Name: Calcio de pericitos cerebrales e imágenes hemodinámicas en ratones transgénicos in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Aprende a realizar imagen de calcio en pericitos cerebrales y mediciones hemodinámicas en ratones transgénicos Acta2-RCaMP 1.07 anestesiados. Este protocolo de microscopía de dos fotones permite estudiar la fisiología vascular y la regulación del flujo sanguíneo cerebral.

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J. Meza cuenta con el apoyo de becas de Mitacs e Research Manitoba. El financiamiento para este trabajo fue proporcionado por los Institutos Canadienses para la Investigación de la Salud, Research Manitoba, manitoba Medical Service Foundation, fondos iniciales de la Universidad de Manitoba y Brain Canada a través del Fondo de Investigación del Cerebro de Canadá, con el apoyo financiero de Health Canada y la Fundación Azrieli. Las opiniones expresadas en el presente documento no representan necesariamente las opiniones del Ministro de Salud o del Gobierno del Canadá.

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<li>28345 - STOCK Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J. Jackson Laboratory. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jax.org/strain/028345">https://www.jax.org/strain/028345</a> (2021).</li>
<li>Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y., Nakai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+genetically+encoded+red+fluorescent+Ca2%2B+indicator+for+detecting+optically+evoked+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials.</a> PLoS ONE. 7 (7), (2012).</li>
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<li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+circuit+activity+evokes+rapid+astrocyte+calcium+signals+on+a+similar+timescale+to+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).</li>
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<li>Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+algorithm+for+automated+detection%2C+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. 56 (3), 147-156 (2014).</li>
<li>Barrett, M. J. P., Ferrari, K. D., Stobart, J. L., Holub, M., Weber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHIPS%3A+an+extensible+toolbox+for+cellular+and+hemodynamic+two-photon+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">CHIPS: an extensible toolbox for cellular and hemodynamic two-photon image analysis.</a> Neuroinformatics. 16, 145-147 (2018).</li>
<li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+pericytes+regulate+cerebral+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease.</a> Nature. 508 (1), 55-60 (2014).</li>
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<li>Rungta, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+arbors+in+layer+II+%2F+III+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Vascular arbors in layer II / III somatosensory cortex.</a> Communications Biology. , (2021).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El presente método proporciona detalles sobre la inyección de vena de cola de ratón con un catéter, adquisición de imágenes de microscopio de dos fotones para pilas de profundidad, películas de señalización de calcio celular, creación de kymographs hemodinámicos y análisis de calcio y hemodinámico con nuestros algoritmos de procesamiento de imágenes17 (Figura 1). Hay varias ventajas en estas técnicas que mejoran el resultado de las imágenes in vivo y reducen el tiempo, los recursos y el estrés animal durante la sesión. En primer lugar, el uso de un catéter para la inyección de la vena de la cola proporciona un mayor control sobre la aguja, la jeringa y la cantidad de sustancia inyectada en la circulación del ratón. Además, evita la inyección de tinte en el tejido de la cola, ahorrando costosos reactivos. En segundo lugar, utilizamos ratones transgénicos que expresan sensores de calcio codificados genéticamente en pericitos de envainamiento y demuestran cómo localizarlos dentro de la red vascular cerebral con una pila z de profundidad, lo que facilita la identificación celular y la reubicación en sesiones de imágenes posteriores a largo plazo. Este es un factor importante en los estudios de pericitos y asegura una clasificación celular adecuada6,7. En tercer lugar, proporcionamos nuestros parámetros para recopilar películas de calcio y datos de escaneo de líneas hemodinámicas que son un buen punto de partida para medir señales celulares dinámicas. Finalmente, presentamos nuestros algoritmos de procesamiento de imágenes17,una caja de herramientas integral de procesamiento de imágenes que contiene múltiples enfoques para el preprocesamiento de imágenes (como la desmezcla espectral), el análisis de imágenes de calcio y el análisis hemodinámico (diámetro, velocidad, etc.). Estos algoritmos pueden generar gráficos para una visualización rápida y fácil de los datos, al tiempo que minimizan el nivel de experiencia del usuario requerido para analizar los resultados. Además, se puede automatizar con unas pocas líneas de código para procesar rápidamente por lotes múltiples conjuntos de datos con los mismos parámetros. Esto puede mejorar potencialmente la visualización de datos y la inversión de tiempo del investigador.
