Obtención de imágenes y cuantificación de dendritas neuronales intactas a través de CLARITY Tissue Clearing
20 de abril de 2021
La morfología dendrítica neuronal a menudo subyace a la función. De hecho, muchos procesos de enfermedad que afectan el desarrollo de las neuronas se manifiestan con un fenotipo morfológico. Este protocolo describe un método simple y poderoso para analizar cenadores dendríticos intactos y sus espinas asociadas.
Este protocolo permitirá a los investigadores responder preguntas importantes sobre los patrones neuronales de conectividad y organización espacial que subyacen a la función dentro de un circuito. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización de morfologías neuronales ubicadas en lo profundo del tejido tridimensional intacto. Este método es sencillo y, por lo tanto, fácilmente reproducible.
Los experimentadores primerizos deben sentirse cómodos realizando esta técnica. Es imperativo tener una muestra de tejido clara para obtener datos de alta calidad. La demostración visual de la claridad adecuada de los tejidos y las técnicas de limpieza permitirán resultados fácilmente reproducibles.
Para comenzar, coloque el tejido cerebral sumergido en hidrogel en una incubadora de vacío durante tres horas a 37 grados centígrados con menos 90 kilopascales de vacío. Deje la parte superior del tubo desenroscado para permitir que el vacío se forme correctamente. Lave el pañuelo con PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente con un suave agitación.
Coloque la muestra de tejido polimerizado en la cámara de electroforesis, haciendo un seguimiento de la orientación del tejido dentro de la cámara. Llene la cámara y el depósito con el tampón SDS de electroforesis suministrado. Ejecute la muestra a 70 voltios, un amperio y 35 grados Celsius con corriente constante durante aproximadamente dos horas por mililitro de tejido.
Revise la muestra periódicamente para obtener suficiente limpieza del tejido cerebral retirándolo de la cámara y reemplazándolo en la misma orientación. Después de que la muestra haya terminado de limpiarse, lávela en PBS durante la noche a temperatura ambiente, reemplazando el PBS con PBS fresco con la mayor frecuencia posible. Después del lavado final en PBS, lave el pañuelo durante cinco minutos en agua desionizada a temperatura ambiente tres veces.
El tejido se volverá opaco y puede expandirse. Incubar el tejido en la solución de coincidencia de índice de refracción durante al menos cuatro horas a temperatura ambiente. Durante la incubación, construya una cámara de alojamiento adecuada para obtener imágenes de la muestra.
Comience usando un portaobjetos de vidrio como base para el montaje, luego colóquelos de goma o plástico y asegúrelos con súper pegamento, asegurándose de que no haya agujeros. Coloque el tejido transparente en la cámara de montaje precargada con una solución de coincidencia de índice de refracción. Monte el pañuelo de forma segura colocando una cubierta de vidrio en la parte superior y sellándolo con esmalte de uñas.
Imagine este tejido agregando una gota de solución de montaje de coincidencia de índice de refracción directamente sobre el vidrio. Para construir una cámara de imágenes de tejidos grandes para tejidos con más de cinco milímetros de grosor, use un plato de vidrio de 10 centímetros con una pared alta. Coloque un tubo cónico de 50 mililitros en el centro, asegurándose de que el diámetro del tubo sea lo suficientemente grande como para aceptar el barril de la lente objetivo utilizada.
Haga 3% de agarosa en agua y viértala en el espacio entre el plato de vidrio y el tubo cónico, luego deje que se enfríe durante una hora. Esto formará un anillo de agarosa sólida. Adhiera de forma segura el tejido a la parte inferior de la cámara con súper pegamento y llene la cámara con una solución de coincidencia de índice de refracción, que puede comenzar a polimerizarse a menos que se conserve del aire y se almacene a cuatro grados centígrados.
Adquirir la imagen utilizando un microscopio confocal. Encienda todos los equipos de imágenes relevantes. Coloque la muestra en el escenario.
Aborde cuidadosamente los medios de inmersión con el objetivo y forme una columna continua de medios. Usando epifluorescencia, encuentre un campo de imágenes apropiado. Comience por establecer la resolución y la velocidad de escaneo.
Si se obtienen imágenes con un microscopio confocal, cierre completamente el agujero de alfiler para obtener la sección óptica más pequeña y, por lo tanto, la mejor resolución Z. Aumente gradualmente la potencia del láser o la ganancia del sensor hasta obtener una imagen adecuada con una alta relación señal-ruido. Si utiliza imágenes estándar de dos colores EGFP o tdTomato, establezca la configuración de recolección de luz.
Establezca los parámetros de la pila Z en función de los puntos de inicio y final observados del tejido. Establezca el tamaño del paso en función de la resolución Z deseada. Los tamaños de paso más pequeños producirán una mayor resolución Z, pero pueden conducir al blanqueamiento de la muestra.
Cuando esté satisfecho con la configuración de adquisición de imágenes, adquiera la imagen. Asegúrese de que la imagen tenga una alta relación señal-ruido y muestre límites distintos de las estructuras. Después de la adquisición de la imagen, la morfología celular representativa se analizó utilizando estadísticas integradas y clasificando scripts dentro del software de análisis.
