Name: Ultracentrifugación de gradiente de densidad para investigar el reciclaje endocítico en células de mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Aprende a aislar endosomas de reciclaje mediante ultracentrifugación en gradiente de sacarosa en células de mamíferos. Este protocolo facilita el estudio del tráfico proteico endocítico en biología celular.

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Este trabajo fue apoyado por fondos del Consejo de Becas de Investigación de Hong Kong, el esquema de subvenciones directas de CUHK, el fondo de dotación de United College y el TUYF Charitable Trust. Las figuras de este trabajo fueron adaptadas de nuestra publicación anterior, "ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1" publicado en faseb Journal en octubre de 2020.

1. Cultivo y transfección de células de mamíferos
<ol><li>Placa 2 x 106 celdas en una placa de cultivo de 100 mm. Use cuatro platos para cada transfección. NOTA: El número de celdas necesarias puede variar para diferentes líneas celulares. La optimización puede ser necesaria antes de proceder al paso de aislamiento.</li>
	<li>Al día siguiente, transfecte las células con lipofectamina de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>2. Cosecha de células
<ol><li>Desechar el medio de cultivo 48 h después de la transfección.</li>
	<li>Lave las células con PBS helado (fosfatos de sodio de 10 mM, cloruro de potasio de 2,68 mM, cloruro de sodio de 140 mM) dos veces.</li>
	<li>Agregue 1 ml de PBS+ helado (PBS suplementado con cóctel inhibidor de la proteasa 0.5x y cóctel inhibidor de la fosfatasa 0.5x) a cada plato.</li>
	<li>Recoja las células con un raspador celular y transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 ml.</li>
	<li>Pellet las células por centrifugación utilizando un rotor de cucharón oscilante a 400 x g durante 5 min.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspenda el gránulo celular suavemente en 5 ml de tampón de homogeneización (HB; 250 mM de sacarosa, 3 mM de imidazol a pH 7.4, 1 mM de EDTA suplementado con 0.03 mM de cicloheximida, 1x cóctel inhibidor de la proteasa y 1x cóctel inhibidor de la fosfatasa).</li>
	<li>Recoger las células por centrifugación a 1.300 x g durante 10 min.</li>
	<li>Resuspend el pellet celular en 1 mL de HB.</li>
	<li>Homogeneizar las células con un homogeneizador Dounce para 15-20 golpes. NOTA: Se podrían utilizar otros métodos de homogeneización, por ejemplo, pasar la muestra a través de una jeringa. La eficiencia de homogeneización podría revelarse observando el homogeneizado bajo un microscopio de contraste de fase.</li>
	<li>Transfiera el homogeneizado a un tubo de centrifugación de 2 ml. NOTA: Cosechar 50 μL de homogeneizado con 12,5 μL de tampón de muestra 5x y etiquetarlo como lisado total.</li>
	<li>Añadir 0,7 ml de HB al homogeneizado.</li>
	<li>Girar el homogeneizado diluido a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C. NOTA: El pellet contiene núcleos y células ininterrumpidas.</li>
	<li>Recoja 1,5 ml del sobrenadante y repita el paso 2,12 una vez.</li>
	<li>Recolectar 1,4 ml del sobrenadante y etiquetarlo como sobrenadante postnuclear (SNP).</li>
</ol>3. Preparación de la columna de gradiente de densidad
<ol><li>Transfiera 1,2 ml de SNP a un tubo de ultracentrífuga.</li>
	<li>Añadir 1 ml de solución de sacarosa al 62% (2.351 M de sacarosa, 3 mM de imidazol a pH 7,4) a la muestra y mezclar bien mediante pipeteo suave. NOTA: La solución resultante es una solución de sacarosa al 40,6%.</li>
	<li>Agregue 3.3 ml de solución de sacarosa al 35% (1.177 M de sacarosa, 3 mM de imidazol a pH 7.4) cuidadosamente en la parte superior de la muestra.</li>
	<li>Agregue 2.2 ml de solución de sacarosa al 25% (0.806 M de sacarosa, 3 mM de imidazol a pH 7.4) cuidadosamente sobre la solución de sacarosa al 35%. NOTA: El índice de refracción de las soluciones de sacarosa al 62%, 40.6%, 35% y 25% a temperatura ambiente es de 1.44, 1.40, 1.39 y 1.37, respectivamente. Los índices de refracción de las soluciones de sacarosa se pudieron comprobar con un refractómetro para garantizar la precisión y la consistencia del experimento.</li>
	<li>Llene el tubo de ultracentrifugación con HB. NOTA: Almacene temporalmente la columna de gradiente de densidad preparada a 4 °C.</li>
</ol>4. Fraccionamiento y recuperación de la fracción que contiene endosomas de reciclaje
<ol><li>Centrifugar la columna a 210.000 x g durante 3 h a 4 °C.</li>
	<li>Recolecte 12 fracciones (1 ml cada una) cuidadosamente, comenzando desde la parte superior del gradiente. NOTA: Los endosomas de reciclaje deben encontrarse en la interfaz entre soluciones de sacarosa al 35% y al 25%. Las fracciones recogidas pueden congelarse en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 °C.</li>
	<li>Diluir todas las fracciones con 1 mL de tampón de dilución (3 mM de imidazol a pH 7.4, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Centrifugar la muestra diluida a 100.000 x g durante 1 h a 4 °C.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante y agregue 50 μL de 1x tampón de muestra para cosechar las fracciones.</li>
	<li>Analizar el contenido de proteínas en las fracciones mediante western blotting.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses con el contenido de este artículo.

