Name: Aislamiento de células linfoides innatas uterinas para análisis por citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprende a aislar células linfoides uterinas de ratones mediante digestión enzimática y gradientes de densidad para citometría de flujo. Este protocolo preserva la viabilidad celular y permite el análisis funcional de subpoblaciones linfoides en tejido uterino.

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Agradecemos a los miembros anteriores y actuales del equipo que han ayudado a desarrollar este método, incluidos Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipovic y Anita Qualls. Esta investigación fue financiada por el Fideicomiso Wellcome [Número de subvención 200841/Z/16/Z] y el Consejo de Investigación Médica (MR/P001092/1). A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a cualquier versión del Manuscrito Aceptado por el Autor que surja de esta presentación.

Todos los experimentos con animales descritos en este documento se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 bajo PP2363781 emitida por el Ministerio del Interior del Reino Unido. El protocolo a continuación consta de varias secciones que comienzan con la cría de ratones y terminan con la tinción para el análisis FACS. La figura 3 refleja los principales pasos del protocolo. Los materiales utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla de materiales.
1. Cría general de ratones, apareamiento y disección
<ol><li>Mantenga a los ratones hembra de 7-14 semanas de edad bajo condiciones específicas libres de patógenos (SPF) y alojados en grupo (típicamente 4-6 hembras según el tamaño de la jaula y el peso del animal), durante 10-14 días para desencadenar el efecto Lee-Boot, lo que resulta en la sincronización del estro17.</li>
	<li>Mantenga a los machos de semental en condiciones de FPS, en una sola casa y descansados durante al menos 48 h entre cada apareamiento (tiempo para la regeneración de los espermatozoides). Es preferible usar machos de sementales experimentados de 3-4 meses de edad, ya que generalmente son más eficientes que los jóvenes.</li>
	<li>Para aumentar la probabilidad de que las hembras queden embarazadas, introduzca la ropa de cama sucia de la jaula de un macho en la jaula de la hembra 3 días antes del apareamiento. Esto desencadena el efecto Whitten18 por la exposición a feromonas de orina masculinas, y da como resultado un estro sincronizado, así como una mayor receptividad para el apareamiento.</li>
	<li>En el día 0 (D0), configure los ratones para el apareamiento usando un macho de semental por cada dos hembras; considere una tasa de enchufe de aproximadamente 20% -25%. NOTA: El apareamiento probablemente ocurrirá por la noche, ya que los ratones son animales nocturnos.</li>
	<li>En la mañana siguiente al apareamiento (D0.5), compruebe la presencia de un tapón vaginal, que es un indicador de cópula (Figura 4). El tapón vaginal es un agregado de la eyaculación masculina y generalmente persiste hasta 8-24 h después del apareamiento. Revise los enchufes temprano en la mañana.</li>
	<li>Consolide las hembras enchufadas en una nueva jaula y asigne. Devolver a los machos a sus jaulas para descansar.</li>
	<li>En D9.5 o 10.5 después del apareamiento, prepare tubos de 5 ml con 1 ml de HBSS estéril 1x (con Mg2+ y Ca2+) para la recolección de tejido y colóquelos en hielo.</li>
	<li>Proceder a la eutanasia animal por luxación cervical, seguida de exsanguinación para confirmar la muerte.</li>
	<li>Trabaje en un ambiente estéril si la aplicación aguas abajo lo requiere. Inmediatamente después de la eutanasia, limpie el cuerpo del ratón con etanol al 70% y proceda a la disección debajo de un gabinete de flujo laminar con instrumentos estériles.</li>
	<li>Diseccionar el útero embarazada libre de grasa mesometrial (Figura 5) y colocar todo el útero en una sonda de 5 ml preparada y debidamente etiquetada. Mantenga los tubos en hielo.</li>
</ol>2. Digestión mecánica y enzimática del útero
<ol><li>Para preparar la solución de digestión enzimática, mezcle 3 ml por útero de HBSS 1x estéril con 30 μg/ml de DNAse y 0,1 unidad Wünsch (WU)/mL de Liberase DH o 0,52 WU/mL de Liberase TM. Coloque la solución en un baño de agua a 37 °C. NOTA: Se pueden utilizar tanto Liberase TM como Liberase DH. La elección de uno sobre el otro debe guiarse por su efecto potencial sobre los epítopos reconocidos por los anticuerpos utilizados para el posterior análisis de citometría de flujo. PRECAUCIÓN: Si usa enzimas liofilizadas, trabaje bajo el capó.</li>
	<li>Preparar 20 mL de 5 mM de EDTA en PBS (sin Ca2+/Mg2+). Coloque la mitad de la solución a 37 °C en un baño de agua y la otra mitad en hielo.</li>
	<li>Debajo de un gabinete de flujo laminar, retire suavemente la grasa que rodea el útero embarazada con instrumentos estériles en una placa de Petri estéril. No permita que el tejido se seque.</li>
	<li>Diseccionar cada sitio de implantación con instrumentos estériles para extraer los fetos (estructura translúcida en forma de caballito de mar, de alrededor de 1 mm de longitud) (Figura 6A). Descarta los fetos.</li>
	<li>Devuelva el útero a su colección original de tubo de 5 ml y exprima el tejido usando tijeras directamente en el tubo de 5 ml y el medio de recolección. Mantenga los tubos en hielo todo el tiempo entre los procedimientos.</li>
	<li>Coloque los tubos de 5 ml que contienen el tejido picado en un baño de agua a 37 °C.</li>
	<li>Agregue 3 ml de mezcla de digestión enzimática caliente a cada muestra para que el volumen total de líquido en el tubo sea de 4 ml (1 ml de medio de recolección con el útero picado y 3 ml de solución de digestión enzimática). Incubar los tubos de 5 ml durante 30 min a 37 °C con agitación para mejorar la actividad de digestión enzimática.</li>
	<li>Vórtice los tubos de 5 ml y colóquelos sobre hielo para inhibir la acción de las enzimas. Luego, posteriormente, transfiera el contenido a tubos de centrífuga de 15 ml debidamente etiquetados.</li>
	<li>Enjuague todo de los tubos de 5 ml en los tubos de centrífuga de 15 ml con 10 ml de solución helada de EDTA PBS de 5 ml.</li>
