Name: Producción de vectores de virus adenoasociados en pilas celulares para estudios preclínicos en modelos animales grandes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Aprende a producir vectores virales AAV de alto rendimiento utilizando células HEK293 adherentes. Este protocolo eficiente genera vectores de alta pureza para estudios preclínicos en modelos animales grandes.

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Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas y Jacob G. E. Yates recibieron estipendios para estudiantes de la Facultad de Veterinaria de Ontario, así como becas para graduados de Ontario. Amira D. Rghei recibió un Mitacs Accelerate Studentship. Este trabajo fue financiado por la Subvención del Proyecto de los Institutos Canadienses para la Investigación en Salud (CIHR) (# 66009) y una subvención de Proyectos de Investigación en Salud Colaborativa (NSERC asociada) (# 433339) a SKW.

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<li>Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+identifies+a+cellular+regulator+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).</li>
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<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+aav+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLOS One. 8 (9), 76310(2013).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
<li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+serotypes+have+distinctive+interactions+with+domains+of+the+cellular+AAV+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor.</a> Journal of Virology. 91 (18), (2017).</li>
<li>Merkel, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+adeno-associated+virus+vectors+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier%3B+a+comparative+study+of+transcytosis+and+transduction+using+primary+human+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).</li>
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<li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570(2019).</li>
<li>Backovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+protein+expression+and+adeno-associated+virus+like+particles+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 124(2012).</li>
</ol>

Sarah K. Wootton es inventora de una patente estadounidense US10806802B2 para la cápside AAV6.2FF.

La producción de vectores AAV recombinantes (rAAV) descritos en este documento utiliza materiales, reactivos y equipos comunes que se encuentran en la mayoría de los laboratorios e instalaciones de investigación de biología molecular. Este papel permite que el lector produzca rAAV de alta calidad in vitro e in vivo. Sobre todo, este protocolo para la producción de rAAV, en comparación con los protocolos más tediosos que implican la purificación de cloruro de cesio, es eficiente y evita el uso de ultrace...

