Estudios de interacciones chaperona-cochaperona utilizando un ensayo homogéneo basado en cuentas

Construimos un ensayo homogéneo basado en cuentas para estudiar las interacciones chaperona-cochaperona. Utilizando esta técnica, cribamos pequeñas moléculas que inhiben las interacciones entre Hsp90 y FKDP51 o FKBP52 e identificamos inhibidores potentes y selectivos. Esta técnica de cribado de alto rendimiento es robusta y fiable.

Los resultados se pueden obtener dentro de una hora, y solo requiere pequeñas cantidades de proteínas y compuestos de perlas. La interacción de Hsp90 con estas cochaperonas se implicó en trastornos humanos, como la enfermedad de Alzheimer, el cáncer, la enfermedad autoinmune. Esta técnica brinda la oportunidad de detectar inhibidores de chaperona-cochaperona con alta importancia médica.

Aquí está el principio básico de este ensayo. Cuando la interacción entre el péptido Hsp90C-Terminal y el dominio TPR de las cochaperonas acerca las perlas del donante y del aceptor, se genera una señal altamente amplificada. Cuando se agregan los inhibidores de la interacción, las perlas donante y aceptora no pueden alcanzar la proximidad y no se produce ninguna señal detectable.

Comience diluyendo el péptido Hsp90 en PBS a una concentración de miligramo por mililitro. Diluya las perlas aceptoras no conjugadas en PBS y transfiera las perlas a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar las perlas diluidas para lavarlas y luego retirar cuidadosamente el sobrenadante.

Para la conjugación, establezca las perlas aceptoras en péptidos en una proporción de 10 a 1. A las perlas de paletida en el péptido diluido PBS, Tween 20 y solución de cianoboroughhidruro de sodio, e incubar con agitación de extremo a extremo en un agitador rotativo. Para bloquear los sitios no reaccionados, agregue 20 microlitros de una solución molar de clorhidrato Tris de pH 8.0 a las perlas, y saciar la reacción incubando durante una hora a 37 grados Centígrados.

Al final de la incubación, lave las perlas por centrifugación y vuelva a suspender el pellet de perlas en un mililitro de solución de clorhidrato Tris. Repita el lavado dos veces más. Después del último lavado, vuelva a suspender las perlas a una concentración de un miligramo por mililitro en el tampón de almacenamiento y guarde la solución de perla aceptora conjugada a 4 grados Celsius protegida de la luz.

Agregue perlas de donantes de glutatión a una concentración de 10 microgramos por mililitro en PBS. Agregue GSTFKBP51 a una concentración final de 10 microgramos por mililitro e incube la reacción durante 10 minutos a 25 grados Celsius en la oscuridad. Realice diluciones seriadas del compuesto de prueba en DMSO.

Agregue 0.25 microlitros de diluciones de compuestos de prueba y triplique en la esquina de cada pozo de una placa de 384 pozos. Para el control negativo, agregue 0.25 microlitros de DMSO y para el control positivo, agregue 0.25 microlitros de péptido Hsp90 C-Terminal en los pozos. Agregue 22.5 microlitros de la solución que contiene perlas donantes de glutatión con proteínas marcadas con GST a cada pozo.

Agite bien el plato con las manos e incube en la oscuridad a 25 grados centígrados durante 15 minutos. Diluya las perlas aceptoras con el péptido Hsp90C-Terminal unido a 100 microgramos por mililitro de concentración en 0,5 veces PBS. Agregue 2.25 microlitros de perlas aceptoras diluidas a cada pozo.

Agitar e incubar el plato en la oscuridad durante 15 minutos como se ha demostrado. Encienda el instrumento lector de placas, mida la señal de la placa y analice los datos como se describe en el manuscrito de texto. Cree una tabla de datos X-Y en el cuadro de diálogo de bienvenida, seleccione números X, Y e introduzca tres valores de réplica en columnas en paralelo.

Importe los valores de concentración a la columna X y los valores de señal a la columna Y. Haga clic en analizar, seleccione concentración de transformación X y, a continuación, seleccione transformar en logaritmos. Haga clic en analizar y elija regresión no lineal en Análisis X-Y.

Abra la opción de inhibición de la dosis-respuesta y elija la ecuación de pendiente variable logarít registro versus respuesta. Haga clic en Aceptar para ver los resultados que contienen el valor IC50 y los gráficos. Este ensayo se utilizó para el cribado de moléculas pequeñas, inhibiendo las interacciones entre Hsp90 y FKBP51 o FKBP52.

La puntuación Z de más de 0,8 y la relación señal-fondo de 13,35 demuestran la robustez y fiabilidad para el cribado de alto rendimiento. Se evaluó el efecto del compuesto de prueba de peso molecular pequeño D10 sobre la inhibición de las interacciones chaperona-cochaperona y se calcularon los valores de IC50, donde D10 mostró inhibición dependiente de la dosis. El valor ic50 para las interacciones Hsp90 GSTFKBP51 fue de 65 nanomolares.

Mientras que para Hsp90, las interacciones GSTFKBP52, la inhibición completa no se logró con la mayor concentración de compuestos indica que se puede lograr la inhibición selectiva de la interacción proteína-proteína con moléculas pequeñas. El paso crítico es el orden de adición. Primero formamos un complejo entre una molécula pequeña y su objetivo TPR.

De lo contrario, se requiere una incubación más larga y concentraciones de compuestos más altas. Podemos usar esta técnica para detectar moléculas pequeñas que interrumpan la interacción entre Hsp90 y FKB51 o Hsp90 y FKB52. También se puede extender a cualquier interacción entre Hsp90, Hsp70 y un motivo TPR que contenga inhibidores selectivos de detección de cochaperona.