Name: Preparación de la solución de naringenina para aplicación in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Aprende a preparar soluciones de naringenina para administración intraperitoneal in vivo usando DMSO, Tween 80 y solución salina. Este método sencillo y económico facilita estudios farmacológicos sobre efectos antidiabéticos y osteoporóticos en modelos murinos.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81973607 y 81573992).

Las investigaciones descritas se ajustaron a las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación y fueron aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghai. Al realizar los experimentos, se requieren batas de laboratorio, guantes de nitrilo desechables y gafas para fines de seguridad.
1. Preparación de disolventes y estimación de naringenina necesaria para la aplicación in vivo
<ol><li>Prepare los siguientes disolventes: Tween-80 (rango de concentración final: 0,5% -1%), DMSO, glicerina (rango de concentración final: 15% -20%), etanol (rango de concentración final: 12% para inyección intramuscular)22 y 0,9% PS.</li>
	<li>Calcule la cantidad de naringenina requerida en función de la dosis, el número de ratones y la frecuencia de inyección.<ol><li>Ordene 10 ratones (C57BL/6, macho, 5 semanas de edad, SPF) para administrar naringenina 5 días a la semana durante 8 semanas. Mantenga a los ratones en condiciones específicas libres de patógenos (SPF). NOTA: La dosis requerida para la inyección intraperitoneal es de 20 mg/kg p.v.23.</li>
		<li>Pesar 160 mg de naringenina según el siguiente cálculo: 20 mg/kg x 0,02 kg/ratón x 10 ratones x 5 días/semana x 8 semanas = 160 mg.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcular la concentración de naringenina a inyectar in vivo.<ol><li>Prepare el volumen recomendado en función del peso corporal de los ratones. El volumen recomendado de naringenina aplicada a cada ratón es del 1% del peso corporal (0,3 ml). En este experimento, se utilizaron 0,2 ml por ratón.</li>
		<li>Calcule el volumen total: 0,2 ml por ratón x 10 ratones x 5 días/semana x 8 semanas = 80 ml.</li>
		<li>Calcular la concentración de Naringenina en stock: 160 mg/80 ml disolventes = 2 mg/ml.</li>
		<li>Calcule el volumen para cada día: 0,2 ml por ratón x 10 ratones = 2 ml.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Disolución
<ol><li>Solución de etanol<ol><li>Para preparar una solución de naringenina a 2 mg/ml, pesar 3,52 mg de naringenina y añadirla a un tubo de 2,0 ml. NOTA: Para alcanzar una concentración de 2 mg/ml, el volumen total requerido será de 1760 μL (cálculo: 3,52 mg/1760 μL = 2 mg/ml).</li>
		<li>Gire rápidamente hacia abajo (2000 x g durante 30 s) para que el polvo de naringenina se asiente en el fondo del tubo (Figura 1A).</li>
		<li>Añadir 8,8 μL de etanol al 100% al tubo para preparar una solución al 0,5% (v/v) con respecto al volumen total requerido2. La naringenina no se disuelve completamente (Figura 1B).</li>
		<li>Continúe agregando 79.2 μL de etanol al 100% al tubo para preparar una solución al 5% (v / v) con respecto al volumen total requerido (cálculo: (79.2 μL + 8.8 μL) / 1760 μL x 100% = 5%). La naringenina no se disuelve completamente (Figura 1B).</li>
		<li>Añadir 1672 μL de PS al 0,9% al tubo que contiene etanol al 5% como se describe en el paso 2.1.4. Esto producirá una emulsión (Figura 1D). Centrifugar (2000 x g durante 30 s) la solución para comprobar si la naringenina está completamente disuelta en la solución. Aparecen precipitados blancos de naringenina no disuelta en la solución (Figura 1E).</li>
	</ol></li>
	<li>Solución DMSO<ol><li>Para preparar la solución de naringenina a 2 mg/ml, pesar 3,95 mg de naringenina y añadir en un tubo de 2,0 ml. NOTA: Para alcanzar una concentración de 2 mg/ml, el volumen total requerido será de 1975 μL (cálculo: 3,95 mg/1975 μL = 2 mg/ml).</li>
		<li>Gire rápidamente hacia abajo (2000 x g durante 30 s) para que el polvo de naringenina se asiente en el fondo del tubo.</li>
		<li>Añadir 9,8 μL de DMSO al tubo para preparar una solución al 0,5% (v/v) (cálculo: 9,8 μL/1975 μL x 100% = 5%). La naringenina se disuelve completamente (Figura 2A).</li>
		<li>Añadir 88,2 μL de DMSO al tubo para preparar una solución al 5% (v/v) con respecto al volumen total requerido (cálculo: (88,2 μL + 9,8 μL) /1975 μL x 100% = 5%). La naringenina se disuelve completamente (Figura 2B).</li>
		<li>Añadir 1877 μL de PS al 0,9% (v/v por ciento del 95%) a la solución preparada en el paso 2.2.4. Se produce una emulsión (Figura 1C). Centrifugar (2000 x g durante 30 s) la solución para comprobar si la naringenina está completamente disuelta en la solución. Precipitados blancos de naringenina no disuelta aparecen en la solución (Figura 1D).</li>
	</ol></li>
	<li>Solución Tween-80 y DMSO<ol><li>Para preparar la solución de naringenina a 2 mg/ml, pesar 6,69 mg de naringenina y añadir en un tubo de 5,0 ml. NOTA: Para alcanzar la concentración final de 2 mg/ml, el volumen total de solución requerido será de 3345 μL (cálculo: 6,69 mg/3345 μL = 2 mg/ml).</li>
		<li>Gire rápidamente hacia abajo (2000 x g durante 30 s) para que el polvo de naringenina se asiente en el fondo del tubo.</li>
		<li>Añadir 117,7 μL de DMSO para preparar una solución al 3,5% (v/v) con respecto al volumen total requerido (cálculo: 117,7 μL /3345 μL x 100% = 3,5%). La naringenina se disuelve completamente (Figura 3A)</li>
		<li>Añadir 117,7 μL de Tween 80 a la solución preparada en la etapa 2.3.3 para alcanzar el 3,5% (v/v) de Tween 80 y el 3,5% (v/v) de DMSO. Observe la disolución completa de la naringenina (Figura 3B)</li>
		<li>Añadir lentamente la solución preparada en el paso 2.3.4 a un tubo de 5,0 ml que contenga 3109,6 μL de PS al 0,9% (v/v por ciento del 93%) y agitar bien para obtener una solución aparente de naringenina (Figura 3C).</li>