La terapia génica que utiliza vectores de virus adenoasociados (AAV) ha logrado grandes avances en las últimas tres décadas1,2. Las mejoras demostradas en una amplia gama de enfermedades genéticas, incluida la ceguera congénita, la hemofilia y las enfermedades del sistema musculoesquelético y nervioso central, han llevado la terapia génica AAV a la vanguardia de la investigación clínica3,4. En 2012, la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) aprobó Glybera, un vector AAV1 que expresa lipoproteína lipasa (LPL) para el tratamiento de la deficiencia de LPL, lo que la convierte en la primera autorización de comercialización para un tratamiento de terapia génica en Europa o estados Unidos5. Desde entonces, dos terapias génicas AAV adicionales, Luxturna6 y Zolgensma7,han recibido la aprobación de la FDA, y se espera que el mercado se expanda rápidamente en los próximos 5 años con hasta 10-20 terapias génicas esperadas para 20258. Los datos clínicos disponibles indican que la terapia génica AAV es una modalidad segura, bien tolerada y eficaz, lo que la convierte en uno de los vectores virales más prometedores, con más de 244 ensayos clínicos con AAV registrados con ClinicalTrials.gov. El creciente interés en las aplicaciones clínicas que involucran vectores AAV requiere métodos de producción robustos y escalables para facilitar la evaluación de las terapias AAV en modelos animales grandes, ya que este es un paso crítico en la tubería traslacional9.
Para la producción de vectores AAV, los dos requisitos principales son el genoma AAV y la cápside. El genoma de tipo salvaje (wt)-AAV es ADN monocatenario que tiene aproximadamente 4,7 kb de longitud10. El genoma wt-AAV comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) que se encuentran en ambos extremos del genoma, que son importantes para el empaquetado, y los genes rep y cap 11. Los genes rep y cap, necesarios para la replicación del genoma, el ensamblaje de la cápside viral y la encapsulación del genoma en la cápside viral, se eliminan del genoma viral y se proporcionan en trans para la producción de vectores AAV12. La eliminación de estos genes del genoma viral proporciona espacio para transgenes terapéuticos y todos los elementos reguladores necesarios, incluidos el promotor y la señal de poliA. Los RTI permanecen en el genoma del vector para garantizar la replicación adecuada del genoma y la encapsulación viral13,14. Para mejorar la cinética de la expresión transgénica, los genomas vectoriales AAV pueden diseñarse para ser autocomplementarios, lo que mitiga la necesidad de conversión de ADN de cadena simple a doble cadena durante la replicación del genoma AAV, pero reduce la capacidad de codificación a ~ 2.4 kb15.
Más allá del diseño del genoma AAV, la selección del serotipo de la cápside determina el tropismo tisular y celular del vector AAV in vivo2. Además del tropismo tisular, se ha demostrado que diferentes serotipos de AAV muestran diferentes cinéticas de expresióngénica 16. Por ejemplo, Zincarelli et al.17 clasificaron diferentes serotipos de AAV en serotipos de baja expresión (AAV2, 3, 4, 5), serotipos de expresión moderada (AAV1, 6, 8) y serotipos de alta expresión (AAV7 y 9). También clasificaron los serotipos de AAV en expresión de inicio lento (AAV2, 3, 4, 5) o expresión de inicio rápido (AAV1, 6, 7, 8 y 9). Estos tropismos divergentes y la cinética de expresión génica se deben a variaciones de aminoácidos en las proteínas de la cápside, formaciones de proteínas de la cápside e interacciones con los receptores/co-receptores de la célula huésped18. Algunas cápsides AAV tienen características beneficiosas adicionales, como la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica después de la administración intravascular (AAV9) o residen en células musculares de larga vida para una expresión transgénica duradera (AAV6, 6.2FF, 8 y 9)19,20.
Este artículo tiene como objetivo detallar un método rentable para producir vectores AAV de alta pureza, alto título y grado de investigación para su uso en modelos preclínicos de animales grandes. La producción de AAV utilizando este protocolo se logra utilizando la transfección de doble plásmido en células adherentes de riñón embrionario humano (HEK)293 cultivadas en pilas celulares. Además, el estudio describe un protocolo para la purificación por cromatografía de afinidad de sulfato de heparina, que se puede utilizar para serotipos AAV que contienen dominios de unión a heparina, incluidos AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 y DJ21,22.
Hay varios sistemas de envasado disponibles para la producción de vectores AAV. Entre estos, el uso de un sistema de coinfección de dos plásmidos, en el que los genes Rep y Cap y los genes auxiliares de Ad (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 y ARN VA) están contenidos dentro de un plásmido (pHelper), tiene algunas ventajas prácticas sobre el método común de transfección de tres plásmidos (triple), incluido el costo reducido para la producción de plásmidos23,24 . El plásmido del genoma AAV que contiene el casete de expresión transgénica (pTransgene), debe estar flanqueado por RTI, y no debe exceder ~ 4.7 kb de longitud. El título y la pureza del vector pueden verse afectados por el transgén debido a los posibles efectos citotóxicos durante la transfección. La evaluación de la pureza del vector se describe en este documento. Los vectores producidos utilizando este método, que producen un 1 x 1013 vg / ml para cada uno, se evaluaron en ratones, hámsteres y modelos animales ovinos.
Tabla 1: Composición de las soluciones requeridas. Información necesaria, incluidos porcentajes y volúmenes, de los componentes necesarios para diversas soluciones a lo largo del protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/Table%201-%2062727_R2.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 y mu; Filtro m</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SM2001C</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A399-4</td><td>ATENCIÓN. Úselo debajo de una campana de flujo laminar. Usar guantes</td></tr><tr><td>pila de celdas de 10 cámaras</td><td>Corning</td><td>3271</td><td></td></tr><tr><td>Botella de PETG de 1 litro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2019-1000</td><td></td></tr><tr><td>Solución de acrilamida/Bis al 30 %</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>placa con faldón de 96 pocillos</td><td>FroggaBio</td><td>FS-96</td><td></td></tr><tr><td>Sellos de placa adhesiva</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>PRECAUCIÓN. Úselo debajo de una campana de flujo laminar. Use guantes</td></tr><tr><td>Kit de limpieza de sangre y tejidos</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Uso para la limpieza de ADN en la sección 4.6 del protocolo</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Fisher Scientific</td><td>B392-5</td><td>PRECAUCIÓN. Úselo