Los datos recopilados reflejan que la Neurona 2 tiene una estructura más grande que la dendrítica con una mayor densidad de espinas en comparación con la Neurona 1. Para corroborar este resultado, se realizó un análisis estándar de Scholl, que afirma que la Neurona 2 es más compleja dendríricamente que la Neurona 1 como se denota por el mayor número de intersecciones de Scholl a 50 a 100 micrómetros del soma. La neurona 1 contiene una mayor proporción de espinas con formas más parecidas a filopodias y es un subtipo de columna inmaduro.
Las espinas con cabezas definidas, llamadas espinas de hongo, probablemente contienen sinapsis más desarrolladas y maduras. Por lo tanto, la neurona 2 es más madura con una mayor densidad de espinas maduras. Después de la limpieza, los trozos de tejido se pueden teñir utilizando inmunohistoquímica tradicional.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este artículo presenta un protocolo detallado para procesar, visualizar y analizar cortes gruesos de tejido neural marcado mediante la técnica de clarificación tisular CLARITY, microscopía confocal y análisis de imágenes. El método permite la obtención de imágenes de alta resolución de las morfologías neuronales en profundidad dentro de tejido cerebral tridimensional intacto, facilitando el estudio de la conectividad neuronal y la organización de subestructuras tanto en estados sanos como patológicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Tecnología de imagen
- Neuroanatomía
Antecedentes
- La actividad cerebral está determinada por la conectividad y la morfología neuronales.
- Los avances en imagenología y en técnicas de aclarado de tejidos han mejorado la capacidad de estudiar cortes cerebrales gruesos con alta resolución.
- CLARITY permite la visualización de estructuras neuronales profundas dentro del tejido.
- El software de procesamiento de imágenes permite un análisis rápido de grandes conjuntos de datos.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo reproducible para la clarificación, imagen y análisis de cortes gruesos de tejido neural.
- Facilitar el estudio de los patrones de conectividad neuronal y las morfologías.
- Permitir la comparación de tejido cerebral sano y enfermo a nivel morfológico.
Métodos Utilizados
- Inclusión en hidrogel e incubación bajo vacío de tejido cerebral.
- Clarificación del tejido mediante electroforesis usando tampón SDS.
- Ajuste del índice de refracción y montaje para la obtención de imágenes.
- Microscopía confocal para imágenes de alta resolución.
- Análisis de imágenes, incluyendo análisis de Scholl y clasificación de espinas.
Resultados principales
- El protocolo permite una visualización clara de las morfologías neuronales profundas dentro del tejido.
- La neurona 2 exhibió una estructura dendrítica más compleja y una mayor densidad de espinas maduras (en forma de hongo) en comparación con la neurona 1.
- La neurona 1 presentó más espinas inmaduras similares a filopodios.
- El análisis de Scholl confirmó una mayor complejidad dendrítica en la neurona 2.
- El método es sencillo y reproducible para usuarios principiantes.
Conclusiones
- Este protocolo permite un análisis morfológico detallado de neuronas en tejido cerebral grueso.
- Apoya estudios sobre la conectividad y maduración neuronales.
- El enfoque es accesible y puede ser adoptado por investigadores nuevos en técnicas de clarificación de tejidos y microscopía.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El imagenológico de alta resolución de dendritas neuronales intactas mediante la técnica de CLARITY para la transparencia de tejidos permite un análisis morfológico detallado, fundamental para el descubrimiento temprano de fármacos en neurociencia. Este enfoque respalda una confianza predictiva en la validación de dianas al revelar patrones de conectividad y cambios en subestructuras relevantes para los modelos de enfermedad. La integración de protocolos de imagenología 3D reproducibles fortalece la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la investigación preclínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación de la conectividad neuronal y la organización espacial en tejido intacto.
- Apoya la validación funcional de objetivos mediante la cuantificación de la complejidad dendrítica y la maduración de las espinas.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la visualización directa de cambios neuronales relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara sistemas de tejido neural 3D validados para ensayos posteriores de cribado de compuestos.
- Normaliza los protocolos de imagen y análisis para obtener resultados cuantitativos reproducibles.
- Posibilita la evaluación escalable de la morfología neuronal para determinar la idoneidad en cribados.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Correlaciona lecturas morfológicas con biomarcadores relevantes para la enfermedad en modelos preclínicos.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento mediante imágenes hasta la validación preclínica de puntos finales neuronales.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en datos estructurales cuantitativos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en el continuo del descubrimiento en neurociencia, conectando la validación temprana de objetivos, la selección fenotípica y la evaluación de modelos preclínicos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la visualización de redes neuronales intactas.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles de imágenes para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Ofrece mediciones estadísticas como el análisis de Scholl y la clasificación de espinas para la comparación de condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta los cambios morfológicos con modelos de enfermedades y estrategias de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo estandarizado y reutilizable de imágenes y análisis para equipos de I+D en neurociencia.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos neuronales.
- Valor operativo: Promueve la estandarización, la reproducibilidad y la escalabilidad en la obtención de imágenes de tejidos tridimensionales.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al proporcionar puntos finales morfológicos robustos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos en neurociencia.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la clarificación de tejidos, microscopía confocal y software de análisis de imágenes.
- Necesita acceso a incubadoras de vacío, cámaras de electroforesis y plataformas de imagen de alta resolución.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de preparación de muestras y adquisición de imágenes.
- Adaptable a diversos modelos de tejido neural y estrategias de marcado.
- Depende de lograr una claridad tisular y una relación señal-ruido suficientes para una cuantificación confiable.