La clave para recopilar buenos datos de imágenes de calcio es ajustar la potencia del láser y la configuración de PMT para una clara adquisición de señales de fluorescencia, pero también recopilar datos a una velocidad de fotogramas suficiente para capturar todo el evento de calcio. Los datos en este protocolo se adquirieron a 10-11 cuadros por segundo, lo que captura las oscilaciones de calcio más lentas en los pericitos de envainamiento. También hay varios pasos durante el análisis que pueden mejorar el resultado del análisis. En primer lugar, la desmezcla espectral es beneficiosa si existe una superposición significativa entre los espectros de emisión de fluoróforos (Figura 2). Fluoresceína-dextrano se utilizó en este protocolo porque es un conjugado de dextrano rentable y disponible comercialmente que se usa comúnmente para mediciones hemodinámicas5. La desmezcla espectral ayuda a limpiar los datos para una mejor detección de señales de calcio, pero también se podrían usar fluoróforos alternativos con espectros de emisión más estrechos. En segundo lugar, la selección manual de estructuras celulares como ROI(Figura 3)es útil para clasificar los eventos de calcio en diferentes regiones subcelulares, como el soma o las ramas de proceso. La selección del ROI basada en la actividad (Figura 4)16 proporciona más información espacial y temporal sobre los eventos individuales de calcio. Esto puede ser útil al determinar la frecuencia de eventos de calcio en un área determinada o la propagación de eventos a otras áreas celulares. El uso de software de programación para analizar datos de imágenes puede ahorrar a los investigadores horas de tiempo cuando los datos se procesan por lotes, pero requiere una inversión de tiempo inicial para ajustar los parámetros para obtener resultados óptimos. Los factores más importantes son el tamaño esperado (en μm2) de la región activa, así como la duración de la señal (se debe definir el tiempo mínimo de señal y el tiempo máximo de señal). Los investigadores deben examinar primero algunas películas de la serie T de ejemplo para determinar mejor qué parámetros se ajustan a sus datos. Finalmente, los datos de mala calidad adquiridos en el microscopio pueden dificultar en gran medida el análisis del calcio y la hemodinámica (Figura 6). Por lo tanto, se debe tener cuidado de optimizar la configuración de adquisición del microscopio al principio. Con estos factores en mente, este protocolo que se puede adaptar para adaptarse a imágenes de calcio o análisis de otras señales celulares dinámicas (por ejemplo, sodio fluorescente, potasio, metabolito o fluctuaciones de voltaje) en otros tejidos o tipos de células.
Hay varias limitaciones para este protocolo. Primero, los datos se recopilan bajo anestesia, lo que afecta la actividad cerebral y podría afectar el flujo sanguíneo. Se pueden hacer imágenes similares en ratones despiertos que están entrenados para aceptar la fijación de la cabeza para obtener resultados más fisiológicos. Además, es importante recordar que recopilamos imágenes en 2 dimensiones de una célula y un vaso sanguíneo de 3 dimensiones in vivo. Por lo tanto, solo podemos capturar una facción de los eventos de calcio dentro de estas células o el flujo sanguíneo en una sola sección de un vaso sanguíneo a la vez.
Otra limitación a tener en cuenta es que las imágenes de calcio de dos fotones son sensibles a los artefactos de movimiento, donde el movimiento dentro y fuera del plano focal puede confundirse con fluctuaciones de calcio. Este protocolo se realizó bajo anestesia, lo que limita el movimiento del animal; sin embargo, los artefactos de movimiento pueden ser introducidos por la frecuencia respiratoria del ratón, la frecuencia cardíaca, la posible hinchazón del tejido y, en el caso de pericitos de envainamiento, contracción de vasos o vasomoción 4,6,18,19. Los artefactos de movimiento pueden ser mitigados por varias estrategias. Los paquetes de procesamiento de imágenes utilizados en este protocolo incluyen un paso de corrección de movimiento opcional, que utiliza un motor de convolución 2D para alinear las imágenes dentro de la serie T basada en la vasculatura visible13,17. Los fotogramas con cambios significativos en el plano focal son identificados por este algoritmo y pueden ser excluidos del análisis. Además, es posible utilizar estrategias estadísticas dentro de los paquetes de procesamiento de imágenes, como una puntuación Z al generar los rastros de fluorescencia para normalizar el movimiento inducido por las fluctuaciones de calcio20. El enfoque más robusto para tener en cuenta los artefactos de movimiento en las imágenes de dos fotones es combinar la expresión de dos indicadores fluorescentes dentro de la misma célula, como un indicador de calcio (por ejemplo, GCaMP) y un reportero fluorescente (por ejemplo, mCherry) que es independiente del calcio. Las fluctuaciones en el reportero fluorescente se pueden atribuir al movimiento y se restan de la señal indicadora de calcio para normalizar los artefactos de movimiento.
El propósito de este protocolo es proporcionar una comprensión clara de cómo recopilar imágenes óptimas de calcio y datos de flujo sanguíneo in vivo y presentar nuevos métodos y herramientas de análisis que los investigadores pueden implementar para mejorar sus resultados. Estas técnicas se pueden aplicar para estudiar el papel de diferentes poblaciones de pericitos en el control del flujo sanguíneo o en diferentes estados de enfermedad cerebral. Estos parámetros de imagen también se pueden utilizar para estudiar el calcio y el flujo sanguíneo en otros tipos de células y sistemas de órganos y principios similares se aplican a otras técnicas de imagen dinámica que son posibles gracias a otros sensores codificados genéticamente, más allá del calcio.

