Prueba de activación de basófilos para el diagnóstico de alergia

La prueba de activación de basófilos es una prueba diagnóstica in vitro complementaria para la evaluación de reacciones alérgicas mediadas por IgE que han demostrado ser útiles para reacciones inducidas por medicamentos, alimentos o inhalantes, así como en algunas formas de urticaria crónica. Esta prueba se basa en determinar la respuesta basófila a la activación de IgE de reticulación de un alérgeno o fármaco mediante la medición de marcadores de activación mediante citometría de flujo. La prueba de activación de basófilos puede ser una herramienta útil y complementaria para evitar pruebas de provocación controladas para confirmar el diagnóstico de alergia, especialmente en sujetos que experimentan reacciones graves potencialmente mortales.

Además, esta prueba tiene la ventaja de poder analizar la respuesta frente a cualquier fármaco o alérgeno frente a otros métodos in vitro que solo están disponibles para unos pocos fármacos y alérgenos. Las principales limitaciones de la prueba están relacionadas con la sensibilidad no óptima, especialmente en la alergia a medicamentos. La necesidad de realizar la prueba no más de 24 horas después de la extracción de la muestra y la falta de estandarización entre laboratorios y algoritmos de diagnóstico.

Comience recolectando sangre periférica en tubos heparinizados de nueve mililitros y coloque las muestras en un rotor para mantenerlas a temperatura ambiente hasta que sean requeridas para el protocolo experimental. Etiquete dos tubos de citómetro de cinco mililitros cada uno para control negativo y control positivo. También etiquete un tubo para cada uno de los diferentes alérgenos o concentraciones de medicamentos que se están probando.

Luego coloque los tubos en una rejilla para que los tubos encajen perfectamente sin resbalar. Para el primer control positivo, prepare una solución de cuatro micromolares de N-formilmetionil-leucil-fenilalanina o fMLP en 0.05% PBS-T para confirmar la calidad de los basófilos. Para el segundo control positivo, prepare una solución anti-IgE de 0,05 miligramos por mililitro utilizando PBS-T.

Prepare la mezcla de tinción agregando un microlitro de anticuerpos CCR3-APC, CD203c-PE y CD63-FITC por cada 20 microlitros del tampón de estimulación. Luego agregue 23 microlitros de esta mezcla de tinción a cada tubo. Agregue 100 microlitros de PBS-T a los tubos de control negativo.

Agregue 100 microlitros de fMLP a uno de los tubos de control positivo y agregue 100 microlitros de anti-IgE al otro al resto de los tubos. Agregue 100 microlitros de las diferentes concentraciones de alérgenos o medicamentos e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de la incubación, agregue 100 microlitros de sangre a cada tubo suavemente para evitar la hemólisis.

Luego vórtice suavemente los tubos e incubarlos durante 25 minutos a 37 grados centígrados en el baño termostático con agitación media. Mantenga los tubos a cuatro grados centígrados durante al menos cinco minutos para detener la desgranulación. A cada tubo, agregue dos mililitros de tampón de lisis para lisar los eritrocitos.

Vortex cada tubo y luego incubar los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente. Centrifugar los tubos a 300 g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Luego vuelque la rejilla en el fregadero para decantar el sobrenadante mientras las células permanecen en el fondo de los tubos.

Agregue tres mililitros de PBS-T a cada tubo para lavar las células y hacer vórtice los tubos. Realice una segunda ronda de centrifugación utilizando el mismo conjunto de parámetros y decanta el sobrenadante volcando la rejilla en el fregadero. Luego mantenga las muestras a cuatro grados centígrados protegidas de la luz hasta la citometría de flujo.

Conecte el citómetro de flujo al software de la computadora y espere hasta que el citómetro esté listo. Cargue la plantilla y la configuración del instrumento como se describe en el texto manuscrito. Inicie el proceso de adquisición de muestras.

Para seleccionar basófilos activados, primero, compuerta los linfocitos del gráfico de dispersión lateral hacia adelante. Luego compuerta los basófilos de la población de linfocitos como células CCR3 + CD203c + y adquiere al menos 500 basófilos por tubo. Ajuste el umbral CD63 a aproximadamente 2.5% usando los tubos de control negativo y analice las muestras.

Las reacciones de hipersensibilidad dependientes de IgE se investigaron mediante la realización de una prueba de activación basófila, o BAT, utilizando alérgenos y fármacos. La sensibilidad basófila se analizó midiendo la reactividad a múltiples concentraciones decrecientes de alérgenos que ayudan a determinar la concentración alérgica que induce la respuesta de 50% basófilos o CE50. Primero, los linfocitos fueron cerrados desde el diagrama de dispersión lateral hacia adelante.

Luego, los basófilos fueron cerrados de la población de linfocitos como células CCR3 + CD203c +. Luego se utilizó una gráfica CCR3-CD63 para analizar la activación basófila utilizando CD63 como marcador de activación para dos fármacos y diferentes concentraciones de un alérgeno. La prueba se realiza con sangre entera fresca y debe realizarse no más de 24 horas después de la extracción de sangre.

El estímulo utilizado en la prueba no debe incluir ningún excipiente y se deben considerar las características químicas de los medicamentos. Otros métodos in vitro adicionales para el diagnóstico de reacciones alérgicas mediadas por IgE, o la determinación de sIgE, o la prueba de liberación de histamina.