Name: Perfil espacial de la expresión de proteínas y ARN en tejidos: un enfoque para ajustar la microdisección virtual (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprenda a seleccionar regiones de interés para tecnologías de ómica espacial en tejidos tumorales. Este protocolo automatizado mejora la reproducibilidad del perfilado proteómico y transcriptómico celular.

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Los autores reconocen a Thomas Wu por procesar archivos NGS. Agradecemos a James Ziai por las discusiones de resultados y la revisión del manuscrito y a Meredith Triplet y Rachel Taylor por la revisión interna del manuscrito.

Todos los tejidos humanos se adquirieron de biobancos comerciales o bancos de tejidos acreditados bajo la garantía de que se obtuvo la aprobación apropiada de la Junta de Revisión Institucional y el consentimiento informado.
NOTA: El protocolo se realiza utilizando Discovery Ultra y GeoMx Digital Spatial Profiler. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los reactivos, el equipo y el software utilizados en este protocolo.
1. Protocolo de visualización automatizado para ensayos de proteómica espacial
<ol><li>Programa autotinción para aplicar anticuerpos de visualización fluorescente<ol><li>En el software autostainer, haga clic en el botón de inicio y elija Protocolos. Luego, haga clic en Crear / Editar protocolos y seleccione RUO DISCOVERY Universal como procedimiento.</li>
		<li>Haga clic en Primera secuencia > Deparafinización > Depar v2. Para Temperatura media, elija 72 grados C, luego haga clic en Pretratamiento y seleccione Acondicionamiento celular y depósito CC1. Para Temperatura muy alta, elija 100 grados C, luego haga clic en CC1 8 Min y continúe haciendo clic hasta que se seleccione CC1 64 Min .</li>
		<li>Haga clic en Inhibidor > Inhibidor DISCOVERY y, para Tiempo de incubación, elija 8 minutos. Luego, haga clic en Incubación de anticuerpos > Ab de alta temperatura; para baja temperatura, elija 37 grados C; en Anticuerpo, elija el número de anticuerpo de la etiqueta del dispensador (Anticuerpo 6 en este ejemplo); en Plus Incubation Time (Tiempo de incubación Plus), seleccione 32 Minutes. NOTA: Este protocolo tiene tres números de anticuerpos diferentes. El primer anticuerpo es FAP, el segundo es Pan-citoqueratina y el tercero es el Anticuerpo X.</li>
		<li>Haga clic en Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, luego en Antibody Blocking, elija Gt Ig Block, y para Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 4 Minutes. A continuación, en Multimer HRP Reagent, seleccione OMap anti-Rb HRP y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 16 Minutes. Luego, haga clic en Cy5, y para el tiempo de incubación largo, elija 0 Hr 8 Min.</li>
		<li>Haga clic en Secuencia dual y elija Desnaturalización de anticuerpos, luego seleccione Desnaturalización de anticuerpos CC2-1, y para Temperatura muy alta, elija 100 grados C. Asegúrese de que el tiempo de incubación sea de 8 min. A continuación, haga clic en DS Inhibitor y seleccione Neutralizar.</li>
		<li>Haga clic en DS Antibody, y para Very Low Temperature, elija 37 Deg C. A continuación, en Anticuerpo, elija el número de anticuerpo de la etiqueta del dispensador (Anticuerpo 3 en este ejemplo) y, en Tiempo de incubación Plus, seleccione 32 minutos.</li>
		<li>Haga clic en DS Multimer HRP y elija DS Multimer HRP Blocker. Luego, en Antibody Blocking, seleccione Gt Ig Block y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 4 Minutes. A continuación, en Multimer HRP Reagent, seleccione OMap anti-Ms HRP y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 16 Minutes. Luego, haga clic en DS Rhodamine 6G, y para el tiempo de incubación largo, elija 0 Hr 8 Min.</li>
		<li>Haga clic en Triple tinción y seleccione Desnaturalización de anticuerpos TS, luego seleccione Desnaturalización de anticuerpos CC2-2, y para Temperatura muy alta, seleccione 100 grados C. Asegúrese de que el tiempo de incubación sea de 8 min. A continuación, haga clic en Inhibidor de TS y seleccione TS Neutralize.</li>
		<li>Haga clic en Cuerpo TS y, para Temperatura muy baja, seleccione 37 grados C. A continuación, en Anticuerpo, seleccione el número de anticuerpos de la etiqueta del dispensador (Anticuerpo 7 en este ejemplo) y, en Plus Incubation Time, seleccione 32 Minutes.</li>
		<li>Haga clic en TS Multimer HRP y elija TS Multimer HRP Blocker. Luego, en Antibody Blocking, seleccione Gt Ig Block y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 4 Minutes. A continuación, en Multimer HRP Reagent, seleccione OMap anti-Rb HRP y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 16 Minutes. Luego, haga clic en TS FAM y, para el tiempo de incubación largo, elija 0 Hr 8 Min.</li>