El protocolo anterior describe los procedimientos para aislar el reciclaje de endosomas de células cultivadas por ultracentrifugación. La fiabilidad de este método ha sido demostrada por la última publicación22,demostrando que el reciclaje de endosomas se aísla con éxito de otros orgánulos(Figura 1),como el aparato de Golgi y las mitocondrias. Se debe prestar atención a algunos pasos críticos para obtener un buen resultado de separación. Al preparar las soluciones de ...

El tráfico endosomal es un proceso fisiológico esencial que implica diversos eventos biológicos1,por ejemplo, el transporte de receptores de señalización, canales iónicos y moléculas de adhesión. Las proteínas localizadas en la membrana plasmática se internalizan porendocitosis 2. Las proteínas internalizadas se clasifican por el endosoma temprano3. Algunas de las proteínas están dirigidas a los lisosomas para su degradación4. Sin embargo, una cantidad significativa de proteínas se reciclan de vuelta a la superficie celular mediante procesos de reciclaje rápido y reciclaje lento. En el reciclaje rápido, las proteínas abandonan los endosomas tempranos y regresan directamente a la membrana plasmática. Por el contrario, en el reciclaje lento, las proteínas se clasifican primero al compartimiento de reciclaje endocítico y luego se transportan de regreso a la membrana plasmática. Varias proteínas de carga, por ejemplo, clatrina, complejo de retrómeros, complejo retriever y proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich, y complejo SCAR Homologue (WASH), participan en tales procesos de reciclaje demembranas 4,5,6,7,8,9. El equilibrio del evento de endocitosis y reciclaje es crucial para la supervivencia celular y contribuye a varios eventos celulares10,por ejemplo, la adhesión celular, la migración celular, la polaridad celular y la transducción de señales.
ARF6, una pequeña GTPasa, es un regulador reportado del tráfico endocítico7,11,12. De interés, diversos grupos de investigación han ilustrado la importancia de ARF6 en el reciclaje endocítico13,14,15,16,17. El estudio tiene como objetivo investigar la relación entre el crecimiento de neuritas mediado por ARF6 y el reciclaje endocítico. El informe anterior sugiere que la activación de ARF6 es aguas arriba de la actividad de Rac1 al actuar sobre ELMO1-dedicador del complejo citocinesis 1 (DOCK180)18. Sin embargo, la forma en que ARF6 desencadena la señalización Rac1 mediada por ELMO1-DOCK180 sigue sin estar clara. Se empleó la ultracentrifugación de gradiente de densidad para investigar el papel del reciclaje endocítico mediado por ARF6 en dicho proceso. Mediante el uso de esto, la fracción que contiene endosoma de reciclaje se obtuvo a partir de lisados celulares19. La fracción fue sometida a Western blotting para el análisis del contenido de proteínas. Los resultados de immunoblot revelaron que bajo la presencia de FE65, una proteína adaptadora enriquecida con cerebro, ARF6 activo aumentó sustancialmente el nivel de ELMO1 en la fracción que contiene endosomas de reciclaje. El siguiente protocolo incluye los procedimientos para (1) transfectar células de mamíferos; (2) preparación de las muestras y columnas de gradiente de densidad; y (3) la obtención de la fracción que contiene endosoma de reciclaje.