debajo de una campana de flujo laminar. Use guantes</td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular</td><td>Greiner bio-one</td><td>7000232</td><td>placas de 15 cm</td></tr><tr><td>Tubo cónico de cultivo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>Tubo cónico de 15 mL</td></tr><tr><td>Tubo cónico</td><td>de cultivo Fisher Scientific</td><td>14955240</td><td>tubo cónico de 50 mL</td></tr><tr><td>Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 1000 mg/L de D-glucosa, L-glutamina</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32209</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Greenfield</td><td>P016EA95</td><td>Alcohol etílico diluido (95% vol) al 20% para la sección 3.7.4 y al 70% para la sección 6.1.1.1</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>CAUTELA. Úselo debajo de una campana de flujo laminar. Use guantes</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS con Mg2+ y Ca2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH302268.02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sin Mg2+ 2 y Ca2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>Células HEK293</td><td>Colección Americana de Cultivo de Tejidos</td><td>CRL-1573</td><td>Una vez recibidas, descongele las células y el cultivo tal y como se describe en el fabricante. S protocolo. Una vez que las células han sido mínimamente pasadas y están creciendo bien, congele una subfracción para el futuro en alícuotas y almacene en nitrógeno líquido. Utilice siempre las celdas por debajo del pasaje número 30. Una vez que las células cultivadas se han pasado más de 30 veces, se recomienda reiniciar un cultivo a partir de las alícuotas almacenadas</td></tr><tr><td>Kit ELISA de proteína de célula huésped HEK293</td><td>Cygnus</td><td>Technologies F650S</td><td>Siga al fabricante' s instrucciones Columna de</td></tr><tr><td>sulfato de heparina</td><td>Cytiva Life Sciences 17040703</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KC34120</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; L-glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td></td></tr><tr><td>Cojín de soporte para tubo de centrífuga de gran volumen</td><td>Corning</td><td>CLS431124</td> El <td>cojín de soporte debe usarse con tubos de centrífuga de gran volumen a menos que el rotor de la centrífuga tenga los cojines de fondo en V apropiados</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de gran volumen</td><td>Corning</td><td>CLS431123-6EA</td><td>Tubos de centrífuga de 500 mL MgCl</td></tr><tr><td>2&nbsp; </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>Agua de grado molecular</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroilsarcosina sal de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5125</td><td>PRECAUCIÓN. Use guantes</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP35810</td><td></td></tr><tr><td>Optimem, medio de suero reducido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pipetas Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>Esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>PBS (10x)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td>Diluido a 1x para usar en las células</td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>plásmido pHelper</td><td>Diseño de novo u obtenido del repositorio de plásmidos</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cuenca de pipetas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-681-502</td><td>Comprar cuencas de pipetas estériles Éter</td></tr> de <tr><td>polietilenglicol terc-octilfenilo (Triton X-100)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td>PRECAUCIÓN. Usar guantes</td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td>Seguir al fabricante' para producir una solución de 1L. 0.22&mu; m filtrar y almacenar a 4 grados; C</td></tr><tr><td>Placa PCR con semifaldón de polipropileno</td><td>FroggaBio</td><td>WS-96</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbato 20 (Tween 20)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td>ATENCIÓN. Use guantes</td></tr><tr><td>membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF)</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>10600023</td><td>Use fórceps para manipular. Usa guantes.</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario</td><td>Progen</td><td>65158</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de proteínas</td><td>FroggaBio</td><td>PM008-0500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>PTrangene plásmido</td><td>Diseño de novo u obtenido del repositorio de plásmidos</td><td>NA</td><td>Debe contener SV40 polyA en el genoma para ser compatible con la valoración de AAV en la sección 5.0</td></tr><tr><td>Tubo de bomba</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-96440-14</td><td>Optimice la longitud de la tubería y la contención del virus en las fracciones E1-E5</td></tr><tr><td>RQ1 Tampón de reacción Dnase 10</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Uso a una concentración de 10x en el protocolo de la sección 4.0</td></tr><tr><td>RQ1 Dnase libre de ARNasa</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Diluyente de muestra</td><td>Cygnus Technologies</td><td>I700</td><td>Debe comprarse por separado para su uso con el kit</td></tr> <tr><td>ELISA de proteína de célula huésped HEK293Anticuerpo secundario, HRP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G-21040</td><td></td></tr><tr><td>Leche desnatada en polvo</td><td>Oxoid</td><td>LP0033B</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28312</td><td>PRECAUCIÓN. Úselo debajo de una campana de flujo laminar. Use guantes</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-4</td><td></td></tr><tr><td>SV40 polyA</td><td>sonda de</td> cebador IDT <td></td><td>Utilice la secuencia de la Tabla X para obtener una cita de IDT para la síntesis</td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>15524010 PRECAUCIÓN. Úselo debajo de una campana de flujo laminar. Usar guantes</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Filter</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC810024</td><td>Ultra-4 Centrífuga 10K se debe utilizar el dispositivo, ya que tiene un corte de 10000 peso molecular</td></tr><tr><td>Nucleasa universal para lisis celular</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88702</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla maestra universal de qPCR</td><td>NEB</td><td>M3003L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Papel</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001325</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td>PRECAUCIÓN. Úselo debajo de una campana de flujo laminar. Use guantes</td></tr><tr><td>PRECAUCIÓN:&nbsp; Consulte la Tabla de materiales para conocer las pautas sobre el uso de productos químicos peligrosos.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

