Name: Detección automatizada y de alto rendimiento de la adherencia bacteriana a las células huésped (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Aprende a detectar la adherencia bacteriana a células huésped mediante un método automatizado de alto rendimiento con marcaje fluorescente. Esta técnica reduce el tiempo de manipulación y mejora la reproducibilidad en estudios de interacciones patógeno-huésped.

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Estamos agradecidos a la Dra. Kaite Zlotkowski de Biotek Inc. por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa bajo el número de contrato W911NF1920013 a PdF, la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA) y el Departamento del Interior bajo el Contrato No. 140D6319C0029 a PdF. El contenido de la información no refleja necesariamente la posición o la política del Gobierno, y no debe inferirse ningún respaldo oficial.

1. Cultivo celular A549
<ol><li>Mantener la línea celular A549 en medio F-12K suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% e incubar a 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Cambiar el medio cada 3-4 días y pasar al 85%-95% de confluencia.</li>
	<li>Brevemente, enjuague las células con 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.4, a menos que se indique lo contrario) y trate con 1 ml de solución de ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) al 0,25% de tripsina-0,53 mM (sumergiendo la capa celular) durante aproximadamente 2 min a 37 °C.</li>
	<li>Agregue 6 ml adicionales de medio de crecimiento completo (medio F-12K + 10% FBS) para detener la actividad de la proteasa. Luego, coloque las células en un matraz de cultivo de tejido T-75 de poliestireno estéril a una relación de subcultivo de 1: 3-1: 8. El volumen final de cultivo es de 12 mL.</li>
	<li>Sembra aproximadamente 1 x 104 células A549 (concentración celular: ~1 x 105 células/ml) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos un día antes de los ensayos de adherencia.</li>
</ol>2. Crecimiento bacteriano y tinción
<ol><li>Realizar todo el trabajo bacteriano en un Gabinete de Bioseguridad, Laboratorio de Bioseguridad Nivel 2.</li>
	<li>Inocular todos los cultivos bacterianos, incluyendo P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes y B. subtilis, etc., del caldo de glicerol congelado y cultivarlos en caldo de soja tríptico (TSB, 3 mL) en una incubadora de agitación a 37 °C durante la noche mantenida a 250 rpm.</li>
	<li>Al día siguiente, use una dilución 1:100 del cultivo nocturno para inocular un subcultivo y cultivarlos en TSB (1 mL) durante 3 h hasta la fase exponencial, mida el OD a 600 nm (OD600)para confirmar. Asegúrese de que el OD600 esté en el rango de 0.4-0.6.
</li>
	<li>Antes de realizar el ensayo de adherencia bacteriano-huésped, diluciones en serie de placas de suspensión bacteriana en placas de Agar TSB, incube durante la noche a 37 ° C y luego establezca las UFC bacterianas a partir del número de colonias. Para P. aeruginosa, un OD600 de 1.0 corresponde a 2 x 108 células bacterianas viables/mL, y para L. monocytogenes, un OD600 de 1.0 corresponde a 9 x 108 células bacterianas viables/mL.</li>
	<li>Cosechar los cultivos bacterianos en fase exponencial por centrifugación a 13.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente (RT), luego lavarlos una vez usando 1x PBS (1 mL). Resuspend los gránulos bacterianos en 1 mL de 1x PBS y determinar las concentraciones midiendo OD600 de suspensiones bacterianas. Por ejemplo, P. aeruginosa con OD600 de 0,5 representa una concentración de 1 x 108 células bacterianas/ml.</li>