		<li>Agregue un título al protocolo. Seleccione un número de protocolo, agregue un comentario y haga clic en Activo seguido de Guardar.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar diapositivas, imprimir etiquetas e iniciar la ejecución del autostainer<ol><li>El vendedor de panadería adquirió secciones de tejido humano FFPE (fijadas en formalina, incrustadas en parafina) en un horno a 70 °C durante 20-60 min. Mientras se hornean las diapositivas, imprima etiquetas haciendo clic en Crear etiqueta en el software de tinción automática. A continuación, haga clic en Protocolos, seleccione el número de protocolo y haga clic en Cerrar / Imprimir. Agregue información relevante en la etiqueta de la diapositiva y haga clic en Imprimir.</li>
		<li>Retire los portaobjetos del horno y déjelos enfriar a temperatura ambiente (RT). Aplique las etiquetas de protocolo previamente impresas a las diapositivas correspondientes.</li>
		<li>Cargue los dispensadores de anticuerpos recargables con anticuerpos de acuerdo con el número de etiqueta de anticuerpos asignado en el paso 1.1. En este protocolo, use el anticuerpo 6 para FAP a 1 μg/ml, use el anticuerpo 3 para la pancitoqueratina a 0,1 μg/ml y el anticuerpo 7 para el anticuerpo X a 2,5 μg/ml. Diluir cada anticuerpo en el diluyente especificado y preparar los dispensadores de anticuerpos recargables.</li>
		<li>Reúna los dispensadores de reactivos precargados de bloqueo, detección y amplificación mencionados anteriormente y colóquelos en una bandeja de reactivos. Cargue diapositivas en las bandejas de diapositivas (hasta 30 diapositivas por ejecución) y haga clic en En ejecución seguido de Sí. Tenga en cuenta que DAPI no se utiliza para la contratinción nuclear.</li>
		<li>Confirme el inicio de la ejecución comprobando la duración de la ejecución en el software autostainer. El protocolo tarda ~ 11 h en completarse y puede ejecutarse durante la noche.</li>
		<li>Al día siguiente, asegúrese de completar la carrera observando las luces verdes intermitentes en las ranuras de la bandeja deslizante. Luego, retire los portaobjetos del instrumento y enjuáguelos vigorosamente en 1x Tampón de reacción hasta que la solución líquida de cubreobjetos se elimine por completo.</li>
	</ol></li>
	<li>Protocolo de plataforma de perfilado espacial para ensayos proteómicos<ol><li>Siga el protocolo de proteómica espacial indicado en la nota a continuación. Incluya los siguientes cambios en el protocolo para habilitar el procedimiento de etiquetado automatizado 3-plex.</li>
		<li>Realice los pasos 1.2.1-1.2.6 el día antes de iniciar el protocolo de proteómica espacial y vaya directamente al paso de recuperación de antígenos del protocolo de proteómica espacial después de realizar el paso 1.2.6. Omita el procedimiento de visualización descrito en el protocolo de proteómica de perfiles espaciales.</li>
		<li>Reemplace SYTO 13 con SYTO 64 a 5000 nM para permitir la integración de fluoróforos. Diluir SYTO 64 en 1x TBS e incubar en una cámara de humedad durante 15 min.</li>
		<li>Al configurar los parámetros de escaneo en la plataforma de perfilado espacial, seleccione los filtros y los canales de enfoque de acuerdo con los fluoróforos utilizados en el panel de visualización para permitir la integración 3-plex. Use FITC para DISCOVERY FAM y establezca la exposición en 200 ms, use Cy3 para DISCOVERY Rhodamine 6G y establezca la exposición en 200 ms, use Texas Red para SYTO 64 y establezca la exposición en 50 ms (especifique esto como el canal de enfoque) y, finalmente, use Cy5 para DISCOVERY Cy5, establezca la exposición en 200 ms, y guardar cambios. NOTA: Las instrucciones detalladas del protocolo de proteómica de perfiles espaciales se encuentran en la pestaña Soporte del sitio web oficial seleccionando Documentación > Manuales de usuario. Aquí, busque el protocolo de proteínas para nCounter usando Bond RX.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Selección del ROI para ensayos de transcriptómica espacial
<ol><li>Hornear las secciones de pellets de células FFPE en un horno a 70 °C durante 20-60 min. Siga el protocolo NGS de la plataforma de perfilado espacial indicado en la nota a continuación y escanee diapositivas en la plataforma de perfilado espacial, seleccionando tamaños de 50 μm y 300 μm. Se destaca la siguiente recomendación para el ensayo de transcriptómica espacial:<ol><li>Al preparar la biblioteca, si se seleccionaron varios tamaños de ROI, agrupe los ROI de tamaños similares para crear una biblioteca por tamaño. Esto es para garantizar que se logren suficientes profundidades de secuenciación para todos los ROI sin sesgo de tamaño. NOTA: Las instrucciones detalladas de la plataforma de creación de perfiles espaciales se encuentran en la pestaña Soporte del sitio web oficial seleccionando Documentación > Manuales de usuario. Aquí, busque el protocolo de ARN para aplicaciones NGS que usan Bond RX.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Nerurkar, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+spatial+profiling+of+cancer+tissues+in+the+era+of+immunotherapy%3A+The+potential+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise.</a> Cancers. 12 (9), 2572(2020).</li>