La vasculatura del sistema nervioso central consiste en arteriolas penetrantes, capilares y vénulas ascendentes. Dentro de esta red, las células murales como las células del músculo liso vascular encierran arteriolas y pericitos extienden procesos celulares a lo largo de las primeras ramas y capilares de la arteriola1. Los pericitos parecen tener varias funciones dentro del cerebro, incluido el mantenimiento de la barrera hematoencefálica1,2,la migración y la motilidad3,las propiedades potenciales de las células madre y la regulación del flujo sanguíneo cerebral4,5,6. Muchas de las funciones funcionales de los pericitos se han relacionado con fluctuaciones en el calcio intracelular que pueden regular la dilatación o contracción de estas células4,5,6.
Varios estudios recientes han establecido criterios para identificar diferentes tipos de pericitos cerebrales7,8. Las células murales dentro de las primeras 4 ramas de las arteriolas penetrantes son pericitos envolventes en función de su expresión de la proteína contráctil α-actina del músculo liso (αSMA) y sus somata ovoides sobresalientes con procesos que envuelven alrededor de los vasos7,8,9. Para visualizar las fluctuaciones de calcio en los pericitos de envainamiento, este protocolo utiliza una nueva línea de ratón transgénico, Acta2-RCaMP1.07, también conocida como Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10. Estos ratones expresan el indicador de calcio rojo codificado genéticamente, RCaMP1.07, en células que expresan αSMA (células del músculo liso vascular y pericitos envolventes). Las colonias de cría se mantienen cruzando animales no pastores con hemicigotas. RCaMP1.07 es una proteína fluorescente roja con un dominio de unión a calmodulina, que aumenta la fluorescencia al unirse al calcio intracelular10,11. Este protocolo describe los pasos para la obtención combinada de imágenes de calcio de pericitos envainados y mediciones del flujo sanguíneo mediante microscopía de dos fotones, incluidos los procedimientos para la inyección de colorantes fluorescentes en la vena de la cola, la adquisición de imágenes con microscopio en ratones anestesiados y el análisis de datos con plataformas de programación(Figura 1). Estas técnicas son útiles para abordar preguntas sobre la fisiología de las células murales, pero se pueden adaptar para estudiar los transitorios de calcio en cualquier tipo de célula en el cerebro u otro sistema de órganos.
Se utilizó un ratón Hembra Acta2-RCaMP1.07 de 10 meses de edad para el experimento presentado en este artículo. El ratón se sometió a una cirugía para la ventana craneal crónica y la cabeza después de la implantación dos meses antes. Los detalles para el protocolo quirúrgico se discuten en estudios previos12,13 y procedimientos similares se han realizado en otros protocolos publicados anteriormente14,15. La vasculatura se marca con fluoresceína-dextrano verde (70.000 MW, solución adiónica, 2,5% p/v) inyectada por vía intravenosa. Este tinte es rentable y está fácilmente disponible en fuentes comerciales, pero tiene un espectro de emisión más amplio que puede superponerse con la emisión de RCaMP y sangrar durante la adquisición de imágenes de microscopio. Los pasos para la desmezcla espectral se describen en la Sección 4 a continuación para eludir esto, pero también se pueden usar otros tintes verdes con espectros de emisión más estrechos, como los basados en EGFP.

<table><tbody><tr><td>Acta2-RCaMP1.07</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>28345</td><td>En el protocolo de video, el modelo animal utilizado es un ratón hembra de 10 meses y 1 día de edad.</td></tr><tr><td>Aplicadores (Regulares)</td><td>Bisco</td><td>X-80250P</td><td></td></tr><tr><td>Paquete de BioFormatos para MATLAB</td><td>NA</td><td></td><td>NA Denominados en este protocolo como "paquetes de procesamiento de imágenes".&nbsp; Disponible en: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/</td></tr> <tr><td>CHIPS MATLAB toolbox</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Denomitaded en este protocolo como "algoritmos de procesamiento de imágenes". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: una caja de herramientas extensible para el análisis de imágenes de dos fotones celulares y hemodinámicas. Neuroinformática. 2018; 16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Disponible en:</td></tr><tr><td>https://github.com/EIN-lab/CHIPS Gel de ultrasonido transparente, viscosidad media</td><td>HealthCare Plus</td><td>UGC250</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano, fluoresceína, 70.000 MW, aniónico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 70.000 MW, neutro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>Eye Lube Plus</td><td>Optixcare</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>Imagen J</td><td>NA</td><td>Denominada en este protocolo como "software procesador de imágenes". Disponible en:</td></tr><tr><td>https://imagej.net/Fiji/Downloads GCaMP6sfl/fl</td><td>The Jackson Laboratory Head Post</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fixing platform</td><td>University of Zurich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Narketan 100 mg/mL)</td><td>Vetoquinol</td><td>440893</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2020b</td><td></td><td>NA</td><td>Denominado en este protocolo como "plataforma de programación". Disponible en: https://www.mathworks.com/downloads/</td></tr> <tr><td>Aguja 0.3mmx25mm</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo XLUMPLFLN20XW</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/</td></tr> <tr><td>PDGFR&beta;-CreERT2</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>30201</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno, PE10 I.D. 28mm (0.11") O.D. 61mm (.024&rdquo;)</td><td>BD Intramedic</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Prairie View</td><td>Microscopía de fluorescencia Bruker</td><td>NA</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html</td></tr><tr><td>Ultima Microscopio multifotónico in vitro</td><td>Microscopía de fluorescencia</td><td>Bruker NA</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html</td></tr><tr><td>Calentador debajo del tanque</td><td>Reptitherm U.T.H</td><td>E169064</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina (Rompun 20 mg/mL)</td><td>Bayer HealthCare</td><td>2169592</td><td></td></tr></tbody></table>

calcio de pericitos cerebrales e imágenes hemodinámicas en ratones transgénicos in vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Los avances recientes en biología de proteínas y genética de ratones han hecho posible medir las fluctuaciones de calcio intracelular de las células cerebrales in vivo y correlacionar esto con la hemodinámica local. Este protocolo utiliza ratones transgénicos que han sido preparados con una ventana craneal crónica y expresan el indicador de calcio codificado genéticamente, RCaMP1.07, bajo el promotor de actina del músculo liso α para etiquetar específicamente las células murales, como las células del músculo liso vascular y los pericitos envolventes. Se describen los pasos sobre cómo preparar un catéter de vena de cola para la inyección intravenosa de tintes fluorescentes para rastrear el flujo sanguíneo, así como cómo medir el calcio de pericitos cerebrales y la hemodinámica de los vasos sanguíneos locales (diámetro, velocidad de los glóbulos rojos, etc.) mediante microscopía de fotones in vivo a través de la ventana craneal en ratones anestesiados con ketamina / xilazina. Finalmente, se proporcionan detalles para el análisis de las fluctuaciones de calcio y las películas de flujo sanguíneo a través de los algoritmos de procesamiento de imágenes desarrollados por Barrett et al. 2018, con énfasis en cómo estos procesos se pueden adaptar a otros datos de imágenes celulares.

La fluoresceína-dextrano tiene un amplio espectro de emisión que puede sangrar a través del canal rojo, lo que afecta la detección de RCaMP en pericitos de envainamiento(Figura 2A). La desmezcla espectral después de la adquisición de datos en el programa de software reduce el sangrado de fluoresceína(Figura 2B,más abajo), mejorando la detección de señales de calcio en los pasos de análisis posteriores.
El análisis de calcio con los algoritmos de procesamiento de imágenes utilizados en este protocolo permite varios enfoques diferentes para identificar el ROI y las fluctuaciones intracelulares del calcio (es decir, las señales de calcio). La selección manual de estructuras celulares permite la detección de fluctuaciones de calcio dentro de estas regiones(Figura 3A),incluidos diferentes tipos de picos de señal, como picos individuales y picos múltiples, después de que los rastros de calcio normalizados se filtran de paso bajo y paso de banda(Figura 3B). Además, los ROI se identifican agrupando píxeles activos donde la intensidad de la fluorescencia cambia con el tiempo utilizando algoritmos de procesamiento de imágenes desarrollados por Ellefsen et al. 201416 y Barrett et al. 201817 (Figura 4). Esto se puede aplicar a cualquier señal celular dinámica ajustando el tiempo, el umbral y los parámetros espaciales para abarcar el tamaño y la forma esperados de la señal. La disminución del umbral para la identificación de señales encuentra más regiones de interés (Figura 4B).
Se pueden analizar kymographs hemodinámicos brillantes y claros para medir el diámetro y la velocidad de los glóbulos rojos en los vasos sanguíneos cerca de los pericitos de envainamiento(Figura 5A,B). El diámetro se calcula a partir del ancho total a la mitad como máximo de la fluorescencia(Figura 5C). La velocidad de los glóbulos rojos se aproxima a partir de las rayas hechas de glóbulos rojos sin etiquetar, donde el ángulo se introduce en una transformación de radón para calcular la velocidad, el flujo (células/s) y la densidad lineal (células/mm; Figura 5D). Los kymographs de mala calidad donde hay saturación de fluorescencia, mala relación señal/ruido o movimiento del campo de imagen(Figura 6A)crean gráficos poco confiables con puntos de error (cruces rojas) donde no se pueden determinar los datos(Figura 6B,C). La calidad de los datos adquiridos es fundamental para un buen resultado y seguir los pasos descritos en este protocolo asegura buenos resultados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig01.jpg"> Figura 1. Resumen del protocolo. El protocolo presenta los pasos para adquirir y analizar imágenes fluorescentes de calcio de pericitos que envuelven el cerebro y datos de flujo sanguíneo de vasos sanguíneos cercanos en ratones anestesiados. El protocolo se divide en 4 pasos. 1) Preparación del procedimiento: configuración del equipo y preparación del catéter; 2) Inyección de la vena de la cola; 3) Adquisición de datos por microscopía de dos fotones; 4) Análisis de datos con algoritmos de procesamiento de imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig02.jpg"> Figura 2. Desmezcla espectral de fluoróforos. A) Imagen media representativa de los vasos sanguíneos etiquetados con pericitos y fluoresceína-dextrano RCaMP de una adquisición de la serie T. Barra de escala = 10 μm.B) Superior: Cuando se consideran canales individuales, el sangrado desde el Canal 2 es evidente en el Canal 1 (izquierda). Inferior: Después de la desmezcla espectral, el sangrado se reduce y la señal de RCaMP es más prominente en la estructura del pericito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig03.jpg"> Figura 3. ROI seleccionados a mano y trazas de calcio optimizadas. A) Las regiones de interés seleccionadas en el software de procesamiento de imágenes utilizado (formas de arco iris) se pueden utilizar para identificar rastros de señales de calcio. B) Los picos de señal de trazas normalizadas se identifican mediante el paso bajo y el paso de banda filtrando los datos. Definimos el umbral de señal como 3 veces la desviación estándar del período basal (primeros 30 fotogramas) y cualquier pico por encima de este umbral se consideró una señal (traza inferior). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig04.jpg"> Figura 4. ROI automatizados basados en la actividad para el análisis de calcio. Los mismos datos se analizaron con un umbral de 7 veces la desviación estándar de la línea de base (A) y 3 veces la desviación estándar de la línea de base (B). Al disminuir el umbral para identificar píxeles activos, se encuentran más ROI (B) y picos de señal (gráfico circular) dentro de los pericitos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig05.jpg"> Figura 5. Mediciones hemodinámicas del kymógrafo. A) Ejemplo de escaneo de línea a través del buque. B) Ejemplo de kymographs bien definidos para diámetro (izquierda) y velocidad (derecha). Las rayas negras dentro de la banda derecha de fluorescencia corresponden a glóbulos rojos.C) Análisis de diámetro con claras fluctuaciones de vasomoción. D) Análisis de velocidad con gráficos para el eje Y = flujo de glóbulos rojos (celdas / s), densidad de línea (celdas / mm), velocidad (mm / s) y ángulo de raya (grado), relación señal a ruido (unidades arbitrarias, a.u.), eje X = tiempo (seg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig06.jpg"> Figura 6. Representación de mediciones hemodinámicas de mala calidad. A) Ejemplos de kymographs de mala calidad con saturación de fluorescencia, mala relación señal/ruido o movimiento del campo de imágenes durante la adquisición. B y C) Gráficos similares a la Figura 7 de datos de diámetro y velocidad que tienen puntos de error (puntos rojos) debido a la mala calidad de los kymographs. (imagen E, eje Y = Diámetro (μm), eje X = tiempo (seg); imagen F, eje Y = flujo de glóbulos rojos (celdas / s), densidad de línea (celdas / mm), velocidad (mm / s) y ángulo de raya (grado), relación señal a ruido (a.u.), eje X = tiempo (seg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo presenta pasos para adquirir y analizar imágenes de calcio fluorescente de pericitos que envuelven el cerebro y datos de flujo sanguíneo de vasos sanguíneos cercanos en ratones anestesiados. Estas técnicas son útiles para estudios de fisiología de células murales y se pueden adaptar para investigar transitorios de calcio en cualquier tipo de célula.

Calcio de pericitos cerebrales e imágenes hemodinámicas en ratones transgénicos in vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