	<li>Centrifugar los tubos centrífugos de 15 ml que contienen los tejidos digeridos durante 10 min a 400 x g.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante, mueva suavemente el pellet y luego vuelva a suspenderlo en 10 ml de solución de EDTA PBS tibia (37 °C) de 5 mM.</li>
	<li>Incubar las muestras en los tubos centrífugos de 15 ml a 37 °C con agitación durante 15 min para eliminar el medio de digestión sobrante y reducir la aglomeración celular.</li>
	<li>Vórtice las muestras en alto durante 10 s para facilitar aún más la disociación tisular.</li>
</ol>3. Procesamiento del útero en una suspensión de una sola célula
<ol><li>Usando el émbolo de una jeringa estéril de 1 ml, fuerce el tejido digerido a través de un colador de 70 μm sobre un tubo de centrífuga de 50 ml debidamente etiquetado y estéril para eliminar los grupos celulares y el tejido no disociado.</li>
	<li>Lave el colador varias veces con un total de 10 ml de PBS frío para recoger todas las células.</li>
	<li>Gire el tubo centrífugo de 50 ml durante 10 minutos a 400 x g. NOTA: Realice los pasos adicionales utilizando la Opción A o la Opción B. La Opción A permite un mejor enriquecimiento de los linfocitos con menos desechos y contaminación de células estromales que la Opción B. Sin embargo, la opción B da un mayor rendimiento de células inmunes debido a una menor pérdida celular y menos variabilidad del rendimiento celular entre muestras. La opción B también es más fácil de realizar técnicamente. Por lo tanto, dependiendo de la preferencia, continúe con la Opción A o la Opción B.<ol>
<li>Los pasos para la opción A son los siguientes.<ol>
<li>Etiquete un tubo de centrífuga estéril de 15 ml por muestra que contenga 5 ml de Percoll isotónico al 80% (v/v) diluido en PBS.</li>
			<li>Después del centrifugado, deseche el sobrenadante del tubo centrífugo de 50 ml. Use un pipet boy para resuspendir cada pellet en 8 ml de Percoll isotónico al 40% (v / v) en PBS.</li>
			<li>Use un pipet boy a baja velocidad para superponer cuidadosamente el pellet resuspendido en la solución de Percoll al 40% sobre la solución de Percoll al 80%. Pipeta lenta y continuamente; mantenga el tubo de 15 ml en un ángulo de 45° (Figura 6B).</li>
			<li>Sin perturbar la superposición, centrífuga los tubos de centrífuga de 15 ml durante 20 min a 850 x g, a temperatura ambiente (aceleración media y rotura mínima).</li>
			<li>Retire cuidadosamente los tubos de la centrífuga sin perturbar las capas de Percoll (Figura 6C).</li>
			<li>Sin perturbar el anillo de leucocitos en la interfaz de las dos soluciones de Percoll, use una pipeta Pasteur estéril para descartar todos, excepto aproximadamente 0.5-1 ml de la capa superior de Percoll.</li>
			<li>Mientras intenta succionar una cantidad mínima de solución de Percoll (hasta 4-5 ml en total), recoja cuidadosamente el anillo de leucocitos y transfiera las células a un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml marcado.</li>
			<li>Rellene cada muestra con 10 ml de medio RMPI-1640 estéril suplementado con un 10% de FBS inactivado por calor.</li>
			<li>Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C.</li>
			<li>Deseche el sobrenadante y proceda a la lisis de glóbulos rojos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Los pasos para la opción B son los siguientes.<ol>
<li>Etiquete un tubo de centrífuga estéril de 15 ml por muestra.</li>
			<li>Después del centrifugado, deseche el sobrenadante del tubo centrífugo de 50 ml. Use un pipet boy para resuspendir cada pellet con 8 mL de Percoll isotónico al 35% (v /v) en medio RPMI-1640.</li>
			<li>Transfiera las muestras a tubos centrífugos de 15 ml.</li>
			<li>Centrifugar las muestras a 940 x g durante 10 min a temperatura ambiente con aceleración media y rotura mínima.</li>
			<li>Aspire el sobrenadante con cuidado usando un aspirador o un niño pipeta (no invirtiendo el tubo).</li>
			<li>Resuspender el pellet en 14 ml de medio RPMI-1640 suplementado con FBS inactivado por calor al 10% y luego centrifugar la muestra a 500 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
			<li>Deseche el sobrenadante por aspiración y proceda a la lisis de glóbulos rojos.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4.Lisis de glóbulos rojos
<ol><li>Para lisar los glóbulos rojos, vuelva a suspender las muestras en 3 ml de 1 solución de lisado de glóbulos rojos e incube durante 3 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Agregue 10 ml de PBS en las muestras para detener la reacción.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 400 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Agregue 10 ml de PBS y repita el paso 4.3.</li>
	<li>Resuspender cada pellet en 1 ml de medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS inactivado por calor.</li>
	<li>Pase las muestras a través de coladores de células estériles de 70 μm.</li>
	<li>Realice el recuento de células utilizando azul tripano y una cámara Neubauer según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Ajuste la concentración de la suspensión celular a 1-2 millones de células en 100 μL de PBS o medio.</li>
</ol>5. Estrategia y controles de diseño de paneles
NOTA: El panel descrito en este documento es adecuado para la discriminación de células uILC1, trNK y cNK y fue diseñado para ser utilizado en un BD LSRFortessa de 5 láseres. Se pueden hacer modificaciones menores para estudiar diferentes poblaciones celulares y usar fluorocromos alternativos. Se recomienda comprobar la configuración del instrumento, utilizando anticuerpos titulados para una separación óptima, consultando el índice de brillo del fabricante y utilizando los colorantes más brillantes para antígenos de baja expresión como NKp46, y siguiendo las pautas generales19. Se recomienda incluir un control de fluorescencia menos uno (FMO) para NKp46.
6. Tinción de células linfoides innatas para el fenotipado FACS
<ol><li>Transfiera 1-2 millones de células por pozo a una placa redonda de 96 pocillos.</li>