		<li>Deje que la solución preparada en el paso 2.3.5 permanezca a temperatura ambiente (RT) durante 2 h. La solución sigue siendo aparente sin precipitados visibles (Figura 3D).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de solución de naringenina para administración in vivo<ol><li>De acuerdo con el paso 1.2.2, pesar 160 mg de naringenina (160 mg / 2 mg / ml = 80 ml).</li>
		<li>Agregue 2.8 ml de DMSO para alcanzar una solución al 3.5% (v / v) (cálculo: 2.8 ml / 80 ml x 100% = 3.5%)</li>
		<li>A continuación, añadir 2,8 ml de Tween 80 a la solución preparada en el paso 2.4.2 para alcanzar el 3,5% (v/v) de Tween 80 y el 3,5% (v/v) de DMSO.</li>
		<li>Alícuota la solución preparada en la etapa 2.4.3 en cuatro tubos, 1,4 ml por tubo [(2,8 ml + 2,8 ml) / 4 = 1,4 ml].</li>
		<li>Alícuota 18,6 mL de 0,9% PS a cinco tubos de 15 mL.</li>
		<li>Conservar la solución preparada en la etapa 2.4.3 (solución madre) y 2.4.5 a 4 °C (2,8 ml + 2,8 ml + 18,6 ml x 4 = 80 ml).</li>
		<li>Tomar 140 μL de la solución madre (paso 2.4.3) y mezclarla con 1860 μL de PS al 0,9% para preparar 2 ml de solución de naringenina para 1 día de administración.</li>
		<li>Filtrar la solución a través de un filtro de 0,2 μm.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Administración de la solución Naringenin
<ol><li>Manipulación y sujeción<ol><li>Rocíe la jaula y las manos con alcohol al 70-75% antes de abrir la tapa. Levante el ratón por la base de la cola y colóquelo sobre una superficie sólida para colocar su cola suavemente hacia atrás.</li>
		<li>Agarre el cuello detrás de las orejas con el pulgar izquierdo y el índice y coloque la cola entre el dedo meñique y el anular. Mantenga el ratón en posición supina con su extremo posterior ligeramente elevado.</li>
	</ol></li>
	<li>Inyección<ol><li>Agarre la piel posterior del ratón para que la piel abdominal esté tensa.</li>
		<li>Empuje la aguja (jeringa de insulina) en un ángulo de 10° entre la aguja y la superficie abdominal, en el cuadrante inferior derecho o izquierdo del abdomen para evitar golpear la vejiga, el hígado u otros órganos internos.</li>
		<li>Pase la aguja por vía subcutánea en dirección craneal durante 3-5 mm, y luego insértela en un ángulo de 45° en la cavidad abdominal.</li>
		<li>Cuando la aguja pase a través de la pared abdominal y la resistencia desaparezca, realice una aspiración para confirmar que no se retira material de reflujo. Luego, empuje lentamente la solución.</li>
		<li>Después de la inyección, saque lentamente la aguja y gírela ligeramente para evitar fugas. El volumen recomendado es de 50-100 μL/10 g.</li>
		<li>Deseche las sobras de Naringenin en un recipiente de riesgo biológico.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Prueba de glucosa en sangre
NOTA: Pruebe la glucosa en sangre 1 día antes de la inyección y 1 y 2 meses después de la inyección.
<ol><li>Ayune los ratones durante 15 h antes de la prueba de glucosa en sangre. El agua puede seguir siendo proporcionada.</li>
	<li>Abra las tiras reactivas y marque la fecha. Una vez abiertas, use las tiras reactivas dentro de los 3 meses. Conservar las tiras reactivas a 2-30 °C. Cierre herméticamente la tapa después de retirar la tira para evitar la formación de humedad.</li>
	<li>Coloque al animal en la cámara de inducción. Encienda el vaporizador a un nivel de inducción del 4% para el isoflurano y 4 L/min para el oxígeno. Después de que el animal esté completamente anestesiado, mantener el anestésico con el cono de la nariz y la administración del anestésico a un nivel de 1.5% para isoflurano y 0.4 L / min para oxígeno.</li>
	<li>Limpie la cola con bolas de algodón / hisopos empapados en alcohol al 70% -75%.</li>
	<li>Comenzando desde el punto más bajo de la cola, haga una pequeña punción en la vena lateral de la cola con un pinchazo de aguja 25G y exprima una gota de sangre.</li>
	<li>Limpie la gota de sangre con un pañuelo de papel.</li>
	<li>Exprima otra gota de sangre y recójala en el borde de una tira reactiva.</li>
	<li>Lea y registre el resultado que se muestra en el medidor de glucosa.</li>
	<li>Para detener el sangrado, pellizque la cola del ratón con una gasa estéril y limpie el área con alcohol al 75%.</li>
	<li>Se pueden obtener muestras adicionales mediante una técnica similar que sube cranealmente por la cola.</li>
</ol>5. Tinción TRAP
<ol><li>Preparación de diapositivas<ol><li>Realice pruebas de glucosa en sangre en ayunas en los ratones una vez a la semana. Cuando los niveles de glucosa en sangre están ≥ 11.1 mmol / L (indicativo de ratones exitosos con diabetes tipo II modelo 24), eutanasia a los ratones usando CO2, seguido de disclocación cervical, y recolecte el Lumbar 4 th-6th (L4-L6) (no se realiza eutanasia mientras se realiza la prueba de glucosa en sangre en ayunas).</li>
		<li>Fijar las muestras L4-L6 con paraformaldehído al 4% durante 24 h (asegúrese de que el volumen de paraformaldehído sea >20 veces el volumen del tejido), y luego lavar durante 2 h en flujo continuo de agua del grifo.</li>
		<li>Para descalcificar las muestras, sumérjalas en una solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 10% durante 2 semanas en RT en condición estática hasta que las muestras se ablanden. Asegúrese de que el volumen de la solución descalcificante sea 20-30 veces el volumen del tejido / muestra. Cambie la solución EDTA cada dos días.</li>
		<li>Deshidratar la muestra con un deshidratador.<ol><li>Coloque las muestras en casetes de incrustación de procesamiento de tejidos. Numere el casete con un lápiz.</li>
			<li>Ajuste el programa de deshidratación de la siguiente manera: alcohol al 75% durante 2 h, alcohol al 85% durante 1 h, alcohol al 95% durante 1 h, alcohol al 95% durante 2 h, etanol anhidro (I) durante 2 h, etanol anhidro (II) durante 2 h, etanol anhidro (III) durante 2 h, xileno (I) durante 1 h, xileno (II) durante 1 h, xileno (III) durante 1 h, cera de parafina (I) durante 2 h, y cera de parafina (II) durante 2 h, a RT.</li>
		</ol></li>
		<li>Incrustar las muestras en cera de parafina.<ol><li>Añadir cera de parafina a la bandeja de cassette de la estación de incorporación de parafina y calentar a 60 °C. Sumerja los ejemplares deshidratados durante al menos 2 h.</li>
			<li>Coloque el cassette de pañuelos de papel en la bandeja de cassette y precaliente.</li>
			<li>Añadir cera de parafina al depósito de parafina y calentar a 60 °C.</li>
			<li>Después de 2 h, lleve tanto el casete de tejido como las muestras al área de trabajo. Vierta la cera de parafina precalentada del depósito de parafina en el casete de tejido. Coloque la muestra en la cera de parafina, asegúrese de que la cera de parafina cubra completamente el tejido y luego mueva inmediatamente el casete a una estación de formación de hielo.</li>
			<li>Use un micrótomo para cortar las muestras incrustadas en parafina en secciones de 5-6 μm. Desplegar las secciones en agua caliente a 40 °C durante menos de 10 s. Recoja las secciones en portaobjetos de vidrio recubiertos APS (amino silano). Secar los portaobjetos a RT durante 1 h y, a continuación, trasladar los portaobjetos a un horno a 60 °C durante la noche.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Preparación del reactivo TRAP<ol><li>Preparar la solución básica de incubación madre: Disolver 9,2 g de acetato de sodio anhidro, 11,4 g de ácido L-(+) tartárico y 2,8 ml de ácido glacial en 1000 ml de agua destilada. Ajuste el pH a 4.7-5.0 y guárdelo en RT hasta por 6 meses.</li>
		<li>Preparar solución de éter naftol: Disolver 0,1 g de fosfato as-BI de naftal en 5 ml de éter monoetílico de etilenglicol. Conservar a 4 °C durante un máximo de 5 semanas.</li>
		<li>Preparar solución de nitrito de sodio: Disuelva 1 g de nitrito de sodio en 25 ml de agua destilada. Conservar a 4 °C.</li>
		<li>Prepare el colorante de pararosanilina: Agregue 1 g de base de pararosanilina a 20 ml de HCl 2N (83 ml de HCl en 417 ml de agua). Use una placa de agitación para disolver la base y filtrarla antes de usarla.</li>
	</ol></li>
	<li>Tinción TRAP<ol><li>Llenar dos frascos de Coplin con 50 ml de solución básica de incubación y colocar en un horno a 37 °C durante 2 h.</li>
		<li>Tome un frasco de Coplin y agregue 0.5 ml de solución de éter de natol.</li>
		<li>Colocar los portaobjetos en el frasco de Coplin e incubar a 37 °C durante 1 h. NOTA: Prepare al menos tres diapositivas para cada grupo.</li>
		<li>Unos minutos antes de que termine el tiempo de incubación, agregue 1 ml de solución de nitrito de sodio y 1 ml de colorante de pararosanilina. Mezclar suavemente durante 30 s y dejar actuar durante 2 min.</li>
		<li>Añadir la solución preparada en el paso 5.2.2 al otro frasco de Coplin precalentado que contiene la solución madre básica. Mezclar bien la solución e introducir los portaobjetos del frasco de Coplin en el paso 5.3.3.</li>
		<li>Incubar durante 15-20 min en RT.</li>
		<li>Enjuague las rodajas en otro frasco de Coplin con 200 ml de PBS durante 5 minutos.</li>
		<li>Contra-manchar las rodajas con hematoxilina 100% durante 30 s en un frasco de Coplin.</li>
		<li>Deshidrate las rodajas con 85%, 95% y 100% de alcohol (200 ml) durante 2 minutos cada una y trátelas en xileno (200 ml) durante 2 minutos durante 3x. Use frascos de Coplin para realizar cada paso.</li>
		<li>Asegure la sección en el vidrio de la cubierta con un cubreobjetos con resina. Asegúrese de evitar la captura de burbujas de aire.</li>
	</ol></li>
</ol>6. ELISA
<ol><li>Preparación de muestras<ol><li>Retire los tejidos blandos del fémur y la tibia del ratón. Limpie los huesos con una gasa.</li>
		<li>Colocar las muestras óseas en un tubo de microcentrífuga de 1 ml y almacenar los tubos de muestra a -80 °C. NOTA: Las muestras también se pueden almacenar en un tanque de nitrógeno líquido por no más de 6 meses.</li>
		<li>Pesar la muestra de hueso. Diluir con 0.9% PS en una proporción de 1:10. Por ejemplo, diluir 0,1 g de hueso con 1 ml de PS.</li>
		<li>Añadir perlas de zirconia de 3 mm en el tubo y moler las muestras 3x a 70 Hz durante 30 s con 20 s de descanso en el medio.</li>
		<li>Centrifugar las muestras a 4 °C y 12.000 x g durante 5 min. Recoge el sobrenadante.</li>
	</ol></li>
	<li>Kit de ensayo ELISA NOTA: Realice ELISA de acuerdo con el protocolo de ensayo especificado por el fabricante.<ol><li>Agregue 100 μL de cada dilución de pocillos estándar, en blanco y de muestra en los pocillos apropiados. Incubar durante 90 min a 37 °C.</li>
		<li>Decantar el líquido de cada pocillo y añadir 100 μL de solución de trabajo de anticuerpos de detección biotinilados. Incubar durante 1 h a 37 °C.</li>
		<li>Decantar la solución, añadir 350 μL de tampón de lavado a cada pocillo. Remojar durante 1 min, repetir 3x.</li>
		<li>Agregue 100 μL de solución de trabajo conjugada HRP a cada pocillo. Incubar durante 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Decantar la solución. Repita el proceso de lavado 5 veces como se describe en el paso 6.2.3.</li>
		<li>Añadir 90 μL del reactivo de sustrato. Incubar durante 15 min a 37 °C protegido de la luz.</li>
		<li>Añadir 50 μL de la solución de parada.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilice un lector de placas para registrar la absorbancia de cada pocillo a 450 nm.</li>
	<li>Generación de curvas estándar<ol><li>Trazar los respectivos valores medios de absorbancia contra las concentraciones de proteínas diluidas en serie.</li>
		<li>Une los puntos para crear la curva de mejor ajuste. Utilice cualquier aplicación informática apropiada (hoja de cálculo) para generar la ecuación de curva estándar.</li>
	</ol></li>
	<li>Sustituya el valor de absorbancia de cada muestra en la ecuación de curva estándar para obtener la concentración de la muestra respectiva.</li>
</ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

La preparación de la solución fitoquímica es la base para su aplicación in vivo. En este protocolo, la preparación de la solución de naringenina se demostró mediante el uso de diferentes disolventes, como etanol, DMSO, Tween 80 y PS al 0,9%. La solución en estado completamente disuelto debe controlarse aún más permitiendo que permanezca a temperatura ambiente durante algunas horas prolongadas y luego filtrada antes de usarse in vivo.
La determinación del disolvente es un paso...

Con el aumento de los estudios sobre el uso de compuestos fitoquímicos para la detección de fármacos, vale la pena prestar atención a los enfoques para preparar soluciones fitoquímicas para evaluar sus efectos óptimos. Muchos aspectos, como la metodología de disolución, la dosis y la concentración, deben considerarse al preparar el compuesto1.
La disolución a base de solvente es ampliamente utilizada para la preparación de compuestos orgánicos1. Los disolventes comúnmente utilizados incluyen agua, aceite, dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, etanol, ácido fórmico, Tween, glicerina, etc2. Aunque una suspensión con sustancias no disueltas es aceptable cuando el compuesto se administra por sonda gástrica, un soluto completamente disuelto es crítico para la administración intravenosa. Dado que la solución de aceite, la suspensión y la emulsión pueden causar embolias capilares, se sugiere una solución acuosa para la preparación del compuesto, especialmente cuando se administran inyecciones intravenosas, intramusculares e intraperitoneales3.
El rango de dosis efectivas varía entre compuestos e incluso entre enfermedades tratadas con el mismo compuesto. Las determinaciones de la dosis efectiva y segura y de la concentración dependen de la literatura y de los experimentos preliminares4. Aquí, la preparación del compuesto naringenina se demuestra como ejemplo.
La naringenina (4,5,7-trihidroxiflavanona), un compuesto polifenólico, se ha estudiado en el tratamiento de enfermedades por sus actividades hepatoprotectoras5, antidiabéticas6, antiinflamatorias7 y antioxidantes8. Para aplicaciones in vivo, la administración oral de naringenina se utiliza comúnmente. Estudios previos informaron la preparación de una solución de naringenina en 0,5% -1% de carboximetilcelulosa, dosis de metilcelulosa al 0,5%, DMSO al 0,01% y solución salina fisiológica (PS) a 50-100 mg / kg, administrada por sonda oral 9,10,11,12. Además, otros estudios han reportado suplementar naringenina con comida al 3% (peso / peso) para la ingesta oral a una dosis de 3,6 g / kg / día13,14. Los estudios también han reportado el uso de etanol (0,5% v/v), PS y DMSO para disolver naringenina para inyección intraperitoneal a dosis de 10-50 mg/kg15,16,17,18. En un estudio de epilepsia del lóbulo temporal, los ratones recibieron una inyección de naringenina suspendida en carboximetilcelulosa al 0,25% disuelta en PS19. Aunque estos estudios informan el uso de diferentes disolventes para preparar soluciones de naringenina, no se han informado más detalles, como el estado de disolución y la respuesta animal.
Este protocolo introduce un procedimiento para preparar una solución de naringenina para su aplicación in vivo en la osteoporosis inducida por diabéticos. La preparación de la solución inyectable incluye la preparación de disolventes y compuestos, la estimación de la dosis, el proceso de disolución y la filtración. La dosis se determinó en base a la investigación bibliográfica y experimentos preliminares mediante el monitoreo de ratones después de administrar inyecciones todos los días durante 3 días y modificando la dosis de acuerdo con los comportamientos del ratón. La concentración final elegida (20 mg/kg p.v.) se administró por vía intraperitoneal 5 días a la semana durante 8 semanas en ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ)20,21. Los efectos de la naringenina en la osteoporosis diabética se evaluaron mediante pruebas de glucosa en sangre, micro-CT, tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
En general, se observó que la naringenina en un rango de concentración de 40-400 mg / ml no se disolvió completamente en etanol o DMSO o 5% (etanol o DMSO) más 95% PS (v / v). Sin embargo, la naringenina se disolvió completamente en una mezcla de 3,52% DMSO, 3,52% Tween 80 y 92,96% PS. El procedimiento detallado ayudará a los investigadores a preparar el compuesto como una solución de inyección para la aplicación in vivo .