	<li>Tiñe la suspensión bacteriana usando un tinte fluorescente verde o rojo en RT durante 30 minutos con una rotación suave en la oscuridad. Para esto, agregue 2 μL del tinte de tinción concentrado de stock 500 veces en 1 ml de suspensión bacteriana para diluir el tinte 1 veces. Para lavar el tinte de tinción, centrífuga las bacterias teñidas a 13,000 x g durante 2 min y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de 1x PBS por tres veces. NOTA: Si en el experimento se utilizan bacterias marcadas con fluorescencia (GFP, RFP, mCherry-, etc.), omita este paso de tinción bacteriana. En este protocolo se utilizaron P. aeruginosa marcada con GFP- y L. monocytogenes teñidas con colorante fluorescente rojo.</li>
	<li>Recoger las células bacterianas teñidas o bacterias marcadas con GFP mediante centrifugación a 13.000 x g durante 2 min. Resuspendir en medio fresco F-12K (1 ml) y medir el OD600 de cada cultivo. Diluir posteriormente los cultivos a las concentraciones deseadas en función de la multiplicidad de la infección (MOI) y la concentración de células huésped. El volumen final utilizado en este experimento es de 500 μL. NOTA: Por ejemplo, si la concentración de células huésped contada utilizando la tinción de Trypan Blue es de 1 x10 5 células/ml, la concentración deseada de células bacterianas a un MOI de 100 será de 1 x 107 células/ml. La concentración de P. aeruginosa a 0,5 OD600 es de 1 x 108/mL. Para obtener la concentración deseada, diluya el cultivo de P. aeruginosa 10 veces, agregue 50 μL de cultivo resuspendido a 450 μL de medio fresco F-12K.</li>
</ol>3. Adherencia bacteriana y tinción de la célula huésped
<ol><li>Primero, lave las monocapas de células A549 sembradas tres veces con 1x PBS caliente. Para cada lavado, agregue 100 μL de 1x PBS a cada pozo, pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo tres veces, deseche 1x PBS o espere 10 s después de la adición y luego aspire para eliminar 1x PBS. Para determinar la cinética de la asociación bacteriana, superponga las células con 100 μL de concentraciones deseadas de suspensión bacteriana con diferentes MOI (0, 1, 10 y 100). Girar hacia abajo las bacterias a 200 x g durante 10 min e incubar las células A549 infectadas a 37 °C, 5% CO2 durante 1 h adicional. NOTA: En este experimento, cada condición tuvo un triplicado técnico.</li>
	<li>Elimine las bacterias no unidas lavando las monocapas cinco veces con PBS caliente 1x como se describió anteriormente. Agregue 100 μL de formaldehído al 4% (en 1x PBS) en cada pocillo de las placas de 96 pocillos para fijar las células. Deje que las placas se asienten sobre hielo durante 15 minutos y luego lave la solución de fijación con 1x PBS tres veces.</li>
	<li>Para teñir los núcleos, agregue 50 ng/ml de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e incube durante 10 min a RT. Después de la incubación, lave los pocillos tres veces con 1x PBS. Cubra las células A549 infectadas con 100 μL de 1x PBS para evitar el secado. Procese para el siguiente paso o guarde la placa a 4 °C durante un máximo de 2 días en la oscuridad.</li>
</ol>4. Imágenes, procesamiento y análisis automatizados de fluorescencia
<ol><li>Para mantener la integridad de los datos, elija aleatoria y manualmente cinco ubicaciones de cada pozo para capturar las imágenes a un aumento de 20x. Capture las imágenes fluorescentes de células y bacterias A549 bajo canales DAPI y GFP, respectivamente. Utilice el canal PE-Cy5 para las bacterias teñidas por el tinte fluorescente rojo.</li>
