Name: Un modelo de ratón in vivo de anestesia intravenosa total durante la cirugía de resección del cáncer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprende a modelar anestesia intravenosa total con propofol en ratones durante cirugía de resección tumoral. Este método permite evaluar el impacto de la técnica anestésica en la recurrencia del cáncer y otros resultados postoperatorios.

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Los autores desean agradecer a los miembros del Laboratorio Neural-Inmune del Cáncer y al Dr. Cameron Nowell en el Instituto Monash de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Monash, Parkville. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica 1147498, la Fundación Nacional del Cáncer de Mama IIRS-20-025, el Colegio de Anestesistas de Australia y Nueva Zelanda (ANZCA), Perpetual y CTC for Cancer Therapeutics.

Todos los estudios en animales se llevaron a cabo bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Monash. En este estudio, se utilizaron ratones Balb / c hembras de 6-8 semanas de edad.
1. Preparar las células cancerosas
<ol><li>Cultivar células tumorales en medio. Cultivo de 66cl4 de células de cáncer de mama murino en alfa-MEM que contienen 10% de FBS y 200 mM de glutamina. Las células deben enviar mensajes de texto negativos para micoplasma. OPCIONAL: Utilice células que se transducen de manera estable para expresar luciferasa de luciérnaga para imágenes de bioluminiscencia para permitir el monitoreo de la recurrencia del cáncer después de la cirugía de resección11 (consulte el paso 4). NOTA: La línea celular y el medio mencionados anteriormente fueron utilizados en este estudio.</li>
	<li>Cultivar células a 37 °C con 5% deCO2. Células de paso asépticamente en una campana a <80% de confluencia. Utilice células de paso bajo en la fase de crecimiento logarítmico para obtener resultados óptimos in vivo .</li>
	<li>Levantar las células adherentes con 0,5 mg/ml de tripsina en PBS con 10 mM EDTA; 2 ml para un matraz T75. Cuando se levante, agregue medio para inactivar la tripsina y lave las células en PBS.</li>
	<li>Contar las células con un hemocitómetro. Diluir las células en PBS para inyección. Para 66cl4 células de cáncer de mama, inyecte 1 x 105 células en 20 μL de PBS por ratón.</li>
	<li>Coloque las células en hielo antes de la inyección.</li>
</ol>2. Generar un modelo de ratón de cáncer de mama
<ol><li>Use isoflurano al 4% para anestesiar al ratón en una cámara de inducción. Luego, mantenga la anestesia con 2% -3% de isoflurano usando un cono nasal. Confirme la anestesia adecuada por falta de respuesta al pellizco del dedo del pie.</li>
	<li>Prepare el lugar de la inyección limpiando la cuarta área izquierda de la almohadilla mamaria con un hisopo con alcohol de un solo uso.</li>
	<li>Extraiga las células tumorales (ver paso 1.4) en una jeringa Hamilton de 25 μL conectada a una aguja hipodérmica estéril de 27 G.</li>
	<li>Inyecte las células en la cuarta almohadilla mamaria izquierda. Use fórceps para asegurar y levantar la piel. Inyecte aproximadamente 1 mm del pezón.</li>
	<li>OPCIONAL: Si las células están marcadas con luciferasa, confirme la inyección exitosa de células tumorales mediante imágenes de bioluminiscencia. Inyectar 100 μL de 150 mg/kg de D-luciferina en la vena lateral de la cola de los ratones anestesiados utilizando una jeringa de insulina de 0,5 ml con una aguja hipodérmica de 30 G.</li>
	<li>OPCIONAL: Coloque el ratón en un sistema de imágenes de bioluminiscencia con la almohadilla mamaria hacia arriba. Espere 2 minutos desde la inyección de luciferina para una absorción tisular óptima de luciferina, luego imagen durante 10 s.</li>
	<li>Coloque al ratón en una jaula limpia y permita que se recupere de la anestesia.</li>
	<li>Continuar monitoreando el bienestar animal según las pautas institucionales de ética animal.</li>
</ol>3. Inducir anestesia estable con administración intravenosa de propofol
<ol><li>Monitoree el crecimiento del tumor primario usando la medición del calibrador y calcule el volumen del tumor usando la ecuación: Volumen (mm3) = (largo x (ancho)2 ÷ 2 ).</li>
	<li>Realizar cirugía de resección tumoral en ratones cuando el tumor primario alcanza el volumen requerido (aquí, 80-90 mm3).</li>
	<li>Configure una bomba de jeringa automatizada con una jeringa de insulina de 30 G 1 ml que contenga la formulación de propofol (2% Lipuro propofol) (Figura 1A).</li>
