Ultracentrifugación de gradiente de densidad para investigar el reciclaje endocítico en células de mamíferos
30 de junio de 2021
Este artículo tiene como objetivo presentar un protocolo para la preparación de endosomas de reciclaje de células de mamíferos utilizando ultracentrifugación por gradiente de densidad de sacarosa.
Este protocolo ayuda a aislar los endosomas de reciclaje que contienen fracción de células de mamíferos transfectadas para facilitar la investigación del tráfico de proteínas a través del tráfico endocítico. Esta técnica es fácil de manejar y aplicable tanto a muestras de tejido como de células. Demostrando el procedimiento estará la señorita Zhai Yu Qi, estudiante de doctorado del Laboratorio del Dr. Lao.
Para comenzar, placa 2 veces 10 a las 6 células en un plato de cultivo de 100 milímetros. Al día siguiente, transfecte las células con lipofectamina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cosechar las células, deseche el medio de cultivo 48 horas después de la transfección y lave las células dos veces con PBS helado.
Luego agregue un mililitro de PBS helado suplementado con un cóctel inhibidor de la proteasa 0.5X en un cóctel inhibidor de la fosfatasa 0.5X a cada plato. A continuación, utilizando un raspador de células, recoja las células y transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 mililitros. las celdas por centrifugación utilizando un rotor de cucharón oscilante.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular suavemente en cinco mililitros de tampón de homogeneización. Recoger las células de nuevo por centrifugación y resuspendir el pellet celular en un mililitro de tampón de homogeneización. Homogeneizar las células con un homogeneizador Dounce utilizando de 15 a 20 golpes.
Luego transfiera el homogonato a un tubo de centrifugación de dos mililitros. Añadir 700 microlitros de tampón de homogeneización al homogonato. Luego gire el homogonato diluido y recoja 1,5 mililitros del sobrenadante.
Gire el sobrenadante recolectado nuevamente, luego recoja 1.4 mililitros del sobrenadante y etiquételo como sobrenadante post-nuclear. Para preparar la columna de gradiente de densidad, transfiera 1,2 mililitros del sobrenadante postnuclear a un tubo de ultracentrífuga. Luego agregue un mililitro de solución de sacarosa al 62% a la muestra y mezcle bien mediante pipeteo suave.
A continuación, agregue cuidadosamente 3,3 mililitros de solución de sacarosa al 35% sobre la muestra, seguido de 2,2 mililitros de solución de sacarosa al 25% sobre la solución de sacarosa al 35%. Finalmente, llene el tubo de la ultracentrífuga hasta la parte superior con tampón de homogeneización. Centrifugue la columna de gradiente de densidad y recoja cuidadosamente 12 fracciones de 1 mililitro cada una, comenzando desde la parte superior del gradiente.
A continuación, diluir todas las fracciones con un mililitro de tampón de dilución y centrifugar las muestras diluidas. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y agregue 50 microlitros de tampón de muestra 1X para cosechar las fracciones. El marcador de endosoma de reciclaje Rab11 se detectó en la fracción siete.
También se investigaron otros marcadores subcelulares, incluidos beta COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 y Lamp1. También se detectó una señal POSITIVA de EEA1 en la fracción siete. Las intensidades de banda medidas de GAPDH, Cox IV y Rab11 tanto en la Fracción siete como en el sobrenadante postnuclear se muestran aquí.
Después de transectar células HEC293 con ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L o ELMO1 ARF6Q67L FE65, no se encontraron cambios en la distribución de ELMO1 con sobreexpresión de ARF6Q67L y FE65. El nivel de ELMO1 en la fracción siete se comparó entre diferentes transfecciones y se encontró elevado después de la cotransfección de ARF6Q67L. Se observó un aumento adicional cuando tanto ARF6Q67L como FE65 fueron coexpresados.
Por el contrario, la eliminación de FE65 disminuyó el enriquecimiento de Elmo1 mediado por ARF6 en la fracción siete. La fracción obtenida podría ser utilizada para su posterior análisis. Por ejemplo, western blotting para visualizar los cambios en el nivel de proteína en la fracción.
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo para preparar endosomas de reciclaje a partir de células de mamíferos utilizando ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Esta técnica está diseñada para facilitar la investigación del tráfico de proteínas mediante vías endocíticas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Biología celular
- Endocitosis
- Tráfico de proteínas
Antecedentes
- Los endosomas de reciclaje desempeñan un papel crucial en el tráfico celular.