	<li>Gire la placa a 400 x g durante 3 min a 4 °C y deseche el sobrenadante colocándolo en un fregadero.</li>
	<li>Resuspend los gránulos celulares en 100 μL de PBS (libre de proteínas y azidas) utilizando una pipeta multicanal. NOTA: Asegúrese de que el PBS no contenga azida de sodio, ni Tris, ni proteínas para el paso siguiente.</li>
	<li>Repita el paso 6.2.</li>
	<li>Resuspend células en 50 μL de colorante de viabilidad fijable diluido en PBS (libre de proteínas y azidas) (1:1.000). Incubar las células a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. NOTA: Asegúrese de que el PBS no contenga azida de sodio, ni Tris, ni proteínas como FBS o BSA, ya que esto puede resultar en una disminución de la intensidad de tinción de las células muertas y / o un aumento de la tinción de fondo para las células vivas. PRECAUCIÓN: Si el tinte de viabilidad está en polvo, úselo debajo del capó.</li>
	<li>Agregue 150 μL de PBS, resuspenda las celdas con una pipeta multicanal y, a continuación, repita el paso 6.2.</li>
	<li>Resuspend las células en 25 μL de FACS Buffer (PBS suplementado con 1% de BSA o 2% de FBS) que contiene reactivo de bloqueo del receptor Fc. Incubar las células durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Añadir 25 μL de un cóctel de anticuerpos de superficie. NOTA: Siempre titule los anticuerpos y optimice el panel de anticuerpos antes del experimento.</li>
	<li>Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 20 min en la oscuridad.</li>
	<li>Agregue 150 μL de tampón FACS a cada pocillo, mezcle bien y luego repita el paso 6.2.</li>
	<li>Repita el paso 6.10. NOTA: Realice otros pasos con la opción A o la opción B. Utilice la opción A para teñir las celdas con marcadores de superficie. Utilice la opción B para estudiar los marcadores intracelulares mediante citometría de flujo.<ol>
<li>Los pasos para la opción A son los siguientes.<ol>
<li>Resuspendir las muestras en 100 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) por pozo e incubar durante 20 min a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: Use PFA debajo del capó. Consulte la hoja de seguridad para desechar los desechos u objetos de PFA que hayan entrado en contacto con PFA (por ejemplo, pipetas) de forma segura.</li>
			<li>Repita el paso 6.2, dos veces. PRECAUCIÓN: No lo descarte introduciendo en el fregadero aquí, ya que contiene PFA. Aspire con una pipeta y deseche los residuos según la hoja de seguridad.</li>
			<li>Resuspend las muestras en 200 μL de PBS.</li>
			<li>Transfiera las muestras a tubos FACS etiquetados y recargue con 100 μL de PBS. Mantenga los tubos en hielo o en un refrigerador hasta que se procesen con el análisis FACS. Adquirir las muestras en un citómetro de flujo en un plazo de 24 h.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Los pasos para la opción B son los siguientes.<ol>
<li>Resuspender las muestras en 100 μL de solución de fijación/permeabilización por pocillo (que contiene paraformaldehído) e incubar durante 20 min a 4 °C. PRECAUCIÓN: Use PFA debajo del capó. Consulte la hoja de seguridad para desechar los desechos u objetos de PFA que hayan entrado en contacto con PFA (por ejemplo, pipetas) de forma segura.</li>
			<li>Repita el paso 6.2. PRECAUCIÓN: No lo descarte introduciendo en el fregadero aquí, ya que contiene PFA. Aspire con una pipeta y deseche los residuos según la hoja de seguridad.</li>
			<li>Agregue 200 μL de 1 tampón de permeabilización / lavado, mezcle bien y luego repita el paso 6.2.</li>
			<li>Repita el paso 6.11.2.3.</li>
			<li>Resuspend las células fijas y permeabilizadas en 50 μL de 1x tampón de permeabilización/lavado que contiene mezcla de anticuerpos para la tinción intracelular.</li>
			<li>Incubar las muestras a 4 °C durante 30 min en la oscuridad.</li>
			<li>Agregue 200 μL de 1 solución de permeabilización / lavado, mezcle bien y luego repita el paso 6.2.</li>
			<li>Repita el paso 6.11.2.7.</li>
			<li>Resuspend las muestras en 200 μL de PBS.</li>
			<li>Transfiera las muestras a tubos FACS etiquetados y recargue con 100 μL de PBS. Mantenga los tubos en hielo o en un refrigerador hasta que se procesen con el análisis FACS. Adquirir las muestras en un citómetro de flujo en un plazo de 24 h. NOTA: Después de realizar este protocolo, la suspensión de células deciduales está lista para el análisis FACS. Se recomienda registrar tantos eventos como sea posible por muestra; se deben obtener al menos 1.000-3.000 eventos de una población parental para lograr resultados confiables.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+code+of+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological code of pregnancy.</a> Science. 365 (6456), New York, N.Y. 862-863 (2019).</li>
<li>Mor, G., Aldo, P., Alvero, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+immunological+and+microbial+aspects+of+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">The unique immunological and microbial aspects of pregnancy.</a> Nature reviews. Immunology. 17 (8), 469-482 (2017).</li>
<li>Croy, A., Yamada, A., DeMayo, F., Adamson, S. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCroy%2C+A+%22The+Guide+to+Investigation+of+Mouse+Pregnancy%22">The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy</a>. , Elsevier, Academic Press. (2014).</li>
<li>Filipovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+definition+of+group+1+innate+lymphoid+cells+in+the+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular definition of group 1 innate lymphoid cells in the mouse uterus.</a> Nature Communications. 9 (1), 4492(2018).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DBA-lectin+reactivity+defines+mouse+uterine+natural+killer+cell+subsets+with+biased+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">DBA-lectin reactivity defines mouse uterine natural killer cell subsets with biased gene expression.</a> Biology of Reproduction. 87 (4), 81(2012).</li>
<li>Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+NK+cells%3A+active+regulators+at+the+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Uterine NK cells: active regulators at the maternal-fetal interface.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 1872-1879 (2014).</li>
<li>Gaynor, L. M., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+natural+killer+cells%3A+Functional+distinctions+and+influence+on+pregnancy+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Uterine natural killer cells: Functional distinctions and influence on pregnancy in humans and mice.</a> Frontiers in Immunology. 8, 467(2017).</li>
<li>Sojka, D. K., Yang, L., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Uterine natural killer cells.</a> Frontiers in immunology. 10, 960(2019).</li>
<li>Wilkens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+NK+cells+regulate+endometrial+bleeding+in+women+and+are+suppressed+by+the+progesterone+receptor+modulator+asoprisnil%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Uterine NK cells regulate endometrial bleeding in women and are suppressed by the progesterone receptor modulator asoprisnil.</a> The Journal of Immunology. 191 (5), 2226-2235 (2013).</li>
<li>Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+%CE%B3+contributes+to+initiation+of+uterine+vascular+modification%2C+decidual+integrity%2C+and+uterine+natural+killer+cell+maturation+during+normal+murine+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interferon γ contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (2), 259-270 (2000).</li>
<li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+NK+cells+regulate+key+developmental+processes+at+the+human+fetal-maternal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface.</a> Nature Medicine. 12 (9), 1065-1074 (2006).</li>
<li>Chakraborty, D., Rumi, M. A. K., Konno, T., Soares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+direct+hemochorial+placentation+by+regulating+hypoxia-inducible+factor+dependent+trophoblast+lineage+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells direct hemochorial placentation by regulating hypoxia-inducible factor dependent trophoblast lineage decisions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16295-16300 (2011).</li>
<li>Crespo, ÂC., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+NK+cells+transfer+granulysin+to+selectively+kill+bacteria+in+trophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decidual NK cells transfer granulysin to selectively kill bacteria in trophoblasts.</a> Cell. 182 (5), 1125-1139 (2020).</li>
<li>Shmeleva, E. V., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+natural+killer+cells+at+the+intersection+between+reproduction+and+mucosal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Maternal natural killer cells at the intersection between reproduction and mucosal immunity.</a> Mucosal Immunology. , 1-15 (2020).</li>
<li>Kather, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neither+lymphotoxin+alpha+nor+lymphotoxin+beta+receptor+expression+is+required+for+biogenesis+of+lymphoid+aggregates+or+differentiation+of+natural+killer+cells+in+the+pregnant+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Neither lymphotoxin alpha nor lymphotoxin beta receptor expression is required for biogenesis of lymphoid aggregates or differentiation of natural killer cells in the pregnant mouse uterus.</a> Immunology. 108 (3), 338-345 (2003).</li>
<li>Croy, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+uterine+natural+killer+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of uterine natural killer cells in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 612, Clifton, N.J. 465-503 (2010).</li>
<li>Vander lee, S., Boot, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+pseudopregnancy+in+mice.+II%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+et+Pharmacologica+Neerlandica%22%5BJournal%5D)">Spontaneous pseudopregnancy in mice. II.</a> Acta Physiologica et Pharmacologica Neerlandica. 5 (2), 213-215 (1956).</li>
<li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+oestrous+cycle+of+the+mouse+by+external+stimuli+associated+with+the+male%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male.</a> The Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).</li>
<li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+%28second+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Licensing+of+natural+killer+cells+by+host+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Licensing of natural killer cells by host major histocompatibility complex class I molecules.</a> Nature. 436 (7051), 709-713 (2005).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li>
<li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+reproductive+status%2Fstages+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , Appendix 4, Appendix 4I (2009).</li>
<li>Doisne, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition%2C+development%2C+and+function+of+uterine+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Composition, development, and function of uterine innate lymphoid cells.</a> Journal of Immunology. 195 (8), Baltimore, Md. 3937-3945 (2015).</li>
<li>Peel, S. Fate of GMG Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeel%2C+S+%22Granulated+Metrial+Gland+Cells+Advances+in+Anatomy%2C+Embryology+and+Cell+Biology%22">Granulated Metrial Gland Cells Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology</a>. 115, Springer. Berlin. (1989).</li>
<li>Croy, B. A., vanden Heuvel, M. J., Borzychowski, A. M., Tayade, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+natural+killer+cells%3A+a+specialized+differentiation+regulated+by+ovarian+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Uterine natural killer cells: a specialized differentiation regulated by ovarian hormones.</a> Immunological Reviews. 214, 161-185 (2006).</li>
<li>Yadi, H., Burke, S., Madeja, Z., Hemberger, M., Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+receptor+repertoire+in+mouse+uterine+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Unique receptor repertoire in mouse uterine NK cells.</a> Journal of Immunology. 181 (9), Baltimore, Md. 6140-6147 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar ni conflictos de intereses.