<table><tbody><tr><td>1 mL, tubo de polipropileno de pared gruesa abierto, 11 x 34 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>347287</td><td></td></tr><tr><td>plato de cultivo de tejidos de 100 mm</td><td>SPL</td><td>20100</td><td></td></tr><tr><td>13,2 mL, Tubo ultratransparente de pared delgada abierto libre certificado, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14277</td><td></td></tr><tr><td>5x Tampón de muestras</td><td>GenScript</td><td>MB01015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>COX IV (3E11) Tecnología</td><td>de señalización de células</td> mAb <td>de conejo 4850S</td><td>Anticuerpo monoclonal de conejo para la detección de COX IV.</td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder, 7 mL</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con baja glucosa</td><td>HyClone</td><td>SH30021.01 ELMO1</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo (B-7)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-271519</td><td>Anticuerpo monoclonal de ratón para la detección de ELMO1.</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>FE65 anticuerpo (E-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-19751</td><td>Anticuerpo policlonal de cabra para la detección de FE65.</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, grado de investigación</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Anticuerpo monoclonal (6C5)</td><td>Ambion</td><td>AM4300</td><td>Anticuerpo monoclonal de ratón para la detección de GAPDH.</td></tr><tr><td>ImageLab Software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Medición de la intensidad de la banda</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 Reactivo de transfección</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-&beta;-COP</td><td>Sigma</td><td>G6160</td><td>Anticuerpo monoclonal de ratón para la detección de &beta;-COP.</td></tr><tr><td>Myc-tag (9B11) mAb</td><td>cell Signaling Technology</td><td>2276S</td><td>Anticuerpo monoclonal de ratón para la detección de proteínas marcadas con myc.</td></tr><tr><td>OmniPur EDTA, Sal disódica, Dihidratado</td><td>Calbiochem</td><td>4010-OP</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medios de suero reducidos</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PBS Comprimidos</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td></td><td></td>4906845001</tr><tr><td>Anticuerpo policlonal específico de RAB11A</td><td>Proteintech</td><td>20229-1-AP</td><td>Anticuerpo policlonal de conejo para la detección de Rab11.</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ21931A4</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotor de cuchara oscilante</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 Rotor de ángulo fijo</td><td>Beckman Coulter</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

ultracentrifugación de gradiente de densidad para investigar el reciclaje endocítico en células de mamíferos

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

El tráfico endosomal es un proceso celular esencial que regula una amplia gama de eventos biológicos. Las proteínas se internalizan desde la membrana plasmática y luego se transportan a los endosomas tempranos. Las proteínas internalizadas podrían ser transitadas al lisosoma para su degradación o recicladas de vuelta a la membrana plasmática. Se requiere una vía de reciclaje endocítica robusta para equilibrar la eliminación de materiales de membrana de la endocitosis. Se informa que varias proteínas regulan la vía, incluido el factor de ribosilación ADP 6 (ARF6). La ultracentrifugación por gradiente de densidad es un método clásico para el fraccionamiento celular. Después de la centrifugación, los orgánulos se sedimentan en su superficie isopícnica. Las fracciones se recogen y se utilizan para otras aplicaciones posteriores. Aquí se describe un protocolo para obtener una fracción de reciclaje que contiene endosomas de células de mamíferos transfectadas utilizando ultracentrifugación por gradiente de densidad. Las fracciones aisladas fueron sometidas a Western blotting estándar para analizar su contenido proteico. Al emplear este método, identificamos que la orientación de la membrana plasmática de la envoltura y la motilidad celular 1 (ELMO1), un sustrato de toxina botulínica C3 relacionada con Ras 1 (Rac1) factor de intercambio de nucleótidos de guanina, es a través del reciclaje endocítico mediado por ARF6.