<table><tbody><tr><td>1.5 mL &nbsp; microtubos</td><td>Corning Science (Wujiang) Co.</td><td>23218392</td><td></td></tr><tr><td>Deshidratador automático</td> de líquido de retención <td>Leica Microsystems (Shanghai) Co.</td><td>LEICA ASP 300S</td><td>Muestras deshidratadas</td></tr><tr><td>Tiras reactivas de glucosa en sangre</td><td>Johnson & Johnson (China) Equipo Médico Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>4130392 MIULAB</td><td>Centrífuga diminuta</td><td>Solución centrífuga</td></tr><tr><td>Deshidratador</td><td>Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co.</td><td>LEICA&nbsp; ASP300S</td><td>Deshidratación</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>E918BA0041</td><td>Kit de</td></tr><tr><td>ensayo ELISA</td> cosolvente <td>Elabscience Biotechnology Co., Ltd</td><td>Ratón COL1 (colágeno tipo I) Kit ELISA: E-EL-M0325c Ratón&nbsp; Kit CTX I ELISA: E-EL-M0366c Kit de ELISA PICP para ratón: E-EL-M0231c Kit de ELISA PINP para ratón: E-EL-M0233c</td><td></td></tr><tr><td>Absoluto de etanol</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10009218</td><td>Éter monoetílico de</td></tr><tr><td>etilenglicol</td> cosolvente <td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A501118-0500</td><td>Tinción TRAP</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10009617</td> Filtro de <td>descalcificación</td></tr><tr><td></td><td>Merck Millpore LTD.</td><td>Millex-GP, 0,22 y micro; m</td><td>solución de filtro</td></tr><tr><td>Ácido glacial</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10000218</td><td>TRAP tinción</td></tr><tr><td>Medidor de glucosa</td><td>Johnson & Johnson (China) Equipo Médico Co.</td><td>One Touch Ultra Vue</td><td>Número de serie:COJJG8GW</td></tr><tr><td>Grinder</td><td>Shanghaijingxin Tecnología Experimental</td><td>Tissuelyser-24</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Nanjing Jiancheng Instituto de Bioingeniería</td><td>D005</td><td>TRAP tinción</td></tr><tr><td>Jeringa de insulina</td><td>Shanghai Kantaray Medical Devices Co.</td><td>0,33 mm x 13 mm, RW LB</td><td>Inyección intraperitoneal</td></tr><tr><td>Ácido tartárico L-(+)</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>100220008</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td> de tinción <td>TRAP Microtomo de observación OLYMPUS</td><td>sz61</td><td>Leica</td></tr><tr><td></td><td>Microsystems (Shanghai) Trading Co.</td><td>LEICA RM 2135</td><td>Sección</td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td>Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd.</td><td>&nbsp; Centrífuga Mini-6KC</td><td></td></tr><tr><td>Naftol AS-BI Fosfato</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>BCBS3419</td><td>TRAP tinción</td></tr><tr><td>Naringenina</td><td>Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>102764</td><td></td></tr><tr><td>Estación de inclusión de parafina</td> de soluto <td>Leica Microsystems (Shanghai) Co.</td><td>LEICA&nbsp; EG 1150 H, LEICA&nbsp; EG 1150 C</td><td>Embed&nbsp; muestras</td></tr><tr><td>Base de pararosanilina</td><td>BBI Life Sciences</td><td>E112BA0045</td><td>tinción TRAP</td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>eppendorf</td><td>2&ndash; 20 y micro; L, 100&ndash; 1000 y micro; L, 20&ndash; 200 y micro; L</td><td>&nbsp; transferre Lector de placas líquidas</td></tr><tr><td></td><td>BioTek Instruments USA, Inc.</td><td>Lector de imágenes BioTek CYTATION 3</td><td>Resina ELISA</td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd.</td><td>Bálsamo neutro</td><td>TRAP tinción salina</td></tr><tr><td>(0.9 PS)</td><td>Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd</td><td>A6E1323</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>Acetato de sodio anhidro</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>Merck-1.06268.0250 | 250g</td><td>Tinción TRAP</td></tr><tr><td>Nitrito de sodio</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10020018</td><td>Tinción TRAP</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sangon Biotech (Shanghai ) Co., Ltd.</td><td>E819BA0006</td><td>Emulsionante</td></tr><tr><td>Perlas de circonio</td><td>Shanghaijingxin Tecnología experimental</td><td>11079125z 454g</td><td>Molienda</td></tr></tbody></table>