El método contiene varios pasos críticos que se analizan a continuación. El primer paso crítico es obtener embarazos sincrónicos múltiples a medida que la frecuencia relativa de las poblaciones de leucocitos cambia a lo largo del embarazo. Tener múltiples presas en el mismo día gestacional permite repeticiones biológicas en los mismos experimentos o agrupar linfocitos de presas individuales para obtener un mayor número requerido para aplicaciones aguas abajo. El apareamiento cronometrado permite al investigador identificar la concepción dentro de un período de 24 horas. Aunque los ratones viven alrededor de 2,5 años, estarán en edad reproductiva de 4-7 semanas hasta los 6-8 meses de edad. Como los ratones más jóvenes generalmente producen cachorros más pequeños, los ratones hembra generalmente no se aparean hasta que tienen entre 6 y 8 semanas, y los ratones machos hasta que tienen entre 8 y 10 semanas. Dado que el estro dura aproximadamente 15 h en ratones y ocurre cada 4-5 días, la tasa de apareamiento típica (revelada por un tapón vaginal, ver Figura 4) es de alrededor del 25%. Por lo tanto, es importante utilizar ratones en celo y planificar números suficientes para obtener el número requerido de presas para un experimento determinado. La fase del ciclo del estro se puede determinar mediante citología de frotis vaginal22. La velocidad de tapón se puede mejorar descansando los machos 48 h antes del apareamiento y aprovechando el efecto Whitten18. Alternativamente, se puede administrar suero de yegua embarazada, que imita el efecto de la hormona endógena estimulante del folículo, induciendo la maduración de los ovocitos y, 42-50 h más tarde, gonadotropina coriónica humana, que imita el efecto de la hormona luteinizante endógena, induciendo la ovulación. Este tratamiento hormonal evita el requerimiento de estro y hace que prácticamente todas las hembras tratadas sean receptivas.
Un segundo paso crítico es garantizar la calidad de la tinción FACS. Los anticuerpos utilizados en la citometría de flujo siempre deben ser titulados y utilizados a la concentración óptima, y es necesario comprobar que la digestión enzimática no escinde epítopos antigénicos cruciales. Para evaluar si una enzima escinde un epítopo, se podrían teñir dos fracciones de la misma muestra en paralelo, una sometida a digestión enzimática y la otra mecánica. Del mismo modo, el uso de controles adecuados y tinciones individuales es crucial para obtener datos fiables. Para eventos raros, las cuentas se pueden usar para generar muestras de tinción única. Se recomienda no usar perlas para establecer voltajes, sino más bien una población de células que contengan linfocitos y otros leucocitos, como los esplenocitos. Si se usan perlas, es necesario valorar los anticuerpos para la tinción de perlas, por lo que la intensidad de fluorescencia de las perlas teñidas será comparable a la intensidad de fluorescencia de las células. En caso de dificultad para separar las células positivas de las negativas para un marcador en particular, también se puede utilizar un control FMO para facilitar la apertura de un marcador específico. En el caso de los marcadores intracelulares, se debe utilizar un control de isotipo, ya que la tinción intracelular podría dar lugar a anticuerpos residuales no unidos, que aún pueden estar presentes dentro de las células después de los pasos de lavado y, por lo tanto, aumentar la señal de fondo. Se recomienda ejecutar las muestras dentro de las 24 h posteriores a la fijación de las células para obtener los mejores resultados en fenotipado mediante análisis FACS, ya que la autofluorescencia aumenta significativamente con el tiempo y la intensidad de fluorescencia de algunos anticuerpos puede disminuir con el tiempo.
Otro factor crucial a considerar es la aplicación posterior de la suspensión unicelular obtenida con el protocolo. Para los ensayos funcionales, es esencial trabajar en condiciones estériles. Del mismo modo, para estudios ómicos posteriores, es importante trabajar en estériles y libres de RNasa, DNasa y proteasa.
El protocolo presentado aquí se centra en el fenotipado de ILC del grupo 1, pero se puede adaptar para fenotipar otros tipos de células modificando el panel de anticuerpos. Se recomienda que todos los anticuerpos se prueben contra la suspensión celular digerida y no digerida para detectar la pérdida/alteración de los epítopos superficiales mediante el tratamiento enzimático. Del mismo modo, se pueden usar diferentes enzimas para digerir el tejido y aumentar el rendimiento celular, pero su efecto sobre epítopos antigénicos cruciales debe estudiarse cuidadosamente. Mientras que NKp46 es un buen marcador para las células NK esplénicas y funciona en todas las cepas de ratones de laboratorio, la expresión de NKp46 en células uNK en ratones C57BL/6 es considerablemente menor que en células NK del bazo. Es mejor manchar tanto para NK1.1 como para NKp46 simultáneamente. Si se van a comparar varios órganos directamente, se recomienda tratar todas las muestras por igual, incluso si la digestión enzimática no es necesaria para tejidos como el bazo o la médula ósea. Aunque el método presentado aquí es aplicable al útero no embarazada, el aislamiento del anillo de linfocitos por un gradiente de Percoll de dos fases será un desafío, y el rendimiento de las células aisladas puede ser demasiado bajo para un análisis FACS confiable y, por lo tanto, requerirá agrupar células aisladas del útero de ratones individuales no preñados23.
Existen limitaciones al protocolo a considerar para la interpretación de los datos. Como es el caso de todos los tejidos, los linfocitos circulantes provenientes de la sangre se aislarán junto con las células residentes en el tejido. Si la exclusión de los linfocitos circulantes es esencial para la interpretación de los datos, se puede realizar una tinción intravital para etiquetar las células circulantes. Además, una segunda limitación del protocolo es que algunas células se perderán, ya que no todas las células se pueden extraer del tejido. Los problemas más comunes y su solución de problemas se presentan en la Tabla 2.
Históricamente, el estudio de las células en los tejidos se ha basado en el examen histológico de las secciones de tejido. La excelente reseña de Sandra Peel24 resume el trabajo realizado a lo largo de más de 100 años hasta finales de los años 80. Las descripciones de células más tarde conocidas como células uNK aparecen en manuscritos publicados más de medio siglo antes de que se descubrieran los linfocitos. Por lo tanto, antes del descubrimiento de las células NK en 1975, y las células uNK se han indicado como células de glucógeno materno o células granuladas de la glándula auricular. Anne Croy ha hecho importantes contribuciones en el campo25 y amablemente enseñó al equipo la disección que había optimizado3, y que se utiliza actualmente. Aunque es fundamental para describir la morfología y la ubicación tisular de las células uNK, el examen histológico clásico se limita a la detección de solo unos pocos marcadores en las células de interés. En 2008 se describió un método basado en citometría de flujo para detectar simultáneamente múltiples marcadores en linfocitos uterinos26. Este es esencialmente el método que se ha descrito en este artículo. Tecnologías más recientes como la transcriptómica espacial y la obtención de imágenes por citometría de masas combinan el poder de la histología y la citometría de flujo, permitiendo tanto la detección simultánea de múltiples genes o proteínas, respectivamente, como la preservación de la arquitectura tisular normal.
Las aplicaciones del método descrito aquí son múltiples e incluyen fenotipado FACS, ensayo funcional (como ELISPOT, degranulación o ensayos citotóxicos), clasificación celular y transcriptómica o proteómica posterior. Otras aplicaciones que podrían desarrollarse en base a este método incluyen el cultivo y la expansión de células NK deciduales después de la clasificación o enriquecimiento celular por agotamiento negativo. Actualmente, no existe un protocolo para cultivar y expandir las células uNK de ratón y preservar su viabilidad y funcionalidad durante un período prolongado, de manera similar a las células NK humanas que se pueden cultivar y expandir durante 7-14 días mediante la adición de IL-2 o una combinación de IL-12 e IL-15. La optimización de dicho método para células uNK de ratón proporcionaría más flexibilidad al realizar ensayos funcionales y permitiría probar múltiples condiciones con un número de células más alto. Por otro lado, se sabe que las condiciones de cultivo modifican el fenotipo único de los linfocitos y potencialmente su función también.