producción de vectores de virus adenoasociados en pilas celulares para estudios preclínicos en modelos animales grandes

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

Los vectores de virus adenoasociados (AAV) se encuentran entre los vectores de terapia génica clínicamente más avanzados, con tres terapias génicas AAV aprobadas para humanos. El avance clínico de nuevas aplicaciones para AAV implica la transición de modelos de animales pequeños, como ratones, a modelos animales más grandes, incluidos perros, ovejas y primates no humanos. Una de las limitaciones de la administración de AAV a animales más grandes es el requisito de grandes cantidades de virus de alto título. Si bien el cultivo celular en suspensión es un método escalable para la producción de vectores AAV, pocos laboratorios de investigación tienen el equipo (por ejemplo, biorreactores) o saben cómo producir AAV de esta manera. Además, los títulos de AAV a menudo son significativamente más bajos cuando se producen en células HEK 293 en suspensión en comparación con las células HEK293 adherentes. Aquí se describe un método para producir grandes cantidades de AAV de alto título utilizando pilas de celdas. También se describe un protocolo detallado para la titulación de AAV, así como métodos para validar la pureza del vector. Finalmente, se presentan resultados representativos de la expresión de transgenes mediada por AAV en un modelo de oveja. Este protocolo optimizado para la producción a gran escala de vectores AAV en células adherentes permitirá a los laboratorios de biología molecular avanzar en las pruebas de sus nuevas terapias AAV en modelos animales más grandes.

La traducción de modelos de roedores pequeños a modelos animales más grandes y la eventual aplicación clínica presenta un desafío significativo debido a la gran cantidad de AAV requerida para transducir animales más grandes y lograr efectos terapéuticos. Para comparar la eficiencia de transducción de la cápside AAV6.2FF diseñada racionalmente, previamente se demostró un aumento de 101 veces en la eficiencia de transducción en células musculares murinas en comparación con AAV63,a ratones, hámsters ...

Aquí proporcionamos un procedimiento detallado para la producción a gran escala de vectores AAV de grado de investigación utilizando células HEK 293 adherentes cultivadas en pilas celulares y purificación por cromatografía de afinidad. Este protocolo produce consistentemente >1 x 1013 genomas vectoriales / ml, proporcionando cantidades vectoriales apropiadas para estudios con animales grandes.

Producción de vectores de virus adenoasociados en pilas celulares para estudios preclínicos en modelos animales grandes