	<li>Para tener una mejor resolución, procese todas las imágenes para el aplanamiento y la deconvolución del fondo. Establezca los parámetros como 68 μm de diámetro de la bola rodante para suavizar y mida automáticamente la función de dispersión de puntos (PSF) de la deconvolución de la imagen en función del objetivo.</li>
	<li>Para contar todas las células y bacterias calificadas, mida la intensidad de fluorescencia de las células huésped y las bacterias y establezca la intensidad de fluorescencia más débil de las células huésped y las bacterias como umbrales para el recuento de células. Cuente todas las bacterias próximas a una célula huésped dentro de una distancia de 15 μm como las bacterias adherentes ya que el diámetro de la célula A549 es de 10.59-14.93 μm21. NOTA: Una configuración predeterminada en el sistema de imágenes cuenta selectivamente las células huésped con diámetros que van desde 5-100 μm y bacterias que van desde 0.2-5 μm de tamaño (ancho y largo).</li>
	<li>Sobre la base de los resultados del procesamiento manual de imágenes mencionados anteriormente, aplique los parámetros de suavizado de imágenes, deconvolución, tamaños de objetos, distancia e intensidades de fluorescencia al resto de las imágenes automatizadas. Después del análisis automatizado, considere las lecturas críticas, como los recuentos totales de células huésped, los tamaños y formas de las células, los recuentos bacterianos totales y el recuento bacteriano promedio por célula huésped, que fue el indicador más importante, para determinar la adherencia bacteriana.</li>
	<li>Exportación de datos y análisis estadístico<ol>
<li>Exporte los resultados analizados de todas las imágenes a una hoja de cálculo (por ejemplo, formato 'xlsx'). El sistema automatizado genera dos conjuntos de resultados: 1) el recuento medio de bacterias adherentes de cada imagen; 2) los datos informativos de cada célula huésped individual, como el recuento bacteriano adherente en una sola célula, el tamaño del huésped y la intensidad de fluorescencia promedio de la célula huésped y las bacterias, a partir de la imagen correspondiente.</li>
		<li>Calcule el número medio y la desviación estándar de los recuentos bacterianos adherentes de todas las imágenes para representar el nivel de adherencia bacteriana en comparación con los controles negativos. En este método, E. coli y B. subtilis sirvieron como controles negativos en las pruebas de adherencia bacteriana Gram-negativa y Gram-positiva, respectivamente. Realice ANOVAs bidireccionales para probar la variación significativa entre los puntos de datos a través del tratamiento para tres experimentos independientes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259(2012).</li>
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<li>Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphometrical+analysis+on+the+ultrastructure+of+A549+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Romanian+Journal+of+Morphology+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells.</a> Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).</li>
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<li>Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+LpeA%2C+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li>
<li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li>
</ol>