Después de fraccionar las células HEK293 no transfectadas por ultracentrifugación por gradiente de densidad, se recolectaron 12 fracciones a partir de la parte superior del gradiente. Las fracciones cosechadas se diluyeron con el tampón de dilución en una proporción de 1:1 y se sometieron a una segunda ronda de centrifugación. Las muestras se sometieron a western blotting para analizar su contenido de proteínas. Como se muestra en la Figura 1,el marcador de endosoma de reciclaje Rab11 se det...

Este artículo tiene como objetivo presentar un protocolo para la preparación de endosomas de reciclaje de células de mamíferos utilizando ultracentrifugación por gradiente de densidad de sacarosa.

Ultracentrifugación de gradiente de densidad para investigar el reciclaje endocítico en células de mamíferos

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Este protocolo ayuda a aislar los endosomas de reciclaje que contienen fracción de células de mamíferos transfectadas para facilitar la investigación del tráfico de proteínas a través del tráfico endocítico. Esta técnica es fácil de manejar y aplicable tanto a muestras de tejido como de células. Demostrando el procedimiento estará la señorita Zhai Yu Qi, estudiante de doctorado del Laboratorio del Dr. Lao.Para comenzar, placa 2 veces 10 a las 6 células en un plato de cultivo de 100 milímetros. Al día siguiente, transfecte las células con lipofectamina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cosechar las células, deseche el medio de cultivo 48 horas después de la transfección y lave las células dos veces con PBS helado.Luego agregue un mililitro de PBS helado suplementado con un cóctel inhibidor de la proteasa 0.5X en un cóctel inhibidor de la fosfatasa 0.5X a cada plato. A continuación, utilizando un raspador de células, recoja las células y transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 mililitros. las celdas por centrifugación utilizando un rotor de cucharón oscilante.Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular suavemente en cinco mililitros de tampón de homogeneización. Recoger las células de nuevo por centrifugación y resuspendir el pellet celular en un mililitro de tampón de homogeneización. Homogeneizar las células con un homogeneizador Dounce utilizando de 15 a 20 golpes.Luego transfiera el homogonato a un tubo de centrifugación de dos mililitros. Añadir 700 microlitros de tampón de homogeneización al homogonato. Luego gire el homogonato diluido y recoja 1,5 mililitros del sobrenadante.Gire el sobrenadante recolectado nuevamente, luego recoja 1.4 mililitros del sobrenadante y etiquételo como sobrenadante post-nuclear. Para preparar la columna de gradiente de densidad, transfiera 1,2 mililitros del sobrenadante postnuclear a un tubo de ultracentrífuga. Luego agregue un mililitro de solución de sacarosa al 62% a la muestra y mezcle bien mediante pipeteo suave.A continuación, agregue cuidadosamente 3,3 mililitros de solución de sacarosa al 35% sobre la muestra, seguido de 2,2 mililitros de solución de sacarosa al 25% sobre la solución de sacarosa al 35%. Finalmente, llene el tubo de la ultracentrífuga hasta la parte superior con tampón de homogeneización. Centrifugue la columna de gradiente de densidad y recoja cuidadosamente 12 fracciones de 1 mililitro cada una, comenzando desde la parte superior del gradiente.A continuación, diluir todas las fracciones con un mililitro de tampón de dilución y centrifugar las muestras diluidas. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y agregue 50 microlitros de tampón de muestra 1X para cosechar las fracciones. El marcador de endosoma de reciclaje Rab11 se detectó en la fracción siete.También se investigaron otros marcadores subcelulares, incluidos beta COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 y Lamp1. También se detectó una señal POSITIVA de EEA1 en la fracción siete. Las intensidades de banda medidas de GAPDH, Cox IV y Rab11 tanto en la Fracción siete como en el sobrenadante postnuclear se muestran aquí.Después de transectar células HEC293 con ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L o ELMO1 ARF6Q67L FE65, no se encontraron cambios en la distribución de ELMO1 con sobreexpresión de ARF6Q67L y FE65. El nivel de ELMO1 en la fracción siete se comparó entre diferentes transfecciones y se encontró elevado después de la cotransfección de ARF6Q67L. Se observó un aumento adicional cuando tanto ARF6Q67L como FE65 fueron coexpresados.Por el contrario, la eliminación de FE65 disminuyó el enriquecimiento de Elmo1 mediado por ARF6 en la fracción siete. La fracción obtenida podría ser utilizada para su posterior análisis. Por ejemplo, western blotting para visualizar los cambios en el nivel de proteína en la fracción.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este artículo se describe un protocolo para la extracción de la traducción de los ribosomas de las células eucariotas. Una vez extraído, ribosomas están separados en monosomes y polirribosomas por fraccionamiento en gradiente de sacarosa para permitir que las diferentes poblaciones de ribosomas para ser analizados. Por lo tanto, este método es el estándar de oro para el examen de la regulación de la traducción.