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

Este protocolo para la producción de vectores virales AAV es rentable y produce AAV de alta pureza, alto título y grado de investigación para su uso en modelos preclínicos de animales grandes. Esta técnica utiliza células HEK293 adherentes en cámaras de cultivo celular, lo que es eficiente en el tiempo y menos práctico, lo que permite menos interrupciones en las células. Este protocolo puede ayudar en gran medida en la producción de vectores virales para el campo de la terapia génica, y también se puede utilizar para la producción de otros serotipos AAV que también se unen al sulfato de heparán.Para empezar, recoger las células HEK293 del cultivo cuando alcance el 80% de confluencia. Aspire el medio antes de lavar suavemente la placa de cultivo celular con tres mililitros de PBS. Luego aspire PBS y agregue tres mililitros de tripsina.Incubar las placas durante dos minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, neutralice la tripsina, agregando siete mililitros de DMEM completo a la placa, y recoja el sobrenadante en tubos cónicos de 50 mililitros. Invierta suavemente los tubos para asegurarse de que las células sean homogéneas.Para determinar la densidad celular, mezcle 10 microlitros de las muestras celulares con 10 microlitros de azul tripano. Y agregue la mezcla a una diapositiva de conteo de celdas para analizar en el contador de celdas. Mezcle la suspensión celular con un litro de DMEM completo precalentado para ver la cámara de cultivo.Gire suavemente la cámara para distribuir las celdas de manera uniforme. Incubar la cámara a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Además de la cámara de cultivo celular, las células de cultivo de 10 a la cuarta célula por centímetro cuadrado en una placa de 15 centímetros como referencia para la confluencia.Después de 65 horas de incubación, cuando las células son de 80 a 90% confluentes, agregue lentamente la mezcla de polietileneimina-ADN y DMEM en el puerto de la cámara de cultivo celular. Distribuya el líquido uniformemente a todas las filas antes de incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 72 horas. Después de la incubación, agite la cámara de cultivo celular vigorosamente para desalojar las células hasta que el medio aparezca turbio y viértalo en cuatro o 500 tubos centrífugos de mililitros.Granular las células por centrifugación a 18.000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Vierta el sobrenadante clarificado en una botella de PETG de un litro y vuelva a suspender los gránulos celulares en 50 mililitros de tampón con licencia en tubos de centrífuga de 500 mililitros. Incubar los tubos durante 60 minutos a 37 grados centígrados.Después de la incubación, centrifugue los tubos a 18, 000 veces G durante 30 minutos y transfiera el sobrenadante a la misma botella de PETG de un litro. Almacenar a menos 80 grados centígrados. Descongele el lisado crudo a cuatro grados centígrados durante la noche.Una vez descongelado, filtrarlo con un filtro de 0,22 micras. Inmediatamente antes de los pasos de purificación, pasivar el concentrador centrífugo agregando cuatro mililitros de tampón de pretratamiento de filtro para cada columna de heparina-sefalrosa que se utilice. Coloque el tubo en una bomba peristáltica.Ejecute secuencialmente las soluciones y los medios. Prepárese para la cromatografía uniendo una columna de cinco mililitros de heparina-sefalia al tubo y pasando 25 mililitros de Bazell DMEM a través de la columna. Luego cargue 0.2 micromolares del lisado crudo filtrado en la columna a una velocidad de flujo de una a dos gotas por segundo.Lave la columna secuencialmente para eluir cinco mililitros cinco veces con 300 milimolares de cloruro de sodio HBSS, con magnesio y calcio, y etiquete las cinco eluciones como E1 a E5. Cuando esté listo, gire el concentrador centrífugo que contiene el tampón de pretratamiento a 900 veces G durante dos minutos. Descarta el flujo. Lave el filtro concentrador centrífugo con cuatro mililitros de HBSS con magnesio y calcio girando a 1000 veces G durante dos minutos.Luego agregue la elución E2 al concentrador centrífugo y gire a 1000 veces G durante cinco minutos. Descarta el flujo. Del mismo modo, gire la elución E3 en el concentrador centrífugo hasta que el virus concentrado sea de aproximadamente un mililitro.Retire el virus concentrado del concentrador centrífugo con una punta filtrada P200 y recójalo en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 mililitros. Después de la recolección del virus, enjuague el concentrador centrífugo con 200 microlitros de HBSS con magnesio y calcio. Pipete hacia arriba y hacia abajo vigorosamente durante 30 segundos para desalojar cualquier virus adherido a la membrana y recoja el virus concentrado en el mismo tubo centrífugo de 1,5 mililitros.Mezclar bien el tubo. Lavar la columna y saturar con etanol al 20% antes de almacenar a cuatro grados centígrados. Guarde el tubo de la bomba en un hidróxido de sodio molar.La eficiencia de transducción de la cápside AAV6.2FF se comparó en ratones, hámsteres y corderos durante 28 días tras la administración intramuscular. Los ratones administraron cinco veces 10 a los genomas vectoriales 12 por kilogramo de IgG humana AAV6.2FF, expresada entre 171 y 237 microgramos por mililitro de IgG humana en el suero. Hamster se administra de dos veces 10 a los genomas vectoriales 13 por kilogramo de IgG humana AAV6.2FF, expresada en niveles mucho más altos de IgG humana que los ratones.Mientras que el modelo animal grande fue capaz de expresar un promedio de 35 microgramos por mililitro de los niveles humanos de IgG en el plasma. Los modelos animales grandes pueden determinar la expresión del transgén AAV in vivo y determinar si los transgenes tienen un efecto terapéutico contra el trastorno o enfermedad de interés. El estudio ha puesto de manifiesto la gran capacidad de transducción de AAV6.2FF, un nuevo vector serotipo AAV 6 en el músculo esquelético, así como la baja inmunogenicidad de los vectores virales AAV in vivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Recombinante virus adeno-asociado (rAAVs) vectores son cada vez más valioso...