Todos los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El protocolo describe un enfoque automatizado para enumerar la unión bacteriana a las células huésped. El enfoque descrito tiene varias ventajas atractivas sobre los métodos convencionales. En primer lugar, este enfoque permite la cuantificación precisa del número de células patógenas microbianas que están unidas a células huésped individuales. Es importante destacar que esta cuantificación se puede realizar sin la necesidad de una laboriosa recolección bacteriana, diluciones en serie, recubrimiento en medios sólidos y d...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

La adhesión bacteriana es un proceso por el cual las bacterias se adhieren a otras células o superficies. El establecimiento exitoso de la infección por patógenos bacterianos requiere adhesión a las células huésped, colonización de los tejidos y, en algunos casos, invasión de las células huésped1,2,3. Las enfermedades infecciosas emergentes constituyen importantes amenazas para la salud pública, como lo demuestra la reciente pandemia de COVID-194,5,6. Es importante destacar que los patógenos nuevos o emergentes pueden no discernirse fácilmente utilizando enfoques basados en la genómica, especialmente en los casos en que el patógeno ha sido diseñado para evadir la detección o no contiene firmas genómicas que lo identifiquen como patógeno. Por lo tanto, la identificación de patógenos potenciales utilizando métodos que evalúan directamente las características distintivas de la patogenicidad, como la adherencia bacteriana a las células huésped, puede desempeñar un papel crítico en la identificación de patógenos.
La adherencia bacteriana a las células huésped se ha utilizado para evaluar los mecanismos de patogénesis bacteriana durante décadas1,7. Las imágenes microscópicas8,9 y la enumeración de la unidad formadora de colonias bacterianas (UFC)10,11,12,13 por recubrimiento posterior a la infección son dos métodos de laboratorio bien desarrollados para probar la adherencia microbiana y / o la infección de las células huésped14. Teniendo en cuenta el tamaño de escala micrométrica de las células bacterianas, la enumeración de las células bacterianas adherentes generalmente requiere el uso de técnicas avanzadas de microscopía de alto aumento, así como enfoques de imágenes de alta resolución, incluida la microscopía electrónica, la microscopía de expansión (ExM)15,16y las imágenes tridimensionales17 . Alternativamente, la enumeración de bacterias unidas o internalizadas dentro de las células huésped se puede realizar enchapando la serie de dilución de bacterias cosechadas en agar sólido y contando las UFC resultantes10,12,13. Este método es laborioso e incluye muchos pasos manuales, lo que introduce dificultades para establecer un procedimiento estandarizado o automatizado requerido para los análisis de alto rendimiento18,19. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos métodos para evaluar la conexión de la célula huésped abordaría las limitaciones actuales en el campo.
Aquí se describe uno de estos métodos que utiliza microscopía automatizada de alto rendimiento, combinada con procesamiento de imágenes de alto rendimiento y análisis estadístico. Para demostrar el enfoque, se realizaron experimentos con varios patógenos bacterianos, incluido Pseudomonas aeruginosa,un patógeno bacteriano Gram-negativo oportunista de humanos, animales y plantas14,20, que con frecuencia se encuentra colonizando el tracto respiratorio de pacientes con funciones de defensa del huésped deterioradas. Este enfoque optimizó el proceso de imagen microscópica descrito en estudios previos14,20. La detección por imágenes se simplificó mediante células huésped y bacterias marcadas con fluorescencia para rastrear rápidamente la proximidad de ellas, lo que redujo drásticamente la carga de trabajo de microscopía para obtener imágenes de alta resolución para distinguir bacterias. Además, el análisis estadístico automatizado de imágenes en el conteo de células huésped y bacterias reemplazó el experimento práctico de recubrimiento de UFC bacteriana para estimar la proporción de recuentos bacterianos adherentes por célula huésped. Para confirmar la compatibilidad de este método, también se han probado múltiples cepas bacterianas y tipos de células huésped, como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus y Klebsiella pneumoniae, así como células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), y los resultados respaldan la diversidad y efectividad del método.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>VWR</td><td>45001-130</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher</td><td>62248</td><td>Tinte de celda huésped</td></tr><tr><td>placa de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3882</td><td>Pocillo de media área, fondo plano y claro</td></tr><tr><td>Celdas A549</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CCL 185</td><td>Línea celular de mamíferos</td></tr><tr><td>BactoView Live</td><td>Red Biotium</td><td>40101</td><td>Centrífuga de tinte staning</td></tr><tr><td>de</td> bacterias <td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Rastreador de división celular CFSE</td><td>BioLegend</td><td>423801</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>Cytation 5&nbsp;</td><td>Lector multimodo de imágenes celulares</td></tr><tr><td>E. coli</td><td></td><td></td><td>Stock de laboratorio&nbsp;</td></tr><tr><td>EGM bulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td>HUVEC medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>EHEC</td><td></td><td></td><td>Colecciones NIST</td></tr><tr><td>F-12k medio</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>302004</td><td>A549 medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Corning</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td></td><td></td><td>Stock de laboratorio&nbsp;</td></tr><tr><td>L. monocytogenes</td><td></td><td></td><td>Colecciones</td></tr><tr><td>NIST OD600 DiluPhotometer</td><td>IMPLEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P. aeruginosa</td><td></td><td></td><td>Dr. Lori Burrows stock de laboratorio</td></tr><tr><td>P. aeruginosa & Delta; pilA</td><td></td><td></td><td>Dr. Lori Burrows stock de laboratorio</td></tr><tr><td>S. agalactiae</td><td></td><td></td><td>Colecciones NIST</td></tr><tr><td>S. aureus</td><td>BEI</td><td>NR-46543</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus & Delta; saeR</td><td>BEI</td><td>NR-48164</td><td></td></tr><tr><td>S. rubidaea</td><td></td><td></td><td>Colecciones NIST</td></tr><tr><td>Caldo de soja típico</td><td>Células de cultivo</td><td>MBPE-4040</td><td></td></tr></tbody></table>

detección automatizada y de alto rendimiento de la adherencia bacteriana a las células huésped