<li>Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+pathology%3A+a+user%27s+review+of+a+highly+multiplexed+method+for+in+situ+analysis+of+protein+and+RNA+expression+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue.</a> Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).</li>
<li>McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+research+applications+of+multiplexed+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).</li>
<li>NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview">https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview</a> (2022).</li>
<li>NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf">https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf</a> (2022).</li>
<li>McCart Reed, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+spatial+profiling+application+in+breast+cancer%3A+a+user%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%3A+An+International+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective.</a> Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).</li>
<li>McNamara, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomic+characterization+of+HER2-positive+breast+tumors+through+neoadjuvant+therapy+predicts+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response.</a> Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).</li>
<li>Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+for+pathologists%3A+Protocols%2C+pitfalls%2C+and+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li>
<li>Muñoz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+targeted+photothermal+ablation+improves+tumor+specificity+and+immune+modulation+in+a+rat+model+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma.</a> Communications Biology. 3 (1), 783(2020).</li>
<li>Coleman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronidase+impairs+neutrophil+function+and+promotes+Group+B+Streptococcus+invasion+and+preterm+labor+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates.</a> mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).</li>
<li>Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+quantitative+assessment+of+PD-L1+using+digital+spatial+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).</li>
<li>Carter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+spatially+defined+immune+%28micro%29landscapes+of+early-stage+PD-L1-positive+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).</li>
<li>Busse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprofiling+in+neuroendocrine+neoplasms+unveil+immunosuppressive+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment.</a> Cancers. 12 (11), 3448(2020).</li>
<li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+lung+SARS-CoV-2+and+influenza+virus+infection+dissects+virus-specific+host+responses+and+gene+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures.</a> European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).</li>
<li>Li, X., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bulk%2C+single-cell+to+spatial+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing.</a> International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).</li>
<li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li>
<li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Immuno-Oncology+Technology%22%5BJournal%5D)">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li>
<li>Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf">https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf</a> (2020).</li>
<li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+geomx+spatial+profiler%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456(2021).</li>
<li>Hwang, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+spatial+transcriptomics+of+archival+pancreatic+cancer+reveals+multi-compartment+reprogramming+after+neoadjuvant+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment.</a> BioRxiv. , (2020).</li>
<li>Jerby-Arnon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+immune+and+genetic+mechanisms+shape+oncogenic+programs+in+synovial+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma.</a> Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).</li>
</ol>