La vasculatura cerebral es una red compleja de arterias penetrantes, capilares y vénulas ascendentes. Estos vasos están encerrados por células murales, como los pericitos de envainamiento, que expresan actina del músculo liso alfa, y se encuentran dentro de las primeras cuatro ramas de las arterias penetrantes. Utilizamos ratones transgénicos Acta2-RCaMP 1.07, para visualizar transitorios de calcio en estas células, a través de la expresión del indicador de calcio codificado genéticamente RCaMP.El calcio juega un papel importante en la contracción de estas células y el control del flujo sanguíneo. Los pericitos capilares se encuentran más abajo en la red vascular y se pueden etiquetar en otros modelos transgénicos. Sin embargo, nos centramos en ensalar los pericitos en este método.Nuestros ratones han sido implantados quirúrgicamente con una ventana craneal crónica que permite el acceso a la vasculatura cerebral para obtener imágenes. Aquí, describimos los pasos de preparación necesarios y la inyección de la vena de la cola seguida de las dos imágenes de fotones y los métodos analíticos necesarios para adquirir datos de calcio pericitario e información sobre el flujo sanguíneo en animales anestesiados. Los siguientes elementos son necesarios para una inyección de catéter de la vena de la cola: jeringas de insulina, una pieza de tubo de PE10 de 15 centímetros, agujas de calibre 30, gasa, solución salina, fórceps, tinte de fluoresceína dextrano verde, alicates y tijeras.También tenemos una aguja con anestesia de ketamina xilazina que inyectaremos antes de la toma de imágenes, ya que es mejor que el isoflurano para las mediciones del flujo sanguíneo. Usando los alicates, rompa una aguja de calibre 30 del cubo. Inserte cuidadosamente la aguja en el extremo de la pieza de tubo de PE10 unida a una jeringa llena de solución salina.Este es el catéter para inyección. Anestesiar un ratón con isoflurano y aplicar gel I-Lube. Coloque un campo de guantes con agua tibia en la cola para dilatar la vena lateral.Después de limpiar la cola con etanol, inserte la aguja en la vena e inyecte suavemente solución salina a través del catéter para asegurarse de que la aguja se coloque correctamente. Cambie la jeringa del catéter por una jeringa llena de colorante de fluoresceína dextrano. Inyecte lentamente el tinte para asegurarse de que no entren burbujas en el tubo.Reemplace la jeringa de dextrano con la jeringa de solución salina y enjuague el tubo hasta que no quede ningún tinte en el tubo. Retire la aguja y presione con una gasa. Inyecte anestesia con ketamina xilazina para obtener imágenes.Con la cabeza del ratón fija en una almohadilla térmica, limpie la ventana craneal con aplicadores dentales. Aplique gel de ultrasonido en la ventana y enfoque a través del objetivo del microscopio de dos fotones. Para la obtención de imágenes de dos fotones, utilizamos un microscopio con láser de zafiro de titanio sintonizable para fluorescentes, excitación y tubos fotomultiplicadores para la detección de emisiones.En el software del microscopio, ajuste la longitud de onda a 990 nanómetros para excitar tanto el RCaMP como la fluoresceína dextrano. A continuación, ajuste la potencia del láser ajustando el voltaje de la celda pockel y la sensibilidad del detector PMT. Escaneo en vivo con estos parámetros y mayor resolución, se pueden ver células murales RCaMP positivas y el plasma sanguíneo etiquetado fluorescentemente.Se recomienda la adquisición de una pila de profundidad para localizar adecuadamente los pericitos en la red vascular. Cuando se enfoca en la parte superior del tejido cerca de los vasos PO, establezca esto como el punto cero y la parte superior de la pila de la serie Zed, luego concéntrese hacia abajo en el tejido a la profundidad deseada y establezca esto como la parte inferior de la pila. La potencia del láser debe ajustarse para aumentar a medida que el microscopio se mueve más profundamente a través de la pila.Al abrir la serie Zed en el software de procesamiento de imágenes, fusione los dos canales como imágenes coloreadas y escanee a través de la pila en busca de pericitos y vasos sanguíneos de interés. Seleccione las regiones de interés que contienen pericitos y guarde las posiciones para ayudar a localizar estos puntos nuevamente en futuras sesiones de imágenes. Para recolectar y mover un evento de calcio pericito, aumente la velocidad de fotogramas de adquisición a más de 10 fotogramas por segundo.Establezca la duración de la imagen en 60 segundos y actualice la ruta de guardado con un nombre de archivo único. Haga zoom ópticamente en el vaso para tener en cuenta la resolución más baja y obtener una vista más cercana del pericito. Adquiere la serie T.Para medir el diámetro de los vasos sanguíneos y la velocidad de los glóbulos rojos, seleccione la exploración de línea para iniciar una exploración unidimensional con el microscopio. Primero establezca la duración del escaneo en milisegundos. Luego dibuje una línea que divida el recipiente de interés y se mueva paralelo a lo largo del recipiente.Esto generará un kymograph del diámetro del vaso a la izquierda y rayas de los glóbulos rojos que se mueven a través del vaso a la derecha. Consulte la tabla de materiales para obtener una lista completa de los programas y paquetes utilizados en este protocolo. Primero seleccione las regiones de interés a mano en el software de procesamiento de imágenes.Cargue el archivo de la serie T, tome el promedio de la pila y haga una imagen coloreada. Seleccione la herramienta de polígono y delinee las estructuras de pericitos de envainamiento visible, como el soma y los procesos. Asigne a cada región de interés un nombre único y guárdelos como una carpeta zip que se puede cargar más adelante en el software de programación.Abra el software de programación y asegúrese de que las carpetas de los paquetes de procesamiento de imágenes estén en la ruta. Importe la serie T de