preparación de la solución de naringenina para aplicación in vivo

Preparation of Naringenin Solution for In Vivo Application

La preparación de una solución compuesta (fitoquímica) es un paso pasado por alto pero crítico antes de su aplicación en estudios como la detección de fármacos. La solubilización completa del compuesto es necesaria para su uso seguro y resultados relativamente estables. Aquí, se demuestra como ejemplo un protocolo para preparar solución de naringenina y su administración intraperitoneal en un modelo diabético inducido por estreptozotocina (STZ) y dieta alta en grasas y estreptozotocina. Se utilizó una pequeña cantidad de naringenina (3,52-6,69 mg) para probar su solubilización en disolventes, incluyendo etanol, dimetilsulfóxido (DMSO) y DMSO más Tween 80 reconstituido en solución salina fisiológica (PS), respectivamente. La solubilización completa del compuesto se determina observando el color de la solución, la presencia de precipitados después de la centrifugación (2000 x g durante 30 s) o dejando reposar la solución durante 2 h a temperatura ambiente (RT). Después de obtener un compuesto estable/solución fitoquímica, la concentración/cantidad final del compuesto requerida para los estudios in vivo puede prepararse en una solución madre de disolvente solamente (sin PS), y luego diluirse/mezclarse con PS según se desee. Los efectos osteoporóticos antidiabéticos de naringenina en ratones (administración intraperitoneal a 20 mg/kg p.v., 2 mg/ml) se evaluaron midiendo la glucosa en sangre, la masa ósea (micro-CT) y la tasa de resorción ósea (tinción TRAP y ELISA). Los investigadores que buscan preparaciones detalladas de soluciones orgánicas / fitoquímicas se beneficiarán de esta técnica.

Se encontró que el peso corporal de los ratones diabéticos alimentados con dieta alta en grasas e inducidos por STZ disminuyó en comparación con el de los grupos de control de 0 a 8 semanas después del tratamiento con STZ. La pérdida de peso de los ratones tratados con naringenina fue significativa en comparación con los ratones no tratados (grupo STZ) en la semana 4. Los grupos control y STZ fueron administrados con el mismo volumen de PS (Tabla 1). El nivel de glucosa en sangre en ratones diabéticos au...

Aquí, el protocolo presenta la preparación de la solución de naringenina para la administración intraperitoneal in vivo . Naringenina se disuelve completamente en una mezcla de dimetilsulfóxido, Tween 80 y solución salina. Los efectos osteoporóticos antidiabéticos de la naringenina se evaluaron mediante pruebas de glucosa en sangre, tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.

Preparación de la solución de naringenina para aplicación in vivo

The preparation of a compound (phytochemical) solution is an overlooked but critical step prior to its application in studies such as drug screening. The ...

