido de imágenes repetidas de 2 fotones.

Longitudinal en Imágenes Vivos y Cuantificación del Injerto de Islotes Pancreáticos Humanos y Células Huésped Contribuyentes en la Cámara Ocular Anterior

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Ex Vivo Perfusión hepática a través de la vena porta en el ratón

El aclaramiento hepático de insulina es fundamental para regular la homeostasis de la glucosa. Este artículo describe un procedimiento de perfusión hepática fácil de usar para evaluar directamente la tasa de aclaramiento de insulina hepática in situ en ratones.

Evaluación del aclaramiento de insulina en ratones mediante perfusión hepática in situ

Aquí, proporcionamos detalles sobre la realización de la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) a través de la perfusión a través de la vasculatura de los ratones con un páncreas intacto como una técnica adicional para evaluar la función pancreática endocrina con reducción de posibles factores de confusión.

Secreción de insulina estimulada por glucosa a través de la perfusión a través de la vasculatura de ratones con un páncreas intacto

Aprende técnicas quirúrgicas refinadas para el trasplante intraportal de islotes en ratones que previenen el sangrado y reducen la mortalidad. Estos métodos mejoran la seguridad y facilitan la investigación en enfermedades hepáticas.

Minimizar el sangrado de la vena porta posterior a la infusión durante el trasplante intrahepático de islotes en ratones

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