- Comprender el tráfico de proteínas es esencial para obtener conocimientos sobre diversos procesos celulares.
- La ultracentrifugación es una técnica ampliamente utilizada para aislar componentes celulares.
- Este protocolo es aplicable tanto a muestras de tejido como a muestras celulares.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método confiable para el aislamiento de endosomas reciclantes.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos de tráfico endocítico.
- Apoyar investigaciones futuras sobre la dinámica de proteínas dentro de las células.
Métodos Utilizados
- Transfección de células de mamífero con Lipofectamine.
- Recolección de células a las 48 horas posteriores a la transfección.
- Lavado de células con PBS frío con hielo.
- Uso de la ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa para el aislamiento.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de endosomas recicladores a partir de células transfectadas.
- Demuestra el protocolo un estudiante de doctorado.
- Facilitación de estudios posteriores sobre el tráfico de proteínas.
- Validación de la aplicabilidad del método a diversos tipos de muestras.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un enfoque sencillo para aislar los endosomas recicladores.
- Se espera que contribuya a la comprensión del tráfico de proteínas.
- Este método puede utilizarse en diversos contextos de investigación biológica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Aislar los endosomas recicladores permite reducir el riesgo mecanicista de los objetivos de tráfico endocítico al proporcionar datos cuantitativos de fraccionamiento subcelular. Esto apoya la validación de objetivos y el desarrollo de ensayos para proteínas que regulan el reciclaje de proteínas de membrana, como los efectores de ARF6. El método aumenta la confianza predictiva en la identificación de compuestos activos al vincular la localización proteica con vías funcionales de reciclaje.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas sobre reguladores del reciclaje endocítico como ARF6 y ELMO1.
- Valor operativo: Proporciona datos de fraccionamiento para aclarar los mecanismos de tráfico de proteínas específicos de la vía.
- Valor científico: Apoya la reducción del riesgo biológico mediante la validación del acoplamiento al blanco en fracciones de endosomas recicladores.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara fracciones validadas que contienen endosomas de reciclaje para análisis posteriores mediante inmunotransferencia.
- Valor operativo: Permite el aislamiento estandarizado y reproducible de orgánulos para la medición cuantitativa de proteínas.
- Valor científico: Facilita la preparación del ensayo para la selección de compuestos que modulan el reciclaje endocítico.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Conecta datos de tráfico en fase de descubrimiento con modelos preclínicos mediante el aislamiento de la fracción positiva para Rab11.
- Valor operativo: Garantiza la continuidad desde la fraccionamiento subcelular hasta la validación funcional en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Valor científico: Apoya el avance ajustado al riesgo al confirmar la localización del blanco en las vías de reciclaje.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano mediante el aislamiento de fracciones subcelulares que aportan información para la validación de objetivos y la identificación de compuestos prometedores.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre reguladores de la reciclaje endocítico mediante fraccionamiento y análisis de marcadores.
- Detección: Permite el desarrollo de ensayos mediante el aislamiento estandarizado de fracciones positivas para Rab11 para la cuantificación de proteínas.
- Análisis: Genera lecturas cuantitativas por inmunotransferencia desde fracciones para comparar el enriquecimiento proteico entre distintas condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona los datos de fraccionamiento con la continuidad preclínica mediante la validación del aislamiento de endosomas recicladores.
- Reutilización Empresarial: Proporciona una plataforma reutilizable para la fraccionamiento subcelular en múltiples proyectos de validación de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías de tráfico.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad y escalabilidad del aislamiento de orgánulos para un análisis posterior consistente.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos de localización subcelular para objetivos de vías de reciclaje.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en datos de enriquecimiento del endosoma de reciclaje.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de cultivo celular, transfección y ultracentrifugación.
- Depende del acceso a rotores de balance y ultracentrífugas para la separación mediante gradiente de densidad.
- Necesita la estandarización de protocolos de fraccionamiento entre equipos para el aislamiento comparable de fracciones de Rab11.
- Requiere la adaptación de paneles de marcadores (por ejemplo, Rab11, EEA1) para diferentes tipos celulares o vías de tráfico.
- Limitado por la necesidad de marcadores de validación para confirmar la pureza de las fracciones antes de aplicaciones posteriores.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
Mammalian Cell Culture, Transfection and Cell Harvest
2:07
Density Gradient Column Preparation
2:46
Fractionation and Recovery of Recycling Endosome-Containing Fraction
3:17
Results: Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells
4:47
Conclusion