Verónica Ibarra-López, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modriestán y Sandra Rost son empleadas y accionistas de Genentech, miembro del Grupo Roche. Otras empresas que forman parte de Roche producen reactivos e instrumentos utilizados en este manuscrito. Ciara Martin es empleada a tiempo completo de NanoString Technologies Inc, que produce reactivos e instrumentos utilizados en este manuscrito.

Hasta la fecha, los anticuerpos fluorescentes directamente conjugados en un protocolo manual se utilizan más comúnmente como paneles de visualización para ensayos de proteómica espacial o transcriptómica espacial 9,10. Sin embargo, el uso de anticuerpos fluorescentes directamente conjugados puede ser un desafío para los marcadores menos abundantes, lo que limita la selección de anticuerpos adecuados. Este protocolo muestra que el etiquetado de marcadores de visua...

Los avances en las técnicas de multiplexación continúan proporcionando mejores herramientas de caracterización para los objetivos presentes en los tumores. El microambiente tumoral (EMT) es un sistema complejo de células tumorales, células inmunes infiltrantes y estroma, donde la información espacial es crítica para comprender e interpretar mejor los mecanismos de interacción entre biomarcadores de interés1. Con técnicas emergentes como GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) y 10x Visium, se pueden detectar y cuantificar múltiples objetivos simultáneamente dentro de su contexto espacial. El uso de protocolos de inmunofluorescencia que facilitan la visualización del tejido puede mejorar aún más las capacidades de perfil espacial de estas tecnologías.
La tecnología de Spatial Omics en la que nos centramos para el desarrollo de este método consiste en ensayos de proteómica espacial y transcriptómica donde los oligonucleótidos se unen a anticuerpos o sondas de ARN a través de un enlace fotodivisible sensible a los rayos UV. Los portaobjetos histológicos se etiquetan con estos anticuerpos o sondas oligoconjugados y luego se obtienen imágenes en la plataforma de perfiles espaciales. A continuación, se seleccionan ROI de diferentes tamaños y formas para la iluminación, y los oligonucleótidos fotohendidos se aspiran y se recogen en una placa de 96 pocillos. Los oligonucleótidos fotohendidos están preparados para ser cuantificados con el sistema Nanostring nCounter o Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (Figura 1)4,5.
Las distribuciones celulares varían dentro de los tejidos, y la capacidad de caracterizar ubicaciones específicas de células utilizando marcadores seleccionados y diferentes tamaños de ROI es de gran importancia para comprender completamente el entorno del tejido e identificar características específicas. En la tecnología Spatial Omics mencionada aquí, el protocolo de visualización estándar utiliza anticuerpos directamente conjugados y es un protocolo manual. Los marcadores estándar para distinguir entre tumor y estroma son pancitoqueratina (panCK) y CD456,7, pero se necesitan marcadores adicionales para dirigirse a poblaciones celulares específicas de interés. Además, el uso de anticuerpos fluorescentes directamente conjugados carece de amplificación, lo que limita la selección de anticuerpos a marcadores abundantes. Además, los ensayos manuales están sujetos a una mayor variabilidad que los flujos de trabajo automatizados8. Por lo tanto, es deseable tener un protocolo de visualización personalizable, automatizado y amplificado para la selección del ROI.
Aquí, el estudio demuestra que, para los ensayos de proteómica espacial, la tecnología TSA se puede utilizar para protocolos de visualización en una plataforma automatizada, lo que resulta en un ensayo más específico y estandarizado. Además, los ensayos basados en TSA permiten el uso de marcadores de baja expresión, lo que aumenta el rango de objetivos que se pueden seleccionar para la visualización. Se desarrolló un ensayo 3-plex para panCK, FAP y Antibody X utilizando una plataforma automatizada donde se usaron panCK y FAP para diferenciar entre tumor y estroma, respectivamente. El anticuerpo X es una proteína estromal que se encuentra con frecuencia en los tumores, pero su biología y su impacto en la inmunidad antitumoral no se comprenden completamente. La caracterización de la textura inmune en áreas ricas en anticuerpos X puede dilucidar su papel en la inmunidad antitumoral y la respuesta terapéutica, así como su potencial como diana farmacológica.
Si bien los paneles de visualización TSA automatizados personalizados demostraron ser exitosos para los ensayos de proteómica espacial, no se pudo confirmar la aplicación de estos ensayos para ensayos de transcriptómica espacial. Esto se debe probablemente a los reactivos y al protocolo utilizado para los protocolos de visualización automatizada, que parecen comprometer la integridad del ARN. Reconocer que un protocolo de etiquetado automatizado para marcadores de visualización se puede utilizar para ensayos de proteómica espacial, pero no para ensayos de transcriptómica espacial, proporciona una guía importante sobre los diseños de ensayos de tecnología Spatial Omics.
Además, el estudio demuestra que el ensayo de transcriptómica espacial se puede utilizar para perfilar objetivos en regiones tan pequeñas como 50 μm de diámetro, o aproximadamente 15 células. Se seleccionaron dos ROI de diferentes tamaños para probar la capacidad del ensayo para detectar también transcripciones en ROI pequeños. Para cada región de interés, se recolectaron oligos correspondientes a 1.800 objetivos de ARNm y se convirtieron en bibliotecas de acuerdo con el protocolo de la plataforma de perfiles espaciales. Las bibliotecas se indexaron individualmente, posteriormente se agruparon y secuenciaron. Esto permitió evaluar tanto la eficiencia de la agrupación como la capacidad de identificar poblaciones celulares específicas en pequeños ROI.
Este documento muestra que para los ensayos de proteómica espacial, se puede utilizar un protocolo automatizado para guiar la selección del ROI en marcadores específicos de interés para dirigirse selectivamente a la interrogación de áreas de tejido relevantes y caracterizar el entorno espacial del tejido. Además, demostramos que se pueden usar ROI más pequeños para ensayos transcriptómicos espaciales para detectar y caracterizar poblaciones celulares específicas.