calcio en el software de programación y defina lo que hay en cada canal. En este caso, es una señal celular en el canal uno y plasma sanguíneo en el canal dos.Traza los datos como una película dentro del software de programación para facilitar la visualización. Para eliminar los fluorescentes verdes del dextrano de fluoresceína que sangra en el canal RCaMP rojo, des mezcle los canales en el paquete de procesamiento de imágenes. Primero seleccione una región que solo contenga fluoróforo 1, RCaMP en este caso.En segundo lugar, seleccione una región que solo contenga fluoróforo 2, fluoresceína en el plasma. Finalmente seleccione un área de fondo que no tenga ninguno de los fluoróforos. Esto genera una matriz de contribución espectral, que se aplica a cada píxel en cada canal.Mejora significativamente la localización de la señal RCaMP, lo que mejorará la detección de eventos de calcio en estas estructuras. Hay múltiples formas en que los datos de imágenes de calcio se pueden analizar dentro de los paquetes de procesamiento de imágenes. Primero ejecute el análisis de señalización celular en la película de calcio sin mezclar y cargue las regiones de interés de la carpeta zip que se seleccionaron de los pericitos a mano anteriormente.Establezca el factor de escala en uno porque no es necesario cambiar el tamaño de las regiones. Después del procesamiento, genere gráficos de cada ROY y los rastros de calcio normalizados en diferentes colores. Si el código no detecta la mayoría de los eventos de calcio en las trazas individuales, modifique los parámetros integrados dentro del cuadro de optimización, como disminuir el umbral para los datos filtrados de paso corto a tres veces la desviación estándar del período de referencia, que son los primeros 30 fotogramas de la serie T.Para detectar y clasificar las señales, la traza de calcio normalizada es de paso largo y paso de banda filtrada, lo que ayuda a suavizar los datos de amplitud y con estimaciones, pero también a determinar si las señales son picos individuales, picos múltiples o mesetas. Genere los datos como un archivo CSV para un análisis estadístico adicional. Ejecute el análisis de señalización celular por segunda vez en la película de calcio sin mezclar y seleccione la identificación automatizada de la región de interés en función de la actividad y el cambio en los fluorescentes en tres dimensiones, X, Y y tiempo.Trazar los resultados del proceso para ver las regiones de interés identificadas en diferentes colores. Si el algoritmo no detecta ROYs que son claramente visibles a simple vista en la película, modifique los parámetros incorporados, como aumentar el filtro gaussiano que suaviza los datos en el tiempo y disminuir el umbral para encontrar ROYs a tres veces la desviación estándar de la línea de base. Traza los ROYs como una película para una mayor visualización.Genere los datos como un archivo CSV para un análisis estadístico adicional. Importe el archivo de datos kymograph de escaneo de línea en el software de programación y defina lo que hay en cada canal. Ejecute la función de análisis de diámetro en el escaneo de línea, que abre un cuadro para seleccionar el área que corresponde al diámetro en el kymograph.Dibuje una caja fuera de los límites de los fluorescentes del kymograph, que corresponda al diámetro del vaso. Procese esta clase de datos para medir el ancho completo a la mitad de los máximos para el diámetro del recipiente y genere una gráfica. A continuación, ejecute la tasa de velocidad en el análisis de transformación y dibuje una caja dentro del borde de los fluorescentes kymograph.Procese esta clase de datos para calcular la velocidad, el flujo y la densidad lineal de los glóbulos rojos. Genere los resultados del flujo sanguíneo como un archivo CSV para su posterior análisis. La selección manual de estructuras celulares permite la detección de fluctuaciones de calcio dentro de estas regiones, incluidos diferentes tipos de picos de señal, como picos individuales y picos múltiples, después de que los rastros de calcio normalizados se filtran de paso bajo y paso de banda.Además, las regiones de interés se identifican agrupando píxeles activos donde la intensidad de los fluorescentes cambia con el tiempo utilizando algoritmos de procesamiento de imágenes. Esto se puede aplicar a cualquier señal celular dinámica ajustando el tiempo, el umbral y los parámetros espaciales para abarcar el tamaño y la forma esperados de la señal. La disminución del umbral para la identificación de señales encuentra más regiones de interés.Los quimógrafos hemodinámicos claros se analizan para medir el diámetro y la velocidad de los glóbulos rojos en los vasos sanguíneos cerca de los pericitos que se envuelven. El diámetro se calcula a partir del ancho total a la mitad del máximo de los fluorescentes. La velocidad de los glóbulos rojos se aproxima a partir de las rayas hechas de glóbulos rojos no etiquetados, donde el ángulo se introduce en una transformación de radón para calcular la velocidad.Los kymographs de mala calidad, donde hay saturación fluorescente, mala relación señal-ruido o movimiento del campo de imágenes, crean gráficos poco confiables con puntos de error, indicados como cruces rojas, donde no se pueden determinar los datos. La calidad de los datos adquiridos es fundamental para un buen resultado y seguir los pasos descritos en este protocolo asegura buenos resultados. En este video, describimos el procedimiento para la combinación de imágenes de calcio de pericitos de envainamiento cerebral y mediciones de flujo sanguíneo mediante microscopía de dos fotones.Estas técnicas son útiles para abordar preguntas sobre la fisiología de las células murales y la localización dentro de la red vascular cerebral, pero se pueden adaptar para estudiar los transitorios de calcio en cualquier tipo de célula en el cerebro u otro sistema de órganos.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