Aquí se describe un método simple para obtener un alto rendimiento de linfocitos innatos uterinos del útero embarazada individual. Este método preserva la expresión de la superficie proteica y la funcionalidad de los linfocitos innatos uterinos y es adecuado para aplicaciones posteriores como fenotipado FACS, RNAseq, proteómica o ensayos funcionales. Aquí, la atención se centra en el fenotipado de los uILCs del grupo 1 por citometría de flujo.
El útero está compuesto por tres capas: el endometrio, el miometrio y el perimetrio (Figura 1). El endometrio es la mucosa, que recubre la luz del útero. La progesterona, producida por el cuerpo lúteo, convierte el endometrio en decidua. El miometrio está compuesto por dos capas de músculo liso que forman la pared uterina. El perimetrio es la serosa que envuelve el útero y lo conecta con el peritoneo a través del ligamento ancho llamado mesometrio. En una sección transversal del útero, la parte opuesta a la luz se llama lado mesometrial, mientras que la parte cercana a la luz se llama lado antimesometrial. Una variedad de leucocitos maternos pueblan el endometrio y la decidua, incluyendo varios tipos de células, donde las células inmunes innatas representan la gran mayoría de las células. Las células linfoides innatas (ILC), los macrófagos, las células dendríticas (DC), así como los linfocitos T CD4+ y CD8+, las células T reguladoras (Tregs) y las células B raras, pueden desempeñar un papel importante en la regulación del entorno uterino a lo largo del embarazo1,2. Las ILC en el útero se encuentran no solo en la mucosa, sino también en el miometrio en ratones. Incluyendo los tres grupos de ILC, el útero es de hecho el órgano más densamente poblado por ILC del grupo 1. Con la transformación estructural de los tejidos uterinos a lo largo de la gestación, el número y la proporción de leucocitos uterinos también cambian (ver Figura 2A para un ejemplo de variaciones en el porcentaje de subconjuntos uILC del grupo 1)3,4.
Cuando se hace referencia a los ratones en este documento, se refiere a la cepa C57BL / 6 de ratones de laboratorio consanguíneos. Los ratones de raza avanzada (por ejemplo, ratones NMRI) se utilizan a menudo en la investigación reproductiva debido a su alta tasa reproductiva. Sin embargo, el uso de cepas consanguíneas es necesario para generar resultados consistentes, y el fondo genético favorito del inmunólogo es C57BL / 6, también conocido como B6.
Aproximadamente el 30% de los leucocitos uterinos en las madres B6 a mitad de la gestación son células g1 uILCs, que se definen por citometría de flujo como células CD45+CD3-CD19-NK1.1+NKp46+ viables (Figura 2B): células NK proangiogénicas residentes en tejido (trNK), IFN-g productoras de NK convencional (cNK) y uILC14,5. El porcentaje de células uNK es aún mayor en humanos, alcanzando alrededor del 70% en el primer trimestre6. Hay más similitudes que diferencias entre uNK humano y ratón y uILC7,8. Aunque es importante tener en cuenta las diferencias, es útil integrar la información disponible sobre las dos especies. Cuando se combina la información obtenida de la investigación de la uILC en humanos y roedores de laboratorio, queda claro que las células NK ayudan en cambios homeostáticos esenciales para la biología del útero, incluyendo el mantenimiento de la integridad arterial9 y la remodelación de la arteria espiral10, así como la invasión de trofoblastos11,12. También desempeñan funciones específicas en la defensa contra patógenos13,14. En ratones y ratas, además de llenar la decidua alrededor del sitio de implantación, las células NK se acumulan entre las dos capas musculares del miometrio de las presas en una estructura transitoria conocida como el Agregado Linfoide Mesometrial del embarazo (MLAp)15 (Figura 1B), también conocida en el pasado como la glándula auricular, cuya función aún no se ha descubierto.
Aquí se describe un protocolo detallado del método utilizado en el laboratorio para aislar linfocitos del útero de ratones preñados utilizando una combinación de desagregación mecánica y digestión enzimática. Como todo el útero se utiliza en el método, los linfocitos aislados del útero durante la gestación son una mezcla de células deciduales y miometriales. Es posible una disección adicional de la decidua de la pared uterina y su MLAp, y se ha descrito antes16. El método descrito aquí fue desarrollado para obtener linfocitos uterinos preservando al mismo tiempo la expresión de la superficie de la proteína, la funcionalidad celular y la viabilidad. El resultado es una suspensión de una sola célula con un mínimo de residuos celulares y un rendimiento que generalmente oscila entre 1 y 5 millones de células a mediados de la gestación (10,5 días) para un útero embarazada. Las aplicaciones de este método abarcan el fenotipado por citometría de flujo, la clasificación celular para estudios transcriptómicos o proteómicos posteriores, estudios funcionales como la producción intracelular de citoquinas, la degranulación, ELISPOT o ensayos citotóxicos. El protocolo presentado aquí se centra en la identificación de ILC del grupo 1, pero se puede adaptar para otros tipos de células, como otras ILC, células T, células B, DC o macrófagos con modificaciones menores del panel de anticuerpos utilizado para el análisis DE FACS. El protocolo también se puede utilizar para aislar células de otros tejidos y para úteros no embarazadas agrupados.