Producción y Titulación de recombinantes adeno-asociado vectores virales

Se demuestra la técnica básica para diseñar y evolucionar molecularmente sintéticos virales adeno-asociados (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia de ADN arrastrando los pies. Por otra parte, nos proporcionan las pautas generales y ejemplos representativos para la selección y el análisis de cada uno de cápsidas quiméricas con propiedades mejoradas en las células diana en la cultura o en ratones.

Ingeniería y Evolución de la sintética virus adeno-asociado (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia transposición de ADN

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Aquí, describimos una estrategia eficiente y reproducible para producir, título y lotes de control de calidad de vectores de virus adeno-asociado. Permite al usuario obtener una preparación de vector con alto título (≥1 x 1013 vector genomas/mL) y una alta pureza, para uso en vitro o en vivo .

Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado

En este protocolo, el vector AAV2 se produce mediante el cocultivo de células de insectos Spodoptera frugiperda (Sf9) con baculovirus (BV)-AAV2-proteína fluorescente verde (GFP) o gen terapéutico y células Sf9 infectadas con BV-AAV2-rep-cap en cultivo en suspensión. Las partículas de AAV se liberan de las células utilizando detergente, se clarifican, se purifican mediante cromatografía de columna de afinidad y se concentran mediante filtración de flujo tangencial.

Desarrollo de Procesos para la Producción y Purificación de Virus Adeno-Asociados (AAV)2 Vector utilizando el Sistema de Cultivo Celular Baculovirus-Insecto

En este manuscrito, la inyección subconjuntival se demuestra como un método válido de administración de vectores para tejidos oculares en ratones utilizando un sistema de inyección que consiste en una bomba de jeringa de infusión/extracción y una jeringa extraíble hermética al gas acoplada con agujas de microinyección. Este sistema de inyección también es adaptable para otras vías de administración intraocular.

Administración subconjuntival de vectores de virus adenoasociados en modelos de animales pequeños

Aquí, se presenta un protocolo de producción de AAV basado en células HEK293 en suspensión, lo que resulta en una reducción del tiempo y la mano de obra necesarios para la producción de vectores utilizando componentes que están disponibles para fines de investigación de proveedores comerciales.

Producción de lotes de vectores adenoasociados de alto rendimiento utilizando celdas de suspensión HEK293

A medida que el campo de la terapia génica continúa evolucionando, existe una creciente necesidad de métodos innovadores que puedan abordar estos desafíos. Aquí, se presenta un método único, que agiliza el proceso de generación de vectores AAV de alto rendimiento y alta pureza utilizando una plataforma de fábrica de células, cumpliendo con los estándares de calidad para estudios in vivo .

Un procedimiento simplificado y estandarizado para generar vectores de virus adenoasociados de alta calidad y alto título utilizando una plataforma de fábrica de células

La tasa de rotación de los virus en los sistemas marinos y de agua dulce puede ser estimado por una reducción de la recurrencia y la técnica. Los datos permiten a los investigadores a deducir las tasas de mortalidad microbiana mediada por el virus en los sistemas acuáticos.

Estimación de las tasas de producción de virus en los sistemas acuáticos

Este artículo describe los diversos procedimientos de selección para las ratas y ratones para detectar endo-o ectoparasitismo. Varios ensayos de diagnóstico se ha demostrado, tanto las que son adecuadas para su uso en animales vivos y los que se utilizan después de la eutanasia del animal. Fotografías para ayudar en la identificación de los parásitos de ratas y ratones se incluirán.

El diagnóstico de ecto y endoparásitos en ratas y ratones de laboratorio

Aprende a producir vectores virales AAV de alto rendimiento utilizando células HEK293 adherentes. Este protocolo eficiente genera vectores de alta pureza para estudios preclínicos en modelos animales grandes.

Producción de vectores de virus adenoasociados en pilas celulares para estudios preclínicos en modelos animales grandes

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