	<li>Inducir la anestesia del ratón en una cámara de inducción con sevoflurano o isoflurano al 3%. NOTA: Aquí, se utilizó sevoflurano ya que es el volátil predominante utilizado clínicamente.</li>
	<li>Transfiera el ratón a una almohadilla térmica a 37 °C durante la cirugía. Mantenga brevemente la anestesia con 2% -3% de sevoflurano usando un cono nasal.</li>
	<li>Aplique lubricante acuoso en los ojos para evitar que se sequen.</li>
	<li>Inyecte 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea para analgesia.</li>
	<li>Para prepararse para la cirugía, afeite el abdomen y prepare la piel para la cirugía con una solución de yodo-povidona. Limpie la piel con una toallita con alcohol o estéril.</li>
	<li>Para administrar TIVA a base de propofol, cannule la vena lateral de la cola con una aguja hipodérmica estéril de 30 G conectada a un catéter de poliuretano estéril. Confirme la colocación correcta mediante un flashback de sangre en el catéter (Figura 1B). Ajustar la administración de sevoflurano según sea necesario durante la canulación intravenosa para mantener una profundidad estable de anestesia demostrada por la pérdida del reflejo corneal y pedal, y la frecuencia respiratoria < 100 respiraciones por minuto.</li>
	<li>Comience propofol-TIVA administrando propofol al 2% como bolo inicial de 27 mg/kg durante más de 1 min. Suspender la administración de sevoflurano.</li>
	<li>Continuar la infusión de propofol a una velocidad de mantenimiento de 2,2-4,0 mg/kg/min para mantener una profundidad estable de la anestesia durante la cirugía (Figura 1C).</li>
</ol>4. Resecar el tumor primario
<ol><li>Haga una incisión recta de 1 cm inferior al tumor en la región de la cuarta almohadilla mamaria izquierda. Resecar cuidadosamente el tumor y el ganglio linfático inguinal izquierdo mediante disección con fórceps romos.</li>
	<li>OPCIONAL: Si usa células tumorales marcadas con luciferasa, use imágenes de bioluminiscencia para confirmar márgenes quirúrgicos claros. Inyecte 150 mg/kg de D-luciferina en la vena lateral de la cola, espere 2 min y luego tome una imagen durante 60 s utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia. Si se identifica un tumor residual, reseque tejido adicional de la almohadilla grasa mamaria y vuelva a crear una imagen para lograr márgenes claros.</li>
	<li>Asegure la hemostasia en el sitio quirúrgico y cierre la piel con suturas de nylon 5-0. Asegúrese de que el pelaje no ingrese al sitio quirúrgico.</li>
	<li>Al concluir la cirugía de resección, suspender la anestesia. Coloque el ratón en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica a 37 °C y permita que se recupere de la anestesia.</li>
	<li>Monitoree cada 15 minutos después de la anestesia hasta que el ratón haya vuelto al estado de alerta normal. Luego, monitoree el ratón cada 12 h durante 48 h después de la cirugía.</li>
	<li>Administrar 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea cada 12 h durante 48 h después de la cirugía.</li>
	<li>Después de 7-10 días, retire las suturas con cortadores de puntadas curvas estériles bajo anestesia breve con sevoflurano o isoflurano.</li>
</ol>5. Realice un seguimiento de la recurrencia del cáncer con imágenes in vivo
<ol><li>Utilice imágenes de bioluminiscencia para rastrear la recurrencia del cáncer después de la cirugía de resección de forma no invasiva. Utilice un sistema de imágenes de bioluminiscencia para monitorear a los ratones una vez por semana en busca de evidencia de recurrencia tumoral primaria o recurrencia a distancia, comenzando la semana siguiente a la cirugía.</li>
	<li>Inducir la anestesia del ratón en una cámara de inducción con isoflurano al 4%. Luego, transfiera el ratón a una almohadilla térmica de 37 ° C durante la anestesia y mantenga la anestesia con isoflurano al 2% -4% usando un cono nasal.</li>
	<li>Aplique lubricante acuoso en los ojos para evitar que se sequen.</li>
	<li>Inyecte D-luciferina 150 mg/kg en la vena lateral de la cola. Espere 2 minutos, luego mida la bioluminiscencia durante una exposición de 60 s para detectar la recurrencia del tumor primario o metástasis a distancia.</li>
	<li>Si el tumor primario recidiva y se vuelve palpable, comience a monitorear el crecimiento del tumor utilizando mediciones de calibrador.</li>
	<li>Al final del experimento, mata humanamente a los ratones de acuerdo con el protocolo aprobado. Aquí, se utilizó CO2 , seguido de luxación cervical.</li>
</ol>