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

La identificación de patógenos bacterianos emergentes es fundamental para la salud y la seguridad humanas. La adherencia bacteriana a las células huésped es un paso esencial en las infecciones bacterianas y constituye un sello distintivo de amenaza potencial. Por lo tanto, el examen de la adherencia de las bacterias a las células huésped se puede utilizar como un componente de la evaluación de la amenaza bacteriana. Un método estándar para enumerar la adherencia bacteriana a las células huésped es co-incubar bacterias con células huésped, cosechar las bacterias adherentes, colocar las células cosechadas en medios sólidos y luego contar las unidades formadoras de colonias (UFC) resultantes. Alternativamente, la adherencia bacteriana a las células huésped se puede evaluar utilizando enfoques basados en microscopía de inmunofluorescencia. Sin embargo, las estrategias convencionales para implementar estos enfoques consumen mucho tiempo y son ineficientes. Aquí, se describe un método de imágenes basado en microscopía de fluorescencia automatizada recientemente desarrollado. Cuando se combina con el procesamiento de imágenes de alto rendimiento y el análisis estadístico, el método permite una cuantificación rápida de las bacterias que se adhieren a las células huésped. Se probaron dos especies bacterianas, Pseudomonas aeruginosa Gram-negativa y Listeria monocytogenes Gram-positiva y los controles negativos correspondientes, para demostrar el protocolo. Los resultados muestran que este enfoque enumera de forma rápida y precisa las bacterias adherentes y reduce significativamente las cargas de trabajo y los plazos experimentales.

Para desarrollar el ensayo de adherencia bacteriana basado en imágenes de fluorescencia, se utilizó la cepa PAO1 de P. aeruginosa y su contraparte de adherencia negativa E. coli para probar la efectividad del protocolo, ya que se había reportado la adherencia de estas bacterias a las células A54914,20,22. En primer lugar, P. aeruginosa (PAO1) y E. coli marcada con GFP se coincubó con una línea...

La detección de interacciones entre el patógeno bacteriano huésped basada en la adherencia fenotípica utilizando imágenes de etiquetado de fluorescencia de alto rendimiento junto con métodos de análisis estadístico automatizados permite una evaluación rápida de las posibles interacciones bacterianas con las células huésped.

Detección automatizada y de alto rendimiento de la adherencia bacteriana a las células huésped

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Este método proporciona una detección rápida y de alto rendimiento de la adherencia de las bacterias a las células huésped. En comparación con los métodos de recubrimiento convencionales, reduce el tiempo práctico requerido para la cuantificación de las bacterias adherentes. Esta técnica es automatizada, ahorra tiempo y es muy reproducible.También se aplica ampliamente a la mayoría de las células huésped. Este método, es muy sencillo. Para el primer ensayo, se deben optimizar las condiciones como la multiplicidad de infecciones y también el tiempo de coincubación de las bacterias huésped.Primero cosechar los cultivos bacterianos en una fase exponencial por centrifugación a 13.000 veces G durante dos minutos a temperatura ambiente. Después de lavar la paleta de celdas con un mililitro pbS, resuspenda la paleta bacteriana en un mililitro PBS. Determine las concentraciones de suspensión bacteriana midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros.Luego, para teñir la suspensión bacteriana, agregue dos microlitros del tinte de tinción verde o rojo concentrado 500 veces en un mililitro de suspensión bacteriana para diluir el tinