Sistema de perfusión pulmonar aislada en el modelo de conejo
15 de julio de 2021
La preparación aislada del pulmón de conejo es una herramienta estándar de oro en la investigación pulmonar. Esta publicación tiene como objetivo describir la técnica desarrollada para el estudio de los mecanismos fisiológicos y patológicos involucrados en la reactividad de las vías respiratorias, la preservación pulmonar y la investigación preclínica en trasplante pulmonar y edema pulmonar.
Esta técnica es útil en la caracterización de la fisiología y patología pulmonar mediante la medición de las actividades metabólicas y la función respiratoria. El sistema de perfusión pulmonar aislada permite trabajar con un órgano funcional completo haciendo posible el estudio de una función fisiológica continua a la vez que recrea la ventilación y la perfusión. Este método podría proporcionar información sobre la caracterización de las capacidades no respiratorias de los tejidos pulmonares, como la actividad metabólica y las actividades de varios componentes como los macrófagos alveolares y el tejido endotelial.
Para empezar, ensamble el aparato de trabajo, asegurándose de que contenga la columna de acero principal montada en una placa base que sostiene el tórax artificial con el neumotacómetro y el transductor de peso ubicados sobre la columna y detrás de la bobina de precalentamiento con una trampa de burbujas. Conecte todos los transductores a la unidad electrónica central y prepare el sistema de ventilación además del aparato. Después de afeitar el sitio quirúrgico del conejo anestesiado, haga una incisión ventral en la línea mediana de tres a cinco centímetros desde el manubrio del esternón hasta el cuello.
Use las tijeras de operación para cortar los 2/3 anteriores de la tráquea entre los anillos del cartílago. Inserte una cánula traqueal de cinco milímetros a través de la membrana fibrosa traqueal y fije la cánula cuidadosamente con una sutura de seda 4-0. Coloque las pinzas o pinzas debajo de la tráquea para asegurarse de que la cánula no se doble contra la tráquea.
Conecte la bomba de respiración a la cánula traqueal, ajuste el volumen corriente a 10 mililitros por kilogramo e inicie la ventilación rápidamente después de la traqueotomía y antes de que se abra el tórax para mantener la presión positiva en los pulmones para prevenir el colapso pulmonar durante la cirugía. Para acceder a la cavidad torácica, use un bisturí o tijeras para abrir la pared del tórax y realizar una esternotomía medial hasta el tercio superior del tórax. Mantenga las mitades del tórax abiertas con dos retractores.
Localiza la vena cava superior e inferior y etiquétala con hilos. Antes de la exsanguinación del animal, identifique el ventrículo derecho e inyecte 1, 000 unidades internacionales por kilogramo de heparina. Inmediatamente después de la inyección, ligar la vena cava superior e inferior con el hilo pre-asado.
Cortar a través del manubrium sterni para extender la esternotomía medial hacia la cánula traqueal, liberando la tráquea en ambos lados del tejido de conexión. Ahora reseque la tráquea por encima de la cánula traqueal y tire suavemente de la cánula en un eje craneal / caudal. Después de la exsanguinación para cosechar el bloqueo cardiopulmonar, use disección digital directa o tijeras de resorte para separar el tejido conectivo y extraer los pulmones del tórax.
A continuación, diseccionar la vasculatura y el esófago. Levante los pulmones aislados del tórax y coloque cuidadosamente los pulmones sobre una gasa estéril en una placa de Petri. Para prevenir la atelectasia, ventile los pulmones mediante ventilación con presión positiva con presión espiratoria final positiva establecida en dos centímetros de columna de agua.
Cortar los ventrículos del corazón a nivel del surco auriculoventricular. Después de abrir los dos ventrículos, introduzca la cánula de la arteria pulmonar a través de la arteria pulmonar derecha y la cánula de la aurícula izquierda a través de la válvula mitral en la aurícula izquierda. Fije las cánulas con una sutura de seda 4-0 que incluya los tejidos circundantes en las ligaduras de la arteria pulmonar y la aurícula izquierda para evitar la distensión estructural.
Inyecte 250 mililitros de solución isotónica salina a través de la cánula arterial para eliminar la sangre restante del lecho vascular. Para la configuración de perfusión, coloque los pulmones aislados cuidadosamente en la cámara pulmonar. Conecte la tráquea al transductor en la cubierta de la cámara y conecte los recipientes canulados al sistema de perfusión, luego cierre y asegure la cámara con la cerradura giratoria.
A continuación, conecte la tapa de la cámara y cambie sobre la llave de paso para cambiar de ventilación de presión positiva a negativa. Perfunda los pulmones con 200 mililitros de perfusato libre de sangre artificial comenzando con el flujo a tres mililitros por minuto por kilogramo, luego aumente lentamente el flujo durante cinco minutos a cinco mililitros por minuto por kilogramo. Y durante los próximos cinco minutos, permita que el flujo alcance los ocho mililitros por minuto por kilogramo, seguido de un flujo máximo de 10 mililitros por minuto por kilogramo durante cinco minutos.
Ventilar los pulmones con aire humidificado a una frecuencia de 30 latidos por minuto, un volumen corriente de 10 mililitros por kilogramo y una presión espiratoria final de dos centímetros de columna de agua. Para lograr las condiciones de la zona tres, espere de 10 a 15 minutos para obtener un equilibrio caracterizado por un estado gravimétrico ISO, asegurando que la presión venosa sea estable en todo el registro. Asegúrese de que el peso del pulmón permanezca constante y que las presiones arterial y auricular izquierda sean estables para lograr condiciones de zona tres para abrir un número máximo de vasos pulmonares y mantener el contenido de lecho microvascular durante el experimento.
Para el control electrónico y procesamiento de señales, asegurar que el flujo respiratorio, los cambios de peso, la presión microvascular, el volumen corriente, la resistencia vascular, entre otros, estén registrados en una unidad electrónica central múltiple que integre las señales provenientes de los transductores y las muestre en el sistema de evaluación. Se evaluó la concentración de 5-HT y monoaminooxidasa implicada en el metabolismo pulmonar y la permeabilidad vascular. La concentración de 5-HT y monoaminooxidasa alcanzó su punto máximo después de 15 minutos de conservación y luego disminuyó durante las siguientes seis horas.
Después, los niveles de perfusión mostraron un aumento no estadísticamente significativo hasta las 24 horas. Las tasas de liberación de 5-HT y monoaminooxidasa indicaron que durante la primera hora de la preservación, los niveles de 5-HT aumentaron más que la monoaminooxidasa y disminuyeron dentro de las seis horas posteriores a ser recapturados por células endoteliales y plaquetas, así como catabolismo mediado por monoaminooxidasa. La actividad de la endopeptidasa neutra aumentó a las nueve horas y luego disminuyó y se mantuvo estable durante 12 a 24 horas.
La actividad de la enzima convertidora de angiotensina disminuyó después de cuatro horas, luego aumentó y se mantuvo estable a través del tiempo hasta las 24 horas. El efecto de la preservación pulmonar en la permeabilidad capilar se evaluó durante 24 horas, lo que indica que el pulmón perfundido sufrió un aumento progresivo del coeficiente de filtración capilar. Se comprobó el efecto de diferentes aditivos en la permeabilidad capilar del sistema de perfusión pulmonar aislada en diversas condiciones y se observó un aumento máximo de la permeabilidad con atropina.
La maniobra más importante es colocar correctamente los pulmones en una cámara pulmonar y conectar los vasos canulados al sistema de perfusión. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las interacciones entre las sustancias circulatorias y los efectos de las sustancias inhaladas o perfundidas como en las pruebas de drogas y diversas patologías pulmonares.
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Resumen
La preparación de pulmón aislado de conejo es una herramienta fundamental en la investigación pulmonar, ya que permite el estudio de mecanismos fisiológicos y patológicos. Esta técnica facilita la caracterización de la fisiología y la patología pulmonar mediante la medición de actividades metabólicas y la función respiratoria.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Investigación pulmonar
- Fisiología
- Patología
Antecedentes
- El sistema de perfusión pulmonar aislado permite el estudio de un órgano funcional completo.
- Este método recrea la ventilación y la perfusión para el análisis continuo de la función fisiológica.
- Proporciona información sobre las capacidades no respiratorias de los tejidos pulmonares.
- Los componentes clave incluyen las actividades de los macrófagos alveolares y del tejido endotelial.
Objetivo del estudio
- Describir la técnica de preparación del pulmón aislado de conejo.
- Investigar la reactividad de las vías respiratorias y la preservación pulmonar.
- Apoyar la investigación preclínica en trasplante pulmonar y edema pulmonar.
Métodos Utilizados
- Ensamblar el aparato de trabajo con los componentes esenciales.
- Conectar los transductores a la unidad electrónica central.
- Preparar el sistema de ventilación.
- Realizar procedimientos quirúrgicos en el conejo anestesiado.
Resultados principales
- La técnica permite mediciones detalladas de la función respiratoria.
- Mejora la comprensión de las actividades metabólicas en los tejidos pulmonares.
- Facilita el estudio de diversos componentes pulmonares.
- Proporciona un modelo confiable para la investigación preclínica.
Conclusiones
- La preparación de pulmón aislado de conejo es una herramienta de investigación valiosa.
- Contribuye de manera significativa al entendimiento de la fisiología y patología pulmonar.
- Este método es esencial para avanzar en la investigación de enfermedades relacionadas con el pulmón.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El sistema de perfusión pulmonar aislado permite la evaluación directa de las respuestas pulmonares a compuestos farmacológicos en un modelo ex vivo fisiológicamente relevante. Este enfoque apoya la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista mediante la medición de actividades metabólicas, permeabilidad vascular y función respiratoria en un sistema de órgano completo. Proporciona una confianza predictiva para la identificación de fármacos líderes en el descubrimiento de medicamentos respiratorios al simular la fisiología pulmonar relevante para el ser humano sin la variabilidad de animales completos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación del compromiso de dianas pulmonares mediante el análisis de la actividad metabólica de los macrófagos alveolares y del tejido endotelial.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas pulmonares mediante la medición en tiempo real de la mecánica respiratoria y las respuestas vasculares.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la cuantificación del coeficiente de filtración capilar (Kfc) para evaluar la formación de edema y la integridad de la barrera.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Proporciona datos cuantitativos y resueltos en el tiempo sobre enzimas metabólicas pulmonares, como la cinética de liberación de 5-HT y monoaminooxidasa.
- Valor operativo: Estandariza los parámetros de perfusión y ventilación (por ejemplo, volumen tidal de 10 mL/kg, PEEP de 2 cm H₂O) para pruebas reproducibles de compuestos.
- Preparación del ensayo: Permite evaluar sustancias inhaladas o perfundidas sobre la fisiología pulmonar bajo condiciones controladas de zona tres.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Modela la dinámica de perfusión pulmonar humana para apoyar la evaluación preclínica de fármacos pulmonares en desarrollo.
- Alineación de Biomarcadores: Rastrea cambios en la actividad enzimática (por ejemplo, enzima convertidora de angiotensina, endopeptidasa neutra) como biomarcadores traslacionales de la preservación pulmonar.
- Decisiones Ajustadas al Riesgo: Permite la evaluación longitudinal de la viabilidad pulmonar (ventana de 5–8 h) para orientar criterios de avance o interrupción en el desarrollo de terapias pulmonares.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El sistema de perfusión pulmonar aislada se integra en la continuidad de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la evaluación preclínica, permitiendo la refinación iterativa de candidatos farmacéuticos pulmonares basada en lecturas funcionales a nivel orgánico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre dianas pulmonares mediante la monitorización en tiempo real de los metabolitos y las salidas respiratorias.
- Cribado: Proporciona datos cuantitativos y estandarizados de perfusión y ventilación, esenciales para la reproducibilidad de ensayos y la clasificación de compuestos.
- Análisis: Genera puntos finales medibles, incluyendo el coeficiente de filtración capilar (Kfc), la resistencia vascular, el volumen tidal y las tasas de liberación enzimática, para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento inicial con la continuidad preclínica mediante la modelización de la preservación pulmonar y la progresión de lesiones relevantes para el ser humano.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la prueba iterativa de múltiples compuestos o condiciones dentro de una ventana de viabilidad definida.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la respuesta pulmonar al fármaco.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de canalización, perfusión y ventilación.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la detección temprana de efectos adversos pulmonares, reduciendo el abandono en fases tardías.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en la seguridad pulmonar y en lecturas funcionales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas quirúrgicas en roedores, canulación vascular y extracción del bloque cardiorrespiratorio.
- Depende de instrumentación precisa, incluyendo pneumotacómetro, transductor de peso y unidad electrónica central para la integración de señales.
- Necesita la estandarización entre equipos de los flujos de perfusión (3–10 mL/min/kg) y los parámetros de ventilación (30 rpm, volumen tidal de 10 mL/kg).
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes especies o modelos de enfermedad debido a las respuestas vasculares y metabólicas específicas de cada especie.
- Limitado por el aumento progresivo del coeficiente de filtración capilar con el tiempo, lo que restringe la duración del experimento a 5–8 horas antes del desarrollo significativo de edema.