<ol><li>Sullivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+surgery%3A+delivering+safe%2C+affordable%2C+and+timely+cancer+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Global cancer surgery: delivering safe, affordable, and timely cancer surgery.</a> Lancet Oncology. 16 (11), 1193-1224 (2015).</li>
<li>Lim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+propofol+and+sevoflurane+on+cancer+cell%2C+natural+killer+cell%2C+and+cytotoxic+T+lymphocyte+function+in+patients+undergoing+breast+cancer+surgery%3A+an+in+vitro+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The effect of propofol and sevoflurane on cancer cell, natural killer cell, and cytotoxic T lymphocyte function in patients undergoing breast cancer surgery: an in vitro analysis.</a> BMC Cancer. 18 (1), 159(2018).</li>
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<li>Hong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+and+long-term+survival+after+cancer+surgery-total+intravenous+versus+volatile+anesthesia%3A+a+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Anesthetics and long-term survival after cancer surgery-total intravenous versus volatile anesthesia: a retrospective study.</a> BMC Anesthesiology. 19 (1), 233(2019).</li>
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<li>Sloan, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sympathetic+nervous+system+induces+a+metastatic+switch+in+primary+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The sympathetic nervous system induces a metastatic switch in primary breast cancer.</a> Cancer Research. 70 (18), 7042-7052 (2010).</li>
<li>Al-Hashimi, M., Scott, S. W. M., Thompson, J. P., Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opioids+and+immune+modulation%3A+more+questions+than+answers%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Opioids and immune modulation: more questions than answers.</a> British Journal of Anaesthesia. 111 (1), 80-88 (2013).</li>
<li>DeMarco, G. J., Nunamaker, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+the+effects+of+pain+and+analgesia+on+immune+system+function+and+inflammation%3A+relevance+for+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">A Review of the effects of pain and analgesia on immune system function and inflammation: relevance for preclinical studies.</a> Comparative Medicine. 69 (6), 520-534 (2019).</li>
<li>Hiller, J. G., Perry, N. J., Poulogiannis, G., Riedel, B., Sloan, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perioperative+events+influence+cancer+recurrence+risk+after+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Perioperative events influence cancer recurrence risk after surgery.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (4), 205-218 (2018).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Este estudio informa sobre un protocolo para administrar anestesia intravenosa total (TIVA) con propofol en un modelo de ratón de cáncer de mama que replica aspectos clave de la práctica clínica para TIVA en pacientes que requieren cirugía de cáncer. El protocolo permite la investigación de resultados clínicamente relevantes a corto y largo plazo después de la cirugía de cáncer en un modelo de ratón de progresión del cáncer, incluida la medición de los niveles de citoquinas y la recurrencia del cáncer (<strong class="xfi...