Con el aumento de los estudios relacionados con los componentes fitoquímicos para los enfoques de detección de fármacos para preparar la solución fitoquímica para la evaluación de los efectos óptimos, estaba prestando atención a las ventajas de este protocolo como operación simple y bajo costo. Este protocolo beneficiará a los investigadores que se ocupan de la detección de medicamentos de la farmacología. Sugerimos comenzar con una pequeña cantidad de compuesto fitoquímico para experimentos preliminares, considerando el costo de consumo.En segundo lugar, se recomienda usar una jeringa de insulina sobre una jeringa regular Para preparar una solución de naringenina de dos miligramos por mililitro en etanol, pese 3.52 miligramos de polvo de naringenina y agréguela a un tubo de dos mililitros. Gire rápidamente el tubo para asentar el polvo en la parte inferior del tubo. A continuación, agregue 8.8 microlitros de etanol al 100% al tubo para preparar una solución al 0.5%.Luego agregue 79.2 microlitros de etanol al 100% al tubo para preparar una solución al 5%. A continuación, agregue 1.672 mililitros de solución salina fisiológica al 0.9% al tubo que contiene la solución al 5%. Esto producirá una emulsión.Luego, la centrífuga rechazó el tubo para verificar si la naringenina está completamente disuelta en la solución. Pueden aparecer precipitados blancos de naringenina no disuelta en la solución. Luego, para preparar una solución de naringenina de dos miligramos por mililitro en DMSO, pese 3.95 miligramos de polvo de naringenina y agréguela a un tubo de dos mililitros.Después de un giro rápido, agregue 9.8 mililitros de DMSO al tubo para preparar una solución al 8.5%. Luego agregue 88.2 microlitros de DMSO al tubo para preparar una solución al 5%. A continuación, agregue 1.877 mililitros de solución salina al 0.9% a la solución.Esto dará como resultado una emulsión. Centrifuga la solución para comprobar si la naringenina está completamente disuelta. Los precipitados blancos tienen naringenina no disuelta pueden aparecer en la solución.Luego, para preparar una solución de naringenina de dos miligramos por mililitro en Tween 80 y DMSO, pese 6.69 miligramos de polvo de naringenina y agréguela a un tubo de cinco mililitros. Gire rápidamente el tubo y agregue 117.7 microlitros de DMSO para preparar una solución al 3.5%. Luego agregue 117.7 microlitros de Tween 80 a la solución para alcanzar una concentración de 3.5% Tween 80 y 3.5% DMSO.Agregue lentamente esta solución a otro tubo de cinco mililitros que contenga 3109.6 microlitros de solución salina al 0.9% y agite bien para obtener una solución clara de naringenina. Después de dos horas, la solución permanecerá clara sin precipitados visibles. Para administrar la solución de naringenina, levante un ratón macho C57 negro de cinco semanas de edad por la base de su cola y colóquelo sobre una superficie sólida colocando suavemente su cola hacia atrás.A continuación, agarre el cuello detrás de las orejas con el pulgar izquierdo y el índice y coloque la cola entre el dedo meñique y el anular. Mantenga el ratón en posición supina con su extremo posterior ligeramente elevado. Para inyectar la solución de naringenina, agarre la piel de la espalda del ratón para que la piel abdominal esté tensa.Luego empuje la aguja en el cuadrante inferior derecho o izquierdo del abdomen en un ángulo de 10 grados. para evitar golpear la vejiga, el hígado u otros órganos internos. Pase la aguja por vía subcutánea en una dirección craneal de tres a cinco milímetros, luego insértela en un ángulo de 45 grados en la cavidad abdominal.Una vez que la aguja pase a través de la pared abdominal, empuje lentamente la solución. Después de la inyección, sacó lentamente la aguja, girándola ligeramente para evitar fugas. Para realizar una prueba de glucosa en sangre, abra las tiras reactivas y marque la fecha.Haga una pequeña punción en la vena lateral de la cola con un pinchazo de aguja de calibre 25 y exprima una gota de sangre. Después de limpiar la gota de sangre con papel de seda, exprima otra gota de sangre y recójala en el borde de la tira reactiva. Lea y registre el resultado que se muestra en el medidor de glucosa.El peso corporal de la dieta alta en grasas alimentada y los ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina disminuyó en comparación con el de los ratones del grupo de control de cero a ocho semanas después de un tratamiento con estreptozotocina. En la cuarta semana, la pérdida de peso de los ratones tratados con naringenina fue significativa en comparación con los ratones no tratados. El nivel de glucosa en sangre en los ratones diabéticos aumentó dramáticamente dentro de un mes después de la inducción de estreptozotocina.Después de dos meses, disminuyó automáticamente a un nivel observado hace dos meses. Por el contrario, el tratamiento con naringenina redujo los niveles de glucosa en sangre en un 51,8% al mes y en un 34,8% a los dos meses en comparación con STZ. En comparación con los controles, los ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina exhibieron pérdida ósea como lo indica una disminución en el volumen óseo por volumen de tejido y el número de trabécula.Mientras tanto, el tratamiento con naringenina rescató significativamente la pérdida ósea. La actividad de los osteoclastos mostrada por el número de osteoclastos por área ósea trabecular aumentó en ratones diabéticos, aunque no se observó significación estadística entre los modelos control y de enfermedad. Aquí se muestra la tinción TRAP de hueso trabecular y osteoclastos de ratones control e inducidos por estreptozotocina.El tratamiento con naringenina disminuyó significativamente las actividades de los osteoclastos. En los animales diabéticos, el telopéptido C-terminal del colágeno tipo uno se elevó en un 68,09% y el propéptido N-terminal del Pro-colágeno tipo uno se elevó en un 204,88%, lo que indica un aumento dramático en la tasa de resorción ósea. Sin embargo, el tratamiento con naringenina disminuyó significativamente ambos indicadores de la tasa de resorción ósea.Por lo tanto, es difícil pipetear la dosis precisa. Cortar la punta hace que el pipeteo sea más fácil y preciso. Alternativamente, el volumen requerido se puede convertir en una masa, que puede ser más tarde fácilmente.El tiempo de ayuno de todos los animales antes de cada experimento de glucosa en la vejiga debe seguir siendo lo mismo durante todo el experimento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Resonancia de electrones paramagnético (EPR), espectroscopía fue empleado para detectar óxido nítrico a partir de células endoteliales aórticas bovinas y aniones radicales superóxido de los neutrófilos humanos utilizando hierro (II)-N-metil-D-glucamina ditiocarbamato, Fe...