<table><tbody><tr><td>10x solución salina tamponada Tris (TBS)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>12498S</td><td>diluido a 1x TBS en agua tratada con DEPC</td></tr><tr><td>Anticuerpo X (no revelado)</td><td></td><td></td><td>anticuerpo cegado debido a la confidencialidad</td></tr><tr><td>Agua tratada con DEPC</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9922</td><td>Se puede utilizar otro</td></tr><tr><td>Acondicionamiento celular DISCOVERY ( CC1)</td><td>Ventana</td><td>950-500</td><td></td></tr><tr><td>DISCOVERY Cy5 Kit</td><td>Ventana</td><td>760-238</td><td>Denominado Cy5</td></tr><tr><td>DISCOVERY FAM Kit</td><td>Ventana</td><td>760-243</td><td>Denominado</td></tr><tr><td>FAM DISCOVERY Goat Ig Block</td><td>Ventana</td><td>760-6008</td><td>Denominado Gt Ig Block</td></tr><tr><td>DISCOVERY OmniMap anti-MS HRP</td><td>Ventana</td><td>760-4310</td><td>Denominado OMap anti-MS HRP</td></tr><tr><td>DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP</td><td>Ventana</td><td>760-4311</td><td>Denominado OMap anti-Rb</td></tr><tr><td>HRP DISCOVERY Rhodamine 6G Kit</td><td>Ventana</td><td>760-244</td><td>Denominado Rhodamine 6G</td></tr><tr><td>DISCOVERY ULTRA Sistema Automatizado de Preparación de Portaobjetos</td><td>Ventana</td><td>05 987 750 001 / N750-DISU-FS</td><td>Referido como autotinción en el manuscrito</td></tr><tr><td>FAP [EPR20021] Anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>Ab207178</td><td></td></tr><tr><td>GeoMx Digital Spatial Profiler</td><td>NanoString</td><td>GMX-DSP-1Y</td><td>Denominado plataforma de perfilado espacial en el manuscrito</td></tr><tr><td>Cámara de humedad</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>Se puede utilizar otro</td></tr><tr><td>Anticuerpo Pan-Citoqueratina [AE1/AE3]</td><td>Abcam</td><td>Ab27988</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Python Python</td><td></td><td>Análisis estadístico</td></tr><tr><td>Tampón de reacción (10x)</td><td>Ventana</td><td>950-300</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis estadístico</td><td>GraphPad</td><td>Prism 7</td><td>Análisis estadístico</td></tr><tr><td>SYTO 64</td><td>ThermoFisher</td><td>S11346</td><td></td></tr><tr><td>ULTRA Acondicionamiento celular (ULTRA CC2)</td><td>Ventana</td><td>950-223</td><td></td></tr><tr><td>Ventana Diluyente de anticuerpos con caseína</td><td>Ventana</td><td>760-219</td><td>Referido como diluyente especificado en el manuscrito</td></tr><tr><td>Ventana Dispensador primario de anticuerpos</td><td>Ventana</td><td></td><td>El número de catálogo depende del número de dispensador</td></tr></tbody></table>