Más de 60 % de los pacientes con cáncer reciben anestesia para la resección quirúrgica1. Actualmente, no existen guías clínicas específicas que determinen la elección de la anestesia utilizada en pacientes con cáncer. Las encuestas de anestesiólogos indican una preferencia por la anestesia volátil, incluso durante la cirugía del cáncer 2,3. Sin embargo, hay un creciente cuerpo de evidencia de que el uso de anestesia intravenosa total (TIVA) a base de propofol durante la cirugía del cáncer puede asociarse con mejores resultados posoperatorios (supervivencia libre de progresión, supervivencia general) en comparación con la anestesia volátil4. Estudios clínicos posteriores continúan reportando resultados contradictorios 5,6,7,8. Estos hallazgos respaldan la necesidad de estudios preclínicos para comprender mejor los efectos mecanicistas de diferentes agentes anestésicos en los resultados relacionados con el cáncer.
Sin embargo, en los estudios in vivo que modelan la cirugía del cáncer, la anestesia es con frecuencia una parte incidental del procedimiento. La justificación para la elección de la anestesia a menudo no es el foco del diseño experimental, y su impacto en los puntos finales relacionados con el cáncer puede no ser evaluado. Por ejemplo, los estudios in vivo que requieren mantenimiento de anestesia para la cirugía del cáncer utilizan con mayor frecuencia anestesia volátil inhalada9. Cuando el propofol ha sido utilizado en estudios in vivo , ha sido administrado por dosificación en bolo único con administración intraperitoneal, que no replica los protocolos oncoanestésicos clínicos10. Ese enfoque de administración de propofol induce una anestesia ligera que es adecuada para procedimientos rápidos. Sin embargo, no permite el mantenimiento de la anestesia que se requiere para la cirugía de resección del cáncer que puede ser prolongada. Además, la cinética de absorción de la administración intraperitoneal es distinta de los métodos clínicos de administración.
Se desarrolló un modelo de TIVA basada en propofol para la cirugía de resección del cáncer para abordar esta necesidad. Se desarrolló un protocolo para el mantenimiento sostenido de la anestesia con titulación del agente anestésico para permitir la respuesta al estímulo quirúrgico para replicar aspectos clave de la administración del anestésico a los pacientes sometidos a cirugía de cáncer. El protocolo resultante se utiliza con un modelo de ratón de cáncer para proporcionar TIVA durante la cirugía de resección del cáncer. Se evalúa el efecto sobre los resultados relacionados con el cáncer a corto y largo plazo.

<table><tbody><tr><td>0,9% solución salina</td><td>Fresnius Kabi</td><td>AUST AUST R 197198</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas arteriales</td><td>Proscitech</td><td>TS1322-140</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Temgesic</td><td>TEMG I</td><td></td></tr><tr><td>Colchoneta quirúrgica calefactada</td><td></td> <td>Aguja</td> hipodérmica personalizada (30 G, jeringa de <td></td></tr><tr><td>insulina de 1 mL)</td><td>Terumo</td><td>NN3013R</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td>126274</tr><tr><td>Luciferin</td><td>Promega</td><td>P1041/2/3</td><td></td></tr><tr><td>Catéter de poliuretano</td><td>Intramedic</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Povidona Yodada</td><td>Betadine</td><td>AUST R 29562</td><td></td></tr><tr><td>Propofol Lipuro, 2%</td><td>Braun</td><td>3521490</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurano</td><td>Baxter</td><td>ANZ2L9117</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizador de Sevoflurano</td><td>Vetquip</td><td>VQ1334</td><td></td></tr><tr><td>Gasa estéril</td><td>Multigate Medical Products</td><td>11-600A</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Proscitech</td><td>TS1044</td><td></td></tr><tr><td>Suturas, nylon 5-0</td><td>Dynek</td><td>V504</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas (1 mL)</td><td>Terumo</td><td>SS+01T</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón in vivo de anestesia intravenosa total durante la cirugía de resección del cáncer

An In Vivo Mouse Model of Total Intravenous Anesthesia During Cancer Resection Surgery