A la preparación del tejido se describe para la visualización y la manipulación experimental de la microcirculación de vida. En los ratones macho anestesiado, el delgado y muy vascularizado músculo cremáster se prepararon para microscopía intravital para estudiar las redes microvasculares como las arteriolas, capilares y vénulas. Esta preparación se adapta fácilmente a las ratas y hámsters.

El ratón Cremaster preparación muscular for Imaging intravital de la microcirculación

Este documento detalla el procedimiento de disección, la configuración instrumental y las condiciones experimentales durante el mapeo óptico del potencial de membrana (Vm) y el calcio intracelular transitoria (CAT) en Langendorff perfundidos aislados intactos los corazones de ratón.

Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

Se describe un procedimiento experimental para medir la actividad neuronal a través de dos ventanas ópticas arriba bilateral corticies somatosensorial primaria (S1) en Thy1-GCaMP6s de ratones transgénicos usando fotones 2 (2P) microscopia en vivo.

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

Los pericitos capilares cerebrales son actores esenciales en la regulación de las propiedades de la barrera hematoencefálica y el flujo sanguíneo. Este protocolo describe cómo los pericitos capilares cerebrales pueden ser aislados, cultivados, caracterizados con respecto al tipo de célula y aplicados para investigaciones de señalización de calcio intracelular con sondas fluorescentes.

Cultivo de pericitos capilares cerebrales para mediciones de calcio citosólico y estudios de imágenes de calcio

Aquí se presenta un protocolo para estudiar la microcirculación coronaria en el tejido cardíaco murino vivo mediante la monitorización ex vivo de la presión arterial perfusión y el flujo que mantiene la presión, así como componentes de árboles vasculares incluyendo los lechos capilares y pericitos, ya que la arteria septal está cánulada y presurizada.

Medición dinámica e imagen de capilares, arterias y pericitos en el corazón del ratón

La imagen in vivo es una herramienta poderosa para el estudio de la biología en la salud y la enfermedad. Este protocolo describe imágenes transpupilares de la retina del ratón con un microscopio estándar de dos fotones. También demuestra diferentes métodos de imagen in vivo para etiquetar fluorescentemente múltiples cohortes celulares de la retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

Presentamos un protocolo para exponer el médula oblonga del ratón adulto del lado ventral. Mediante el uso de una lente de índice de refracción de gradiente con un microscopio en miniatura, las imágenes de calcio se pueden utilizar para examinar la actividad de los somatas neuronales oliva inferiores in vivo.

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

El presente protocolo describe la fabricación de una ventana craneal grande (6 x 3 mm2) utilizando envoltura de alimentos, silicona transparente y vidrio de cubierta. Esta ventana craneal permite experimentos in vivo de imágenes de calcio de campo amplio y dos fotones en el mismo ratón.

In vivo Imágenes de calcio de campo amplio y dos fotones de un ratón usando una ventana craneal grande

Este protocolo describe la exposición quirúrgica del ganglio de la raíz dorsal (GRD) seguida de GCaMP3 (indicador de Ca2+ codificado genéticamente; Proteína fluorescente verde-Calmodulina-M13 Proteína 3) Imagen de Ca2+ de los conjuntos neuronales utilizando ratones Pirt-GCaMP3 mientras se aplica una variedad de estímulos a la pata trasera ipsilateral.

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios intactos de la raíz dorsal

Este protocolo describe imágenes de calcio GCaMP in vivo de neuronas intactas del ganglio trigémino (TG). Esta descripción incluye cirugía de exposición TG, imágenes de microscopía confocal in vivo de neuronas TG, aplicación de estímulos somáticos durante imágenes microscópicas de neuronas TG y análisis de datos de imágenes de calcio GCaMP in vivo .

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios del trigémino intactos

Aprende a realizar imagen de calcio en pericitos cerebrales y mediciones hemodinámicas en ratones transgénicos Acta2-RCaMP 1.07 anestesiados. Este protocolo de microscopía de dos fotones permite estudiar la fisiología vascular y la regulación del flujo sanguíneo cerebral.

Calcio de pericitos cerebrales e imágenes hemodinámicas en ratones transgénicos in vivo

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