Producción de vectores de virus adenoasociados en pilas celulares para estudios preclínicos en modelos animales grandes

Aquí proporcionamos un procedimiento detallado para la producción a gran escala de vectores AAV de grado de investigación utilizando células HEK 293 adherentes cultivadas en pilas celulares y purificación por cromatografía de afinidad. Este protocolo produce consistentemente >1 x 10¹³ genomas vectoriales / ml, proporcionando cantidades vectoriales apropiadas para estudios con animales grandes.

Este protocolo para la producción de vectores virales AAV es rentable y produce AAV de alta pureza, alto título y grado de investigación para su uso en modelos preclínicos de animales grandes. Esta técnica utiliza células HEK293 adherentes en cámaras de cultivo celular, lo que es eficiente en el tiempo y menos práctico, lo que permite menos interrupciones en las células. Este protocolo puede ayudar en gran medida en la producción de vectores virales para el campo de la terapia génica, y también se puede utilizar para la producción de otros serotipos AAV que también se unen al sulfato de heparán.

Para empezar, recoger las células HEK293 del cultivo cuando alcance el 80% de confluencia. Aspire el medio antes de lavar suavemente la placa de cultivo celular con tres mililitros de PBS. Luego aspire PBS y agregue tres mililitros de tripsina.

Incubar las placas durante dos minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, neutralice la tripsina, agregando siete mililitros de DMEM completo a la placa, y recoja el sobrenadante en tubos cónicos de 50 mililitros. Invierta suavemente los tubos para asegurarse de que las células sean homogéneas.

Para determinar la densidad celular, mezcle 10 microlitros de las muestras celulares con 10 microlitros de azul tripano. Y agregue la mezcla a una diapositiva de conteo de celdas para analizar en el contador de celdas. Mezcle la suspensión celular con un litro de DMEM completo precalentado para ver la cámara de cultivo.

Gire suavemente la cámara para distribuir las celdas de manera uniforme. Incubar la cámara a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Además de la cámara de cultivo celular, las células de cultivo de 10 a la cuarta célula por centímetro cuadrado en una placa de 15 centímetros como referencia para la confluencia.

Después de 65 horas de incubación, cuando las células son de 80 a 90% confluentes, agregue lentamente la mezcla de polietileneimina-ADN y DMEM en el puerto de la cámara de cultivo celular. Distribuya el líquido uniformemente a todas las filas antes de incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 72 horas. Después de la incubación, agite la cámara de cultivo celular vigorosamente para desalojar las células hasta que el medio aparezca turbio y viértalo en cuatro o 500 tubos centrífugos de mililitros.

Granular las células por centrifugación a 18.000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Vierta el sobrenadante clarificado en una botella de PETG de un litro y vuelva a suspender los gránulos celulares en 50 mililitros de tampón con licencia en tubos de centrífuga de 500 mililitros. Incubar los tubos durante 60 minutos a 37 grados centígrados.

Después de la incubación, centrifugue los tubos a 18, 000 veces G durante 30 minutos y transfiera el sobrenadante a la misma botella de PETG de un litro. Almacenar a menos 80 grados centígrados. Descongele el lisado crudo a cuatro grados centígrados durante la noche.

Una vez descongelado, filtrarlo con un filtro de 0,22 micras. Inmediatamente antes de los pasos de purificación, pasivar el concentrador centrífugo agregando cuatro mililitros de tampón de pretratamiento de filtro para cada columna de heparina-sefalrosa que se utilice. Coloque el tubo en una bomba peristáltica.

Ejecute secuencialmente las soluciones y los medios. Prepárese para la cromatografía uniendo una columna de cinco mililitros de heparina-sefalia al tubo y pasando 25 mililitros de Bazell DMEM a través de la columna. Luego cargue 0.2 micromolares del lisado crudo filtrado en la columna a una velocidad de flujo de una a dos gotas por segundo.

Lave la columna secuencialmente para eluir cinco mililitros cinco veces con 300 milimolares de cloruro de sodio HBSS, con magnesio y calcio, y etiquete las cinco eluciones como E1 a E5. Cuando esté listo, gire el concentrador centrífugo que contiene el tampón de pretratamiento a 900 veces G durante dos minutos. Descarta el flujo. Lave el filtro concentrador centrífugo con cuatro mililitros de HBSS con magnesio y calcio girando a 1000 veces G durante dos minutos.

Luego agregue la elución E2 al concentrador centrífugo y gire a 1000 veces G durante cinco minutos. Descarta el flujo. Del mismo modo, gire la elución E3 en el concentrador centrífugo hasta que el virus concentrado sea de aproximadamente un mililitro.

Retire el virus concentrado del concentrador centrífugo con una punta filtrada P200 y recójalo en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 mililitros. Después de la recolección del virus, enjuague el concentrador centrífugo con 200 microlitros de HBSS con magnesio y calcio. Pipete hacia arriba y hacia abajo vigorosamente durante 30 segundos para desalojar cualquier virus adherido a la membrana y recoja el virus concentrado en el mismo tubo centrífugo de 1,5 mililitros.

Mezclar bien el tubo. Lavar la columna y saturar con etanol al 20% antes de almacenar a cuatro grados centígrados. Guarde el tubo de la bomba en un hidróxido de sodio molar.

La eficiencia de transducción de la cápside AAV6.2FF se comparó en ratones, hámsteres y corderos durante 28 días tras la administración intramuscular. Los ratones administraron cinco veces 10 a los genomas vectoriales 12 por kilogramo de IgG humana AAV6.2FF, expresada entre 171 y 237 microgramos por mililitro de IgG humana en el suero. Hamster se administra de dos veces 10 a los genomas vectoriales 13 por kilogramo de IgG humana AAV6.2FF, expresada en niveles mucho más altos de IgG humana que los ratones.

Mientras que el modelo animal grande fue capaz de expresar un promedio de 35 microgramos por mililitro de los niveles humanos de IgG en el plasma. Los modelos animales grandes pueden determinar la expresión del transgén AAV in vivo y determinar si los transgenes tienen un efecto terapéutico contra el trastorno o enfermedad de interés. El estudio ha puesto de manifiesto la gran capacidad de transducción de AAV6.2FF, un nuevo vector serotipo AAV 6 en el músculo esquelético, así como la baja inmunogenicidad de los vectores virales AAV in vivo.