Evaluación in vitro de la reprogramación cardíaca mediante la medición del flujo de calcio específico cardíaco con un informador GCaMP3
22 de febrero de 2022
Describimos aquí, el establecimiento y la aplicación de una línea de reportero de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (denominada αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a continuación) para la evaluación de reprogramación cardíaca. Los fibroblastos cardíacos neonatales (NCF) aislados de la cepa del ratón se convierten en cardiomiocitos inducidos (iCM), lo que permite una evaluación conveniente y eficiente de la eficiencia de reprogramación y la maduración funcional de los iCM a través
Los métodos descritos en este protocolo proporcionarán una plataforma valiosa para evaluar la maduración funcional de los ICM para los estudios de reprogramación cardíaca. El flujo de calcio se observa exclusivamente en los ICM y proporciona una forma de evaluar la maduración funcional de la MCI. Esta cepa de ratón simplifica los procedimientos de evaluación y mejora la reproducibilidad de los resultados.
Este protocolo es un nuevo método para evaluar la maduración funcional de los ICM en el campo de la reprogramación cardíaca. También se puede aplicar para evaluar la diferenciación de cardiomiocitos y la función cardíaca. Comience por obtener de ocho a 10 cachorros, cachorros P0 a P2 para aislar 10 millones de fibroblastos cardíacos neonatales, o NCF.
Anestesiar profundamente a los cachorros por hipotermia. Observe los corazones bajo el microscopio de fluorescencia para asegurarse de que el corazón con el genotipo deseado muestre flujo de calcio, indicado por GCaMP3 con los corazones latiendo. Los otros genotipos no mostrarán fluorescencia.
Después del aislamiento de los corazones, córtelos en cuatro pedazos para que estén vagamente conectados. Lávelos bien varias veces en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco helada, o DPBS, en una placa de seis centímetros para limitar la contaminación de las células sanguíneas en las células aisladas. Digiera los corazones con ocho mililitros de 0,25% de tripsina-EDTA caliente en 37 grados centígrados durante 10 minutos.
Deseche el sobrenadante de tripsina y agregue cinco mililitros de 0,5 miligramos por mililitro de colagenasa caliente tipo dos en la solución salina equilibrada de Hank. Vórtice la mezcla a fondo e incube a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, nuevamente, vórtice la mezcla a fondo y deje que el tejido no digerido se asiente por gravedad.
Recoger el sobrenadante en un tubo cónico de 15 mililitros con cinco mililitros de medio fibroblasto frío. Diluya las células con medio fibroblástico de tal manera que la densidad de siembra sea de dos a 2.5 veces 10 a la cuarta célula por centímetro cúbico. Luego siembra las células en platos o platos.
Los fibroblastos unidos deben tener una forma ovalada a redonda en el segundo día después de la siembra. En el día cero, sembra los NCF a la densidad de alrededor de una a dos veces 10 a la cuarta célula por centímetro cúbico en medio de fibroblastos. En el primer día, reemplace el medio de cultivo con un medio que contenga virus para cada pozo deseado.
El día 2, 24 horas después de la infección por el virus, reemplace el medio que contiene el virus con un medio ICM regular. Evalúe el flujo de iones de calcio con un microscopio de fluorescencia invertida a temperatura ambiente. Observe las células positivas GCaMP3 bajo el objetivo 10X, asegurándose de que muestra células espontáneas latiendo en el canal de campo brillante.
Los corazones con el genotipo correcto mostraron flujo de iones de calcio sincronizado con el latido, visualizado como fluorescencia GCaMP3. Mientras que no se observó fluorescencia en los corazones de control. Los NCF aislados se unieron al pozo en dos horas y mostraron una forma ovalada a redonda un día después de la siembra.
La oscilación de iones de calcio mostró un cambio de fluorescencia GCaMP3 entre el máximo y el mínimo y la oscilación de iones de calcio de tales células cambió periódicamente. Después de introducir IMAP, el número de grupos de latidos fue significativamente mayor que en el grupo controlado, ya que el número de células positivas GCaMP3 con flujo de iones de calcio para un campo de alta potencia aumentó en el grupo tratado con medio IMAP. Los NCF deben estar recién preparados y saludables después del aislamiento.
Un procedimiento rápido de aislamiento cardíaco, corte y tiempo de digestión adecuado puede ayudar a evitar la reducción de la viabilidad y la condición celular. Este método proporciona una forma de identificar ICM madurados funcionales para los investigadores de reprogramación cardíaca. Con múltiples métodos de evaluación adicionales, se puede obtener una comprensión más concisa sobre los ICM maduros funcionales.
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Descripción general
Este artículo presenta una nueva línea de ratones reporteros, αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, para evaluar la reprogramación cardíaca. El protocolo establecido permite la evaluación de cardiomiocitos inducidos (iCMs) derivados de fibroblastos cardíacos neonatales (NCFs) mediante análisis de flujo de calcio.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Reprogramación cardíaca
- Cardiomiocitos inducidos
- Análisis del flujo de calcio
Antecedentes
- El modelo de ratón αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 facilita la investigación cardíaca.
- Los fibroblastos cardíacos neonatales pueden convertirse eficientemente en iCMs.
- El flujo de calcio sirve como un indicador clave de la maduración funcional de los iCMs.
- Este método mejora la reproducibilidad en los estudios de reprogramación cardíaca.
