Disección de ovario planario para análisis ultraestructural y tinción de anticuerpos
10 de septiembre de 2021
Este protocolo presenta los pasos tomados para diseccionar los ovarios en las planarias de agua dulce, Schmidtea mediterranea. Los ovarios disecados son compatibles para la inmunotinción de anticuerpos y el análisis ultraestructural con microscopía electrónica de transmisión para estudiar la biología celular de los ovocitos y las células somáticas, proporcionando una profundidad y calidad de imagen que antes eran inaccesibles.
El objetivo de este método es diseccionar los ovarios de la planaria Schmidtea mediterranea para el análisis celular y subcelular de la biología de los ovocitos con TEM o tinción de anticuerpos. Este protocolo utiliza un breve paso de fijación para facilitar la localización y disección de los ovarios planarios, lo que proporcionará una profundidad y calidad de imagen que antes eran inaccesibles. La mayor lucha para alguien que nunca antes ha realizado esta técnica será localizar los ovarios después de la fijación.
Será útil familiarizarse con la anatomía de las planarias sexuales antes del experimento. Prepárese para el experimento alimentando a las planarias sexuales con pasta de hígado orgánica dos veces por semana para lograr la madurez sexual. Trate los gusanos sexualmente maduros con N-acetil-L-cisteína al 5%, o NAC, en un plato a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Reemplace el NAC con 10 mililitros de paraformaldehído al 4% recién preparado y fije los gusanos durante una hora a temperatura ambiente con agitaciones ocasionales. Comience la disección 10 minutos después de agregar 4% de paraformaldehído mientras se fijan los gusanos. Observar la pigmentación epitelial para localizar los cordones nerviosos ventrales, que aparecen como dos líneas con una pigmentación más clara que van desde los ganglios cefálicos anteriores hacia la cola.
Localice los ovarios putativos observando la pigmentación y valide su posición. Con dos cuchillos quirúrgicos, haga cortes posteriores y anteriores a los ovarios para eliminar por completo los fragmentos de gusano anterior y posterior. Use un cuchillo para anclar el gusano y el otro cuchillo para la disección.
Limpia el cuchillo utilizado para hacer los cortes. Para separar los dos ovarios, haz un corte en la línea media del fragmento de ovario y luego voltea el fragmento con el lado ventral hacia abajo. Use dos pares de pinzas puntiagudas tipo 5-SA para despegar el tejido dorsal y exponer el intestino.
Retire suavemente las ramas intestinales que se encuentran sobre los tejidos ventrales con la punta de las pinzas o con un cepillo suave para exponer el ovario. Extirpar los tejidos circundantes para extraer el ovario. Saca los ovarios y transfiérelos a un tubo de 1,5 mililitros para lavarlos con 1 mililitro de PBS.
Se utilizaron los patrones de pigmentación dorsal y ventral para localizar la posición de los ovarios. El exceso de tejido se recortó paso a paso. Una vez que el ovario quedó expuesto, se recortó el tejido circundante.
Los ovarios que contenían múltiples tipos de células somáticas se utilizaron tanto para el análisis ultraestructural como para la tinción con inmunofluorescencia. Los ovarios disecados permiten obtener imágenes de alta calidad de la anatomía celular y subcelular de los ovocitos. Este procedimiento debería permitir experimentos de interferencia de ARN para examinar las regulaciones moleculares de la biología de los ovocitos.
Esta técnica condujo al descubrimiento de un nuevo fenómeno en los ovocitos de los gusanos planos de que la envoltura nuclear se descompone en vesículas que encapsulan proteínas nucleares en lugar de permanecer intactas, también conocida como mitosis cerrada, o romperse en pedazos, también conocida como mitosis abierta.
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Descripción general
Este protocolo describe la disección de ovarios en la planaria de agua dulce Schmidtea mediterranea, con el objetivo de permitir el análisis celular y subcelular de la biología de los ovocitos. El método mejora la calidad y profundidad de la imagen mediante técnicas como la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y la inmunomarcación con anticuerpos.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Biología celular
- Análisis de ovocitos
- Biología de planarias
Antecedentes
- La anatomía de las planarias sexuales es fundamental para una disección efectiva.
- Alimentar a las planarias con pasta orgánica de hígado favorece la madurez sexual.
- Los ovarios se localizan según los patrones de pigmentación del epitelio.
Métodos Utilizados
- Métodos de disección quirúrgica
- Planaria de agua dulce Schmidtea mediterranea
- Microscopía electrónica de transmisión (TEM) y tinción de inmunofluorescencia
Resultados principales
- Localización y disección eficientes de los ovarios de planarias sexuales.
- Imagen de alta calidad de estructuras celulares y tipos de células somáticas.
- El método permite experimentos de interferencia de ARN para estudiar regulaciones moleculares.
Conclusiones
- Este estudio proporciona una técnica novedosa para el análisis de células reproductivas en planarias.
- Contribuye al entendimiento de la biología de los ovocitos y apoya futuros estudios genéticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El acceso directo a ovarios intactos de planarias permite un análisis de alta resolución del desarrollo de las células germinales, apoyando la reducción mecanicista de riesgos en las fases iniciales del descubrimiento. Este protocolo facilita la obtención de imágenes cuantitativas y la interrogación molecular de la biología de los ovocitos, mejorando la confianza predictiva en estudios de la línea germinal. Este enfoque está posicionado para contribuir a la validación de dianas y a la genómica funcional en los flujos de trabajo de biología reproductiva.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite una interrogación precisa del desarrollo de las células germinales y de los procesos meióticos.
- Apoya la validación funcional de perturbaciones génicas mediante interferencia de ARN en ovocitos.
- Mejora la claridad mecanicista en la selección y reducción de riesgos de dianas reproductivas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona una preparación estandarizada de ovarios intactos para análisis de imágenes y ensayos basados en anticuerpos.
- Facilita el análisis cuantitativo reproducible de estructuras celulares y subcelulares.
- Permite una evaluación robusta de la función génica bajo condiciones experimentales controladas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad en el estudio de la epigenética de la línea germinal y la arquitectura celular.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de dianas reproductivas.
- Ofrece información predictiva sobre mecanismos conservados de la biología del ovocito.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo de disección se integra en las etapas iniciales de descubrimiento y validación de objetivos, permitiendo análisis ultraestructurales e inmunoensayos posteriores. Apoya flujos de trabajo desde la prueba de hipótesis hasta la evaluación de la función génica en sistemas de línea germinal.
- Biología del Descubrimiento: Facilita estudios basados en hipótesis sobre la especificación de las células germinales y la regulación meiótica.
- Tamizaje: Proporciona tejido ovárico listo para ensayos, apto para imágenes cuantitativas y tamizaje con anticuerpos.
- Análisis: Ofrece lecturas celulares y subcelulares de alta resolución para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento básico con la evaluación preclínica de dianas reproductivas.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo reutilizable para diversos estudios de la línea germinal y perturbaciones genéticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad en la validación de dianas en células germinales.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de disección e imagen del ovario para lograr reproductibilidad.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de continuar o descartar proyectos en carteras de biología reproductiva.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de dianas en la línea germinal y estudios de función génica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en anatomía de planarias y técnicas de disección.
- Necesita acceso a microscopía electrónica de transmisión y a infraestructura para inmunomarcado.
- Exige estandarización entre equipos para la preparación de tejidos y obtención de imágenes reproducibles.
- Puede requerir adaptaciones para otros sistemas modelo de invertebrados o de línea germinal.
- Está limitado por el reducido número y la localización profunda de los ovocitos de planaria.