Análisis eucariotas perfil Polyribosome

En este video, describimos un protocolo simple y eficiente que utiliza la centrifugación en gradiente para aislar núcleos individuales. Una vez aislados, estos núcleos se pueden utilizar para la secuenciación y el análisis del genoma.

Purificación de núcleos basada en centrifugación en gradiente: una técnica para obtener una fracción ultrapura de núcleos intactos mediante centrifugación en gradiente de densidad

Este video demuestra el método de purificación basado en ultracentrifugación en gradiente de densidad para aislar subpoblaciones de vesículas extracelulares adecuadas para estudios de caracterización.

Purificación de subpoblaciones de vesículas extracelulares: una técnica para purificar subpoblaciones de vesículas extracelulares mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad

Aquí, presentamos un protocolo para aislar la membrana plasmática, citoplasma y mitocondrias de las células U937 sin el uso de la centrifugación de alta velocidad. Esta técnica se puede utilizar para purificar fracciones subcelulares para la examinación subsecuente de la localización de la proteína mediante immunoblotting.

Fraccionamiento de la célula de las células U937 en ausencia de centrifugación de alta velocidad

Este protocolo de fraccionamiento permitirá a los investigadores aislar proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriales y de membrana de células de mamíferos. Las dos últimas fracciones subcelulares se purifican aún más a través del gradiente de densidad isopícnica.

Fraccionamiento celular de células U937 por purificación de gradiente de densidad isopícnica

Este protocolo detalla el enriquecimiento de vesículas extracelulares micobacterianas nativas (mEVs) de cultivos axénicos de Mycobacterium smegmatis (Msm) y cómo se pueden diseñar y enriquecer msmEVs recombinantes que contienen mCherry (un reportero fluorescente rojo). Por último, se verifica el novedoso enfoque con el enriquecimiento de MsmEVs que contienen la proteína EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimiento de vesículas extracelulares nativas y recombinantes de micobacterias

Los sitios de contacto mitocondrial son complejos proteicos que interactúan con las proteínas de la membrana interna y externa mitocondrial. Estos sitios son esenciales para la comunicación entre las membranas mitocondriales y, por lo tanto, entre el citosol y la matriz mitocondrial. Aquí, describimos un método para identificar candidatos que califican para esta clase específica de proteínas.

Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial

Este estudio describe un método para aislar y purificar vesículas extracelulares bacterianas (BEV) enriquecidas a partir de heces humanas mediante centrifugación en gradiente de densidad (DGC), identifica las características físicas de los BEV a partir de la morfología, el tamaño de partícula y la concentración, y discute las posibles aplicaciones del enfoque DGC en la investigación clínica y científica.

Aislamiento y purificación de vesículas extracelulares bacterianas a partir de heces humanas mediante centrifugación en gradiente de densidad

El protocolo describe el aislamiento de VE microbianos intestinales de ratas sensibles a la sal alimentadas con HSD mediante centrifugación en gradiente de densidad. Los VE se caracterizaron mediante seguimiento de nanopartículas, ensayos TEM, LPS/BCA y secuenciación de ARNr 16S para analizar el tamaño, la morfología, la composición y el origen de la microbiota.

Separación y caracterización diferencial de vesículas extracelulares microbianas intestinales en ratas sensibles a la sal en condiciones de dieta alta en sal

Este protocolo describe el aislamiento y la cuantificación de pequeños ARN de lipoproteínas de alta densidad.

El aislamiento de las lipoproteínas de alta densidad para no codificante ARN pequeño Cuantificación

Aprende a aislar endosomas de reciclaje mediante ultracentrifugación en gradiente de sacarosa en células de mamíferos. Este protocolo facilita el estudio del tráfico proteico endocítico en biología celular.

Ultracentrifugación de gradiente de densidad para investigar el reciclaje endocítico en células de mamíferos

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