La anestesia es un componente rutinario de la atención del cáncer que se utiliza para procedimientos diagnósticos y terapéuticos. La técnica anestésica se ha implicado recientemente en el impacto de los resultados del cáncer a largo plazo, posiblemente a través de la modulación de las respuestas adrenérgico-inflamatorias que afectan el comportamiento de las células cancerosas y la función de las células inmunes. La evidencia emergente indica que la anestesia intravenosa total (AIV) basada en propofol puede ser beneficiosa para los resultados del cáncer a largo plazo en comparación con la anestesia volátil inhalada. Sin embargo, los hallazgos clínicos disponibles son inconsistentes. Los estudios preclínicos que identifican los mecanismos subyacentes involucrados son críticamente necesarios para guiar el diseño de estudios clínicos que acelerarán la comprensión. La mayoría de los modelos preclínicos de anestesia se han extrapolado del uso de anestesia en la investigación in vivo y no están diseñados de manera óptima para estudiar el impacto de la anestesia en sí como el punto final primario. Este documento describe un método para administrar anestesia con propofol-TIVA en un modelo de ratón de resección de cáncer de mama que replica aspectos clave de la administración clínica en pacientes con cáncer. El modelo se puede utilizar para estudiar los mecanismos de acción de la anestesia en los resultados del cáncer en diversos tipos de cáncer y se puede extrapolar a otras áreas no cancerosas de la investigación preclínica de la anestesia.

Este método describe un modelo de anestesia intravenosa total (TIVA) con propofol durante la cirugía de resección del cáncer en ratones. El propofol se administra en este modelo de ratón a través de un catéter intravenoso utilizando una bomba de jeringa (Figura 1A, B) para replicar la administración de TIVA en el entorno clínico de la anestesia para la cirugía del cáncer. El uso de la bomba de jeringa minimiza la exposición a la anestesia volátil al permitir una conversión r...

Este artículo describe un método para modelar la anestesia intravenosa total (TIVA) durante la cirugía de resección del cáncer en ratones. El objetivo es replicar las características clave de la administración de anestesia a pacientes con cáncer. El método permite investigar cómo la técnica anestésica afecta la recurrencia del cáncer después de la cirugía de resección.

Un modelo de ratón in vivo de anestesia intravenosa total durante la cirugía de resección del cáncer

Anesthesia is a routine component of cancer care that is used for diagnostic and therapeutic procedures. The anesthetic technique has recently been ...

Este novedoso protocolo describe la anestesia quirúrgica en ratones con anestesia con propofol. El método permite la investigación de la anestesia con propofol en modelos de ratón de la enfermedad. El protocolo permite la evaluación de la anestesia intravenosa total y evita el uso de anestesia volátil.El protocolo se puede utilizar para explorar cómo la anestesia con propofol afecta los resultados relacionados con la enfermedad. Por ejemplo, aquí evaluamos los resultados del cáncer a corto y largo plazo después de la cirugía para extirpar el tumor. Para comenzar, cultive 66 células de cáncer de mama CL4 Mirai que se transducen de manera estable para expresar luciferasa luciérnaga en medio alfa MEM que contiene 10% FBS y 200 milimolar glutamina.Incubar las células a 37 grados centígrados pero 5% de dióxido de carbono. Subcultivo de las células cuando las células alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia. Cuando las células están en una fase de crecimiento logarítmico con dos mililitros de goteo en solución de EDTA, levante las células adherentes y cuente las células con un hemocitómetro.Luego diluya las células en PBS y mantenga la suspensión celular diluida en hielo hasta que

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El modelo de ratón completa estasis de la vena cava inferior trombosis cava produce cantidades cuantificables de los tejidos de la pared venosa y trombosis. Que ha demostrado ser útil para evaluar las interacciones entre la pared de la vena y el trombo oclusivo y en la evaluación de la progresión de la aguda a la inflamación crónica.

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Fuente: Alomari, S., et al. Implementación de la resección de tumores cerebrales mínimamente invasivos en roedores para la recolección de tejidos de alta viabilidad. J. Vis. Exp. (2022)Este video demuestra el uso de un sistema de resección mínimamente invasivo (MIRS) para extirpar el tejido tumoral de un ratón anestesiado implantado con un tumor. El procedimiento consiste en asegurar el ratón en un marco estereotáctico, reabrir el sitio quirúrgico anterior para acceder al cerebro e insertar una...

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