Experimentos de RMN de alta presión para detectar estados conformacionales de baja altitud de proteínas

La alta presión es el método de elección para cambiar la población relativa de una muestra conformacional de proteínas. Es extremadamente útil para aislar y caracterizar estados conformacionales de alta energía. En comparación con todos los métodos de perturbación, como el pH o la temperatura, la perturbación de presión es fácil de aplicar y totalmente reversible.

También es una perturbación local, que afecta principalmente a regiones con cavidades de vidrio o volúmenes vacíos. Para comenzar, introduzca la muestra etiquetada con nitrógeno-15 en el tubo de zirconia con una pipeta de vidrio y asegúrese de que la muestra se atraque en la parte inferior del tubo. Para evitar que la muestra se mezcle con el líquido de transmisión, superponga la muestra con 200 microlitros de aceite mineral y luego llene el resto del tubo con líquido de transmisión.

Coloque una junta tórica de un solo uso en la parte superior del tubo de zirconia y deslice el tubo en la base. Luego conecte el tubo a la línea de sución de alta presión y apriete la base a la celda a mano. Luego aplique 14.7 newton metros de torque para evitar fugas a menor presión.

Para comprobar la integridad del conjunto de la celda de presión, presurice el tubo hasta 300 bares fuera del espectrómetro utilizando el soporte de la celda y el recipiente de contención. Después de 15 minutos, restablezca la presión a un bar y verifique si hay fugas con una toallita limpia y sin pelusa. Inserte el tubo no presurizado en el espectrómetro guiando cuidadosamente la línea de sujeción.

Deslice el tubo en el espectrómetro hasta que el tubo alcance la posición de sentado de la muestra. Bloquee, shim, combine y ajuste los canales de protio y nitrógeno y guarde los shims optimizados para el futuro. Configure la espectroscopia optimizada para la relajación transversal con espectroscopia coherente hetero cuántico único y proceda a registrar un experimento de referencia en las condiciones atmosféricas.

Registre una serie de experimentos 2D desde una barra hasta 2,5 kilobares por cada 500 barras. Si se conocen las tasas precisas de plegado o despliegue, después de cada incremento de 500 barras, deje que la muestra se equilibre durante 15 a 20 minutos. Cuando alcance el punto de inflexión de la transición de plegado o despliegue, registre experimentos adicionales para mejorar la precisión del ajuste.

Este protocolo se utilizó para sondear la dependencia de presión de RRM2, el segundo motivo de reconocimiento de ARN heterogéneo de la ribonucleoproteína nuclear A1. La espectroscopia optimizada para la relajación transversal con espectros de espectros de espectros de espectros de coherencia heterocuántica única se recogió a una barra, 1,5 kilobares, dos kilobares y 2,5 kilobares. El RRM2 está casi completamente desplegado dentro del rango de 2,5 kilobares. Los perfiles de intensidad de presión individuales se ajustaron de acuerdo con la ecuación que se muestra aquí, para obtener los cambios correspondientes en la energía libre de Gibbs estándar y el volumen asociados con la reacción de despliegue.

Cuando se mapearon en la estructura del dominio, los residuos con la mayor magnitud de cambio de volumen se encontraron dentro del núcleo estructural del dominio, mientras que aquellos con la menor magnitud de cambio de volumen se ubicaron principalmente en los bucles de conexión entre las hebras beta y la hebra beta a la hélice terminal C. Para sondear el grado de compresibilidad y heterogeneidad conformacional del conjunto de estado plegado, se analizaron los cambios químicos del protio. Los perfiles individuales de los cambios químicos del protio en función de la presión se ajustaron utilizando la ecuación mostrada, para extraer los coeficientes lineales y no lineales específicos del sitio.

Los residuos con los coeficientes no lineales más grandes se encontraron principalmente en el núcleo estructural del dominio, mientras que los residuos con los coeficientes no lineales más pequeños se ubicaron principalmente dentro de bucles que conectan los diferentes motivos estructurales. Es importante configurar el tubo como un ajuste de presión correctamente, para evitar fugas. Si ocurre una fuga, la sonda probablemente tendría que ser removida para limpiar cualquier rastro de aceite mineral.