perfil espacial de la expresión de proteínas y arn en tejidos: un enfoque para ajustar la microdisección virtual

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

La multiplexación permite la evaluación de varios marcadores en el mismo tejido al tiempo que proporciona un contexto espacial. Las tecnologías de Spatial Omics permiten la multiplexación de proteínas y ARN mediante el aprovechamiento de anticuerpos y sondas oligomarcados foto-divisorias, respectivamente. Los oligos se escinden y cuantifican a partir de regiones específicas a través del tejido para dilucidar la biología subyacente. Aquí, el estudio demuestra que los protocolos automatizados de visualización de anticuerpos personalizados se pueden utilizar para guiar la selección del ROI junto con los ensayos de proteómica espacial. Este método específico no mostró un rendimiento aceptable con los ensayos de transcriptómica espacial. El protocolo describe el desarrollo de un ensayo inmunofluorescente (IF) 3-plex para la visualización de marcadores en una plataforma automatizada, utilizando amplificación de señal de tiramida (TSA) para amplificar la señal fluorescente de un objetivo de proteína dado y aumentar el grupo de anticuerpos para elegir. El protocolo de visualización se automatizó utilizando un ensayo 3-plex completamente validado para garantizar la calidad y la reproducibilidad. Además, se evaluó el intercambio de DAPI por colorantes SYTO para permitir la obtención de imágenes de ensayos de FI basados en TSA en la plataforma de perfiles espaciales. Además, probamos la capacidad de seleccionar pequeños ROI utilizando el ensayo de transcriptómica espacial para permitir la investigación de áreas de interés altamente específicas (por ejemplo, áreas enriquecidas para un tipo de célula determinado). Se recolectaron ROI de 50 μm y 300 μm de diámetro, lo que corresponde a aproximadamente 15 células y 100 células, respectivamente. Las muestras se hicieron en bibliotecas y se secuenciaron para investigar la capacidad de detectar señales de pequeños ROI y regiones específicas del perfil del tejido. Determinamos que las tecnologías de proteómica espacial se benefician enormemente de los protocolos automatizados y estandarizados para guiar la selección del ROI. Si bien este protocolo de visualización automatizada no era compatible con los ensayos de transcriptómica espacial, pudimos probar y confirmar que poblaciones celulares específicas pueden detectarse con éxito incluso en pequeños ROI con el protocolo de visualización manual estándar.

Protocolo de visualización automatizado para guiar la selección del ROI En este documento, presentamos el uso de un protocolo IF automatizado y personalizado basado en TSA para visualizar el tejido y seleccionar ROI específicos. El desarrollo del panel de visualización utilizando melanoma y piel humana normal como tejidos de control consistió en pruebas de estabilidad de epítopos, ajuste fino de las intensidades de los marcadores y evaluación de sangrado a través de controles de dejar uno fuera. Para ...

Aquí, describimos un protocolo para ajustar las regiones de interés (ROI) para las tecnologías de Spatial Omics para caracterizar mejor el microambiente tumoral e identificar poblaciones celulares específicas. Para los ensayos proteómicos, los protocolos personalizados automatizados pueden guiar la selección del ROI, mientras que los ensayos transcriptómicos se pueden ajustar utilizando ROI tan pequeños como 50 μm.