<table><tbody><tr><td>70 y micro; filtros de células m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo CD19</td><td>BD</td><td>562701</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo CD3</td><td>BD</td><td>562600</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo CD45</td><td>BioLegend</td><td>103108</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo CD49a</td><td>BD</td><td>740262</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Roche (Sigma)</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo EOMES</td><td>eBioscience</td><td>12-4875-82</td><td></td></tr><tr><td>Fc block Trustain fcx</td><td>BioLegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10217-106</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Fix/Perm (parte del BD Cytofix/Kit de Fijación/Permeabilización Cytoperm)</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, calcio, magnesio, rojo sin fenol</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH</td><td>Roche (Sigma)</td><td>5401089001</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis Pharmlyse</td><td>BD</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo NK1.1</td><td>BioLegend</td><td>108739</td><td></td></tr><tr><td>NKp46&nbsp; anticuerpo</td><td>BioLegend</td><td>137608</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído 16% Solución (sin metanol)</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1026</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14030-048</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x (sin Ca2+ o Mg2+)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>VWR international</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de preseparación</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>RMPI-1640 medio + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Violet Tinte de viabilidad fijable</td><td>BioLegend</td><td>423113</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de células linfoides innatas uterinas para análisis por citometría de flujo

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Aquí se describe un método simple para aislar y fenotipar células linfoides innatas uterinas del grupo 1 de ratón (g1 uILCs) del útero embarazada individual mediante citometría de flujo. El protocolo describe cómo configurar el apareamiento del tiempo para obtener múltiples presas síncronas, la digestión mecánica y enzimática del útero embarazada, la tinción de suspensiones unicelulares y una estrategia FACS para fenotipar y discriminar a los uILC g1. Aunque este método inevitablemente pierde la información espacial de la distribución celular dentro del tejido, el protocolo se ha aplicado con éxito para determinar la heterogeneidad de uILC, su respuesta a los factores maternos y fetales que afectan el embarazo, su perfil de expresión génica y sus funciones.

Este es un método para aislar las células linfoides uterinas de ratones preñados y no preñados. Este método se puede utilizar para múltiples aplicaciones posteriores, como fenotipado FACS, clasificación celular, ensayos funcionales, ARN-seq y proteómica. El protocolo aquí demuestra cómo fenotipar el grupo 1 de las células linfoides innatas uterinas mediante citometría de flujo.

Aislamiento de células linfoides innatas uterinas para análisis por citometría de flujo

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...

Nuestro método permite evaluar la composición y las características funcionales de las diferentes subpoblaciones de linfocitos presentes en el tejido uterino de animales preñados y no preñados. Este protocolo permite el aislamiento de los linfocitos uterinos al tiempo que preserva la expresión superficial de proteínas, la viabilidad celular y la funcionalidad. Por lo tanto, es adecuado para una amplia gama de aplicaciones posteriores.La extracción del feto al comienzo del experimento y la recolección de leucocitos son pasos técnicamente desafiantes. Dado que es un experimento largo, se necesita atención y enfoque particulares una vez que haya alcanzado los pasos de tinción de anticuerpos. Para comenzar, transfiera el tejido del útero cosechado de una ratón hembra C57 negra C57 embarazada a una placa de Petri estéril, luego use instrumentos estériles elimine suavemente la grasa que rodea el tejido, teniendo cuidado de no dejar que el tejido se seque.Extraiga los fetos diseccionando cada sitio de implantación con instrumentos estériles, luego devuelva el útero a su tubo de recolección original de cinco mililitros que contiene un mililitro de medios de recolección. Usando tijeras, picar el tejido en el tubo de recolección, luego coloque el tubo en un baño de agua de 37 grados Celsius. A continuación, agregue tres mililitros de mezcla de digestión enzimática precalentada al tubo.Incubar el tubo durante 30 minutos a 37 grados centígrados con agitación para mejorar la actividad de digestión enzimática. Después de que se complete la incubación, vórtice el tubo y manténgalo en hielo para inhibir la actividad enzimática, luego transfiera el tejido digestivo a un tubo de centrífuga de 15 mililitros debidamente etiquetado. Enjuague el tubo de recolección de cinco mililitros con un total de 10 mililitros de solución de EDTA PBS de cinco milimolares helados para recolectar todo el tejido restante y transferirlo al tubo centrífugo de 15 mililitros.Centrifugue la muestra de tejido digerido durante 10 minutos a 400 veces G.Deseche el sobrenadante, mueva suavemente el gránulo y luego vuelva a suspenderlo en 10 mililitros de solución EDTA PBS de cinco milimolares precalentada. Para reducir la aglomeración celular, incube la muestra a 37 grados centígrados con agitación, seguido de vórtice en alto durante 10 segundos. Para eliminar grupos celulares en el tejido no asociado, coloque un colador de 70 micrómetros encima de un tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros, luego use el émbolo de una jeringa estéril de un mililitro, fuerce el tejido digerido a través del colador hacia el tubo.Lave el colador varias veces con un total de 10 mililitros de PBS frío para recolectar todas las células, luego pase el tubo centrífugo de 50 mililitros durante 10 minutos a 400 veces G.Después de desechar el sobrenadante, las células linfoides innatas pueden aislarse utilizando la opción A o la opción B.Para la opción A, resuspenda el pellet en cinco mililitros de 80% isotónico por llamada usando un voy de pipeta. Luego, usando el voy de pipeta a baja velocidad, superponga cuidadosamente ocho mililitros, 40% por solución de llamada, sobre el pellet resuspendido en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Pipete lenta y continuamente, manteniendo los 15 mililitros a un ángulo de aproximadamente 45 grados.Sin alterar la superposición, centrifuga el tubo durante 20 minutos a 850 veces G con aceleración media y roturas mínimas a temperatura ambiente. Una vez completada la centrifugación, retire cuidadosamente el tubo de la centrífuga sin perturbar las capas por llamada. A continuación, sin perturbar el anillo de leucocitos en la interfaz de las dos soluciones por llamada, use una pipeta pasteur estéril para descartar todas excepto 0.5 a un mililitro de la capa superior por llamada.Mientras intenta mantener la cantidad de solución por llamada aspirada en la pipeta al mínimo, recoja cuidadosamente el anillo de leucocitos y transfiera las células a un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros marcado. Agregue 10 mililitros de medio RPMI estéril suplementado con 10% de calor y FBS activado a las células, luego centrifugue las células durante cinco minutos a 500 veces G y cuatro grados Celsius. Deseche el sobrenadante y proceda a la lisis de glóbulos rojos.Para aislar las células usando la opción B, después de pasar el tejido digerido a través del colador celular y centrifugar el resultado en suspensión celular como se demostró anteriormente, resuspenda el pellet con ocho mililitros de 35% isotónico por llamada y medio RPMI, y transfiera las células a un tubo de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 940 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente con aceleración media y descansos mínimos. Luego, usando un aspirador o un voy de pipeta, aspire el sobrenadante con cuidado antes de volver a suspender el pellet en 14 mililitros de medio RPMI suplementado con 10% de calor y FBS activado.Centrifugar la muestra de nuevo durante cinco minutos a 500 veces G y cuatro grados centígrados, luego desechar el sobrenadante por aspiración y proceder a la lisis de glóbulos rojos. Para lisar los glóbulos rojos, vuelva a suspender la muestra en tres mililitros de una solución de lisado de glóbulos rojos X e incube durante tres minutos a temperatura ambiente, luego agregue 10 mililitros de PBS a la muestra para detener la reacción. Centrifugar el tubo a 400 veces G durante cinco minutos después de desechar el sobrenadante, agregar otros 10 mililitros de PBS y repetir la centrofugación.Resuspend el pellet en un mililitro de medio RPMI suplementado con FBS inactivado al 10% de calor, luego pase la suspensión en células a través de un colador celular estéril de 70 micrómetros. Después de contar las células, ajuste la concentración de la suspensión celular a uno a 2 millones de células en 100 microlitros de PBS y proceda a la tinción y al análisis de facs. Las ILC uterinas del grupo uno incluyen células NK convencionales, células NK residentes en tejidos y ILC del grupo uno con sus porcentajes que varían durante la vida y el embarazo.Estos subconjuntos se pueden discriminar mediante citometría de flujo al marcar primero las células sobre su capacidad para dispersar la luz, luego aislar las células CD 19 negativas CD 19 negativas y luego identificar las ILC del grupo uno que son NK 1.1 y NKP 46 positivas. Dentro de las ILC del grupo uno, las EM CD49A negativas positivas son células NK convencionales. Las células EMs positivas CD49A positivas son células NK residentes en el tejido.Y las células EMS negativas CD49 positivas son ILC uterinas del grupo uno. La tinción de linfocitos esplénicos y uterinos con anticuerpos anti NK P46 y anti NK 1.1 muestra que los linfocitos esplénicos expresan mayores cantidades de NKP 46 en su superficie que su contraparte uterina. En la disociación enzimática del tejido, los epítopos superficiales pueden alterarse dependiendo de las enzimas utilizadas en el medio de digestión.Por ejemplo, la tinción para el receptor MHC CD49 NKG2A es deficiente cuando se utiliza liberase TM. Sin embargo, la digestión con liberasa DH preserva el reconocimiento de NKG2A por el clon de anticuerpos 1611. Alrededor del 6,5% de las ILC del grupo uno presentes en muestras de tejido uterino en el día de gestación 8,5 son derivadas de la sangre.Los contaminantes sanguíneos se pueden excluir a través de la tinción intravital con anticuerpos anti CD45 conjugados con un fluorocromo. Al preparar reuniones de tiempo, debe tener en cuenta que los ratones son nocturnos. Por lo tanto, deben instalarse lo más tarde posible por la tarde, ya que el apareamiento ocurrirá durante la noche.También al seleccionar mujeres, debe asegurarse de que no tengan un tabique vaginal. Por lo general, hacemos análisis de citometría de flujo para observar muchas proteínas en el exterior de las células y dentro de las células. También hacemos extracción de ácido nucleico para estudiar la expresión génica, incluida la secuenciación de ARN.Y también logramos alrededor de ensayos funcionales para estudiar las respuestas de las células linfoides innatas uterinas.

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Investigación

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Inmunología e Infección

Un modo eficaz de aislar los linfocitos de ratón tracto genital se describe. Este método tiene la ventaja de digestión enzimática y separación por gradiente de Percoll para permitir el aislamiento eficiente. Esta técnica es también adaptable a para su uso en otras...

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En este estudio, presentamos un protocolo eficaz y reproducible para aislar las poblaciones inmunes del sistema respiratorio murino. También proporcionamos un método para la identificación de todas las células inmunes innatas y adaptativas que residen en los pulmones de ratones sanos, utilizando un panel de citometría de flujo basado en 9 colores.

Análisis citométrico de flujo para la identificación de las células inmunes innatas y adaptativas del pulmón murino

Las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2), implicadas en la inflamación tipo 2, participan principalmente en la respuesta a la infección por helmintos, enfermedades alérgicas, homeostasis metabólica y reparación de tejidos. En este estudio, se demuestra un procedimiento para aislar ILC2s de la mucosa nasal murina y detectar la expresión de CD226.

Aislamiento de células linfoides innatas del grupo 2 de la mucosa nasal del ratón para detectar la expresión de CD226

Aprende a aislar células linfoides uterinas de ratones mediante digestión enzimática y gradientes de densidad para citometría de flujo. Este protocolo preserva la viabilidad celular y permite el análisis funcional de subpoblaciones linfoides en tejido uterino.

Aislamiento de células linfoides innatas uterinas para análisis por citometría de flujo

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