Ensayos de laboratorio en jaulas pequeñas de mosquitos anofelinos genéticamente modificados

El protocolo descrito aquí es apropiado para evaluar el rendimiento de los mosquitos transgénicos y las comparaciones con contrapartes de tipo silvestre en un pequeño ensayo de jaula de laboratorio. Los ensayos en jaulas pequeñas son importantes para proporcionar valores empíricos que ayuden a completar la implementación de nuevas tecnologías para la eliminación de la malaria. Los ensayos en jaulas se pueden adaptar a otros diseños experimentales y son adecuados para evaluar la dinámica de una amenaza de un transgen de deseo.

Tras la introducción individuos transgénicos. Comience la fase inicial del experimento instalando tres jaulas de 0,216 metros cúbicos por triplicado. Y agregando 60 larvas de tipo salvaje de segundo enstar a cada jaula durante tres semanas sucesivas.

Cada semana, proporcione a las hembras adultas en cada jaula ratones anestesiados como fuente de comida de sangre. Y un recipiente de oviposición tres días después de la comida de sangre. Eclosionar huevos de cada jaula semanalmente.

De la cuarta a la octava semana, seleccione 60 larvas L2 de segunda entrada al azar para regresar a sus respectivas jaulas. En la semana nueve, asigne aleatoriamente un conjunto de jaulas triplicadas como controles y un conjunto para cada relación de liberación deseada. Agregue 60 pupas de tipo silvestre con 30 machos y 30 hembras a las jaulas de control semanalmente.

Mantenga una proporción de uno a uno en cada jaula respectiva agregando semanalmente 30 pupas machos transgénicos junto con 60 pupas de tipo silvestre. Para una proporción de uno a 0.1, agregue 300 pupas machos transgénicos semanalmente en cada jaula respectiva junto con 60 pupas de tipo silvestre. Repita la adición de pupas de mosquitos en la jaula, proporcionando harina de sangre y huevos para incubar cada semana.

Seleccione un total de 300 larvas de cada jaula al azar para su detección. Examinar las larvas bajo un microscopio estereoscópico con filtros de fluorescencia para la expresión del marcador fluorescente dominante en las etapas larvaria y pupal. Puntúa el sexo de las pupas resultantes.

En el experimento de impulsor genético, emplee una estrategia de barrera manteniendo a los mosquitos en un insectario seguro y siguiendo los procedimientos operativos estándar con monitoreo regular. Prepare una jaula configurada con dos juegos de jaulas triplicadas de 0.216 metros cúbicos para cada proporción deseada de liberación de machos transgénicos a salvajes. Para lograr una proporción de liberación masculina de uno a uno, agregue 120 machos transgénicos, 120 machos y hembras de tipo salvaje en la etapa de pupa a cada jaula replicada.

Proporcione una comida de sangre con ratones anestesiados a las hembras de cuatro a siete días de edad en cada jaula. Después de incubar los huevos en una bandeja larvaria, seleccione aproximadamente 240 primeras larvas instar L1 al azar de cada jaula y críelas a pupas antes de regresar a sus respectivas jaulas. Seleccione y examine las larvas para detectar marcadores oculares y fenotipo sexual como se describió anteriormente.

Armar una configuración de jaula de jaulas triplicadas de 0.005 metros cúbicos con un número igual de machos y hembras para cada proporción de liberación específica de transgénicos a machos de tipo silvestre. Usando un aparato de alimentación artificial, proporcione comidas de sangre a las hembras de cuatro a siete días de edad en cada jaula en dos días consecutivos. Tres días después de la segunda comida de sangre, agregue un recipiente de oviposición y retire los recipientes después de tres días.

Después de anotar a todos los muertos y adultos vivos que permanecen en la jaula por sexo, guárdelos a menos 80 grados centígrados para el análisis molecular. Eclosionar huevos y correr selecciona 200 larvas L1 y deja las larvas a un lado para poblar nuevas jaulas para la próxima generación. Luego seleccione al azar otras 500 larvas de cada jaula reservada para la detección.

Criar las 200 larvas seleccionadas a pupa y 500 larvas a la etapa L4 instar. Devuelva la pupa de 200 bandejas para poblar la nueva jaula. Criba las larvas seleccionadas al azar para el marcador ocular y el fenotipo sexual como antes.

En el análisis representativo, se muestra la dinámica fenotipo esperada de las réplicas de mejor rendimiento para los diferentes protocolos de ensayos de jaulas de reemplazo poblacional. Los resultados mostraron el aumento lineal de la proporción de larvas con fenotipo de marcador DsRed durante siete generaciones. La liberación uno a uno sin unidad alcanzó poco más del 80% de introducción de transgenes en siete generaciones.

Los protocolos de impulsor genético lograron esto en tres o cuatro generaciones. Validando así que una sola liberación de un sistema de impulsor genético puede ser más eficiente para la introducción de transgenes. Al final de la observación, la propagación del transgén había alcanzado una introducción casi completa en los sistemas de impulsores genéticos.

Los parámetros importantes, como la relación de liberación entre la estructura de edad de la población, el tamaño de la jaula y otros, variarán según el propósito del experimento y los objetivos específicos. Se pueden realizar experimentos para evaluar parámetros de aptitud física como la fertilidad y la fecundidad. Se pueden utilizar más datos empíricos de los ensayos en jaulas para parametrizar modelos matemáticos de la dinámica de la población.