Perfil espacial de la expresión de proteínas y ARN en tejidos: un enfoque para ajustar la microdisección virtual

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Este protocolo ayuda a guiar la selección de regiones de interés para las tecnologías ómicas espaciales, lo que permite una caracterización más específica de tejidos o poblaciones celulares. Un protocolo automatizado para la selección de ROI en ensayos proteómicos es más robusto y reproducible que los protocolos manuales, y el uso de ROI de 50 micrómetros para ensayos transcriptómicos permite perfilar poblaciones celulares específicas. Comience con la programación del autotinente para aplicar anticuerpos de visualización fluorescente.En el software autostainer, haga clic en el botón de inicio y elija Protocolos. Luego haga clic en Crear / Editar protocolos y seleccione RUO Discovery Universal como procedimiento. Haga clic en Primera secuencia, luego seleccione Deparafinación, seguido de Depar v2.Para Temperatura media, elija 72 grados centígrados, luego haga clic en Pretratamiento y seleccione Acondicionamiento celular y depósito CC1. Para Temperatura muy alta, elija 100 grados centígrados, luego haga clic en CC1 ocho minutos y continúe haciendo clic hasta que se seleccione CC1 64 minutos. Haga clic en Inhibidor, luego seleccione DISCOVERY Inhibitor y, para Tiempo de incubación, elija ocho minutos.Luego haga clic en Anticuerpo, seguido de Incubación de anticuerpos de alta temperatura. Para baja temperatura, elija 37 grados centígrados. Para Anticuerpo, elija el ANTICUERPO 6 de la etiqueta del dispensador.En Plus Incubation Time (Tiempo de incubación Plus), seleccione 32 minutos. Haga clic en Multimer HRP, luego seleccione Multimer HRP Blocker. Luego, para Antibody Blocking, elija Gt Ig Block.Y para el tiempo de incubación, elija cuatro minutos. A continuación, en Multimer HRP Reagent, seleccione OMap Anti-Rb HRP y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 16 minutos. Luego haga clic en Cy5, y para el tiempo de incubación largo, elija cero hora, ocho minutos.Haga clic en Secuencia dual y elija Desnaturalización de anticuerpos. Luego seleccione Antibody Denature CC2-1, y para una temperatura muy alta, elija 100 grados centígrados. Asegúrese de que el tiempo de incubación sea de ocho minutos.A continuación, haga clic en DS Inhibitor y seleccione Neutralizar. Haga clic en DS Antibody, y para Very Low Temperature, elija 37 grados centígrados. Luego, en Anticuerpo, elija ANTICUERPO 3 en la etiqueta del dispensador.Y para Plus Incubation Time, seleccione 32 minutos. Haga clic en DS Multimer HRP y elija DS Multimer HRP Blocker. Luego, para Antibody Blocking, seleccione Gt Ig Block y, en Incubation Time, elija cuatro minutos.A continuación, en Multimer HRP Reagent, seleccione OMap anti-Ms HRP y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 16 minutos. Luego haga clic en DS Rhodamine 6G, y para el tiempo de incubación largo, elija cero hora, ocho minutos. Haga clic en Triple tinción y seleccione Desnaturalización de anticuerpos TS, luego seleccione Desnaturalización de anticuerpos CC2-2, y para Temperatura muy alta, seleccione 100 grados centígrados.Asegúrese de que el tiempo de incubación sea de ocho minutos. A continuación, haga clic en Inhibidor de TS y seleccione TS Neutralize. Haga clic en Cuerpo TS y, para Temperatura muy baja, seleccione 37 grados centígrados.Luego, en Anticuerpo, seleccione el ANTICUERPO 7 de la etiqueta del dispensador y, en Plus Incubation Time, seleccione 32 minutos. Haga clic en TS Multimer HRP y elija TS Multimer HRP Blocker. Luego, para Antibody Blocking, seleccione Gt Ig Block y, en Incubation Time, elija cuatro minutos.A continuación, en Multimer HRP Reagent, seleccione OMap Anti-Rb HRP y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 16 minutos. Luego haga clic en TS FAM y, para el tiempo de incubación largo, elija cero horas, ocho minutos. Haga clic en Guardar y agregue un título al protocolo.Seleccione un número de protocolo, agregue un comentario y haga clic en Activo, seguido de Guardar. Secciones de tejido humano fijadas en parafina fijadas en formalina adquiridas por el vendedor de pasteles en un horno a 70 grados centígrados durante 20 a 60 minutos. Mientras se hornean las diapositivas, imprima etiquetas haciendo clic en Crear etiqueta en el software de tinción automática.A