Objetivo del estudio
- Establecer una plataforma confiable para evaluar la maduración funcional de los CMi.
- Simplificar los procedimientos de evaluación en la investigación sobre reprogramación cardíaca.
- Proporcionar información sobre la diferenciación de cardiomiocitos y la función cardíaca.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de fibroblastos cardíacos neonatales de crías P0 a P2.
- Conversión de FCN en cardiomiocitos inducidos.
- Evaluación de la maduración funcional mediante la medición del flujo de calcio.
- Evaluación de la eficiencia de reprogramación y de la función cardíaca.
Resultados principales
- Conversión exitosa de NCF en iCM funcionales.
- El flujo de calcio observado exclusivamente en iCM indica maduración.
- Mejora en la reproducibilidad de los resultados en estudios de reprogramación cardíaca.
- Protocolo aplicable para evaluar la diferenciación de cardiomiocitos.
Conclusiones
- El modelo de ratón αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 es una herramienta valiosa.
- El análisis del flujo de calcio es eficaz para evaluar la maduración de los CMi.
- Este método puede impulsar la investigación en reprogramación y función cardíaca.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación de la maduración funcional de los cardiomiocitos inducidos sigue siendo un cuello de botella crítico en la reprogramación cardíaca para terapias regenerativas. Este protocolo proporciona una lectura directa basada en reporteros del flujo de calcio que permite una evaluación objetiva de la madurez funcional de los CMi, apoyando la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Al vincular la reprogramación transcripcional con la respuesta electrofisiológica funcional, mejora la confianza predictiva en los modelos preclínicos e informa las decisiones estratégicas sobre enfoques de reparación cardíaca.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la vinculación de la administración de factores de transcripción (MGT) con lecturas funcionales de transitorios de calcio en células reprogramadas.
- Valor operativo: Utiliza la fluorescencia de GCaMP3 para aislar iCMs exitosamente reprogramadas, reduciendo la dependencia de marcadores indirectos como la expresión génica.
- Valor predictivo: El flujo de calcio sirve como un biomarcador funcional que apoya la reducción de riesgos biológicos y la confianza en los objetivos en los enfoques de reprogramación cardíaca.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para el ensayo: Establece una plataforma estandarizada basada en fluorescencia para cuantificar el flujo de calcio como una variable dependiente cuantitativa en ensayos de maduración de iCM.
- Reproducibilidad: La línea de ratones reporteros garantiza una detección consistente de iCM funcionales en diferentes experimentos, favoreciendo la estandarización del ensayo.
- Escalabilidad: Compatible con microscopía de fluorescencia y adaptable a sistemas de imagen de mayor rendimiento para cribar la eficiencia de reprogramación.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad para evaluar la maduración funcional de los miocardiocitos inducidos in vitro, conectando el descubrimiento con la validación preclínica.
- Continuidad traslacional: Permite la evaluación longitudinal de la maduración de los miocardiocitos inducidos desde las primeras etapas de reprogramación hasta la competencia funcional electrofisiológica.
- Reducción mecanicista de riesgos: Las mediciones del flujo de calcio ayudan a distinguir las células estructuralmente reprogramadas de los miocardiocitos inducidos funcionalmente maduros, reduciendo los resultados falsos positivos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación preclínica, permitiendo específicamente la evaluación funcional tras la reprogramación transcripcional, pero antes de la validación in vivo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al determinar si los factores de reprogramación inducen no solo la expresión de marcadores, sino también la regulación funcional del calcio.
- Tamizaje: Proporciona sistemas biológicos reproducibles y listos para ensayos, con lecturas cuantitativas de flujo de calcio para comparar compuestos o condiciones.
- Análisis: Genera datos temporales basados en fluorescencia sobre la frecuencia y amplitud de las oscilaciones de calcio, permitiendo comparaciones estadísticas de condiciones de reprogramación.
- Investigación Traducional: Conecta los resultados de la reprogramación in vitro con fenotipos funcionales de cardiomiocitos relevantes para modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de reporteros reutilizable, aplicable a múltiples objetivos de reprogramación cardíaca y protocolos de diferenciación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona una medición directa de la maduración funcional, reduciendo la ambigüedad mecanicista en los resultados de la reprogramación.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante la especificidad del reportero genético, minimizando la variabilidad de los métodos basados en anticuerpos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al vincular la reprogramación molecular con la preparación funcional electrofisiológica.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de estrategias de reprogramación basada en el rendimiento funcional de iCM y la calidad de maduración.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cría de ratones, aislamiento de tejido cardíaco y microscopía de fluorescencia.
- Depende del acceso a la línea de ratones αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 y a sistemas de entrega viral para MGT.
- Necesita condiciones y tiempos de cultivo estandarizados para lograr una inducción consistente de iCM y una evaluación confiable del flujo de calcio.
- La adaptación a fuentes alternativas de fibroblastos u otras especies puede requerir validación de la especificidad del reportero y la fidelidad de la señalización de calcio.
- Las limitaciones prácticas incluyen la dependencia de la contracción espontánea para la visualización del flujo y la posible variabilidad en la eficiencia de transfección.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Isolation and Selection of Neonatal Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Mice Hearts
1:23
Isolation of Neonatal Cardiac Fibroblasts (NCFs)
2:43
Reprogramming NCFs to iCMs with MGT Encoding Retrovirus Infection
3:28
Results: In Vitro Assessment of Cardiac Reprogramming
4:20
Conclusion