La detección de óxido nítrico y el radical anión superóxido por espectroscopía de resonancia paramagnética de electrones de las células utilizando atrapadores

El agua de purga de producción (PBW) se trató con nanopartículas de óxido cúprico (CuO-NPs) y se evaluó la toxicidad celular en células humanas cultivadas. El objetivo de este protocolo fue integrar la muestra ambiental nativa en un formato de cultivo celular evaluando los cambios en la toxicidad debido al tratamiento con CuO-NP.

La eliminación de oligoelementos por cúprico Óxido nanopartículas de uranio<em&gt; In Situ</em&gt; Recuperación de purga de agua y su efecto sobre la viabilidad celular

Este manuscrito presenta protocolos para la aplicación de nuevas sondas de óxido nítrico (NOps) codificadas genéticamente para monitorear las fluctuaciones de NO• de una sola célula en tiempo real utilizando microscopía de fluorescencia. La formación de NO• desencadenada por Ca2+ a nivel de células endoteliales individuales se visualizó combinando geNOps con un sensor químico de Ca2+.

Aplicación de la codificados genéticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Probes, los geNOps, para imágenes en tiempo real de NO • Las señales en las células individuales

Aquí, se presenta la preparación de una decocción er-xian (EXD) en cuatro pasos-empapamiento, decocción, filtración y concentración- y demuestran la administración de un suero preparado para EXD a ratas. Estos métodos son aplicables al estudio in vivo e in vitro de las decocciones a base de hierbas como las medicinas tradicionales chinas.

Preparación de Herbal Medicine: Decocción de Er-Xian y suero que contiene Er-Xian para<em&gt; In Vivo</em&gt; Y<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimentos

Aquí, presentamos un protocolo para la síntesis y caracterización de nanopartículas de óxido de cerio (nanoceria) de ROS (especies reactivas del oxígeno) barrido en vivo, nanoceria proyección de imagen en los tejidos vegetales por microscopía confocal e in vivo seguimiento de nanoceria ROS barrido por microscopia confocal.

Depuración catalítica de planta oxígeno reactivo especie In Vivo de nanopartículas de óxido de cerio aniónicos

Aquí, presentamos protocolos para detectar el óxido nítrico y sus derivados biológicamente relevantes utilizando ensayos basados en quimioluminiscencia con alta sensibilidad.

Ensayos basados en quimioluminiscencia para la detección de óxido nítrico y sus derivados de la autoxidación y compuestos nitrosados

El protocolo presenta métodos detallados para evaluar si el adyuvante de bioemulsión ofiopogonina D promueve respuestas inmunes celulares efectivas.

In vitro Evaluación de la actividad celular del adyuvante de la vacuna de nanoemulsión Ophiopogonin D

El presente protocolo describe una operación detallada de imágenes de fluorescencia NIR-II en tiempo real de un ratón utilizando un dispositivo de imágenes ópticas NIR-II.

Una sonda de fluorescencia NIR-II brillante para imágenes vasculares y tumorales

Aquí, describimos un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de nanovesículas derivadas de endosomas como un nuevo tipo de imitadores de exosomas (EM) que comparten el mismo origen biológico y una estructura, morfología y composición proteica similares de las vesículas extracelulares (EV) nativas.

Un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de vesículas derivadas de endosomas

En este protocolo, desarrollamos un ácido retinoico (AR) encapsulado en nanoemulsión catiónica para ser utilizado como adyuvante para promover respuestas sistémicas y mucosas específicas de antígeno. Al agregar el AR aprobado por la FDA a la nanoemulsión, se promovió la sIgA específica del antígeno en la vagina y el intestino delgado después de la inyección intramuscular de la nanoemulsión.

Ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catiónica como adyuvante para promover respuestas sistémicas y mucosas específicas de OVA

Aprende a preparar soluciones de naringenina para administración intraperitoneal in vivo usando DMSO, Tween 80 y solución salina. Este método sencillo y económico facilita estudios farmacológicos sobre efectos antidiabéticos y osteoporóticos en modelos murinos.

Preparación de la solución de naringenina para aplicación in vivo

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