continuación, haga clic en Protocolos, seleccione el número de protocolo y haga clic en Cerrar / Imprimir. Agregue información relevante en la etiqueta de la diapositiva y haga clic en Imprimir. Retire los portaobjetos del horno y déjelos enfriar a temperatura ambiente.Aplique las etiquetas de protocolo previamente impresas a las diapositivas correspondientes. Cargue dispensadores de anticuerpos recargables con anticuerpos de acuerdo con los números de la etiqueta de anticuerpos. Diluir cada anticuerpo en el diluyente especificado y preparar los dispensadores de anticuerpos recargables.Reúna los dispensadores de reactivos precargados de bloqueo, detección y amplificación y colóquelos en la bandeja de reactivos del instrumento. Cargue diapositivas en los cajones deslizantes y haga clic en En ejecución, seguido de Sí. Confirme el inicio de la ejecución comprobando la duración de la ejecución en el software autostainer.Al día siguiente, asegúrese de completar la carrera observando las luces verdes intermitentes en las ranuras de los cajones deslizantes. Luego retire los portaobjetos del instrumento y enjuague los portaobjetos vigorosamente en un tampón de reacción 1x hasta que la solución de deslizamiento de la cubierta líquida se elimine por completo. Reemplace SYTO 13 con SYTO 64 a 5.000 nanomolares para permitir la integración de fluoróforos.Diluir SYTO 64 en 1x TBS e incubar en una cámara de humedad durante 15 minutos. Utilice FITC para DISCOVERY Fam y establezca la exposición en 200 milisegundos. Utilice Cy3 para DISCOVERY Rhodamine 6G y establezca la exposición en 200 milisegundos.Use Texas Red para SYTO 64 y establezca la exposición en 50 milisegundos. Especifique SYTO 64 como canal de enfoque y, por último, utilice Cy5 para DISCOVERY Cy5. Ajuste la exposición a 200 milisegundos y guarde los cambios.Hornea las secciones de pellets de células embebidas en parafina fijadas en formalina en un horno a 70 grados centígrados durante 20 a 60 minutos. Escanee diapositivas en la plataforma de perfiles espaciales y seleccione tamaños de 50 micrómetros y 300 micrómetros. El protocolo de visualización automatizada se desarrolló incluyendo controles de dejar uno fuera para confirmar que no había sangrado de los canales vecinos.El mapa de calor log 2 de todos los marcadores incluidos en el ensayo de proteómica espacial que compara el protocolo manual pancitoqueratina CD 45 en negro con el protocolo 3-plex automatizado en gris muestra un valor R de Spearman de 0.88. De los 31 anticuerpos utilizados en los ensayos, 23 anticuerpos tenían un valor R de Spearman mayor o igual a 0,5. El mapa de calor log 2 de los objetivos seleccionados incluidos en el ensayo de transcriptómica espacial que comparó el protocolo manual pancitoqueratina CD 45 en negro con el protocolo automatizado 3-plex en gris mostró diferencias en estos valores.Los datos de secuenciación para el protocolo de visualización automatizada 3-plex presentaron valores más bajos en comparación con el protocolo de visualización manual pancitoqueratina CD 45, lo que también se refleja en los bajos valores R de Spearman de 0,15. Además, se observó una pérdida de rango dinámico al usar el protocolo automatizado de visualización 3-plex. La detección de pequeños ROIs en el protocolo de transcriptómica espacial se realizó mediante la selección de regiones circulares de interés a 50 micrómetros y 300 micrómetros de diámetro Los recuentos de ARN para objetivos seleccionados en diferentes líneas celulares fueron comparables entre las dos regiones de tamaños de interés después de la normalización.Este protocolo para paneles de visualización automatizada puede ser adaptado por los investigadores mediante el intercambio de marcadores con el fin de desarrollar paneles que definan con precisión los ROI para responder a sus preguntas de proteómica espacial.

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Preparación y procesamiento de arterias calcificadas con morfología y ARN preservados para perfilado espacial digital

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los<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

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Perfil espacial de la expresión de proteínas y ARN en tejidos: un enfoque para ajustar la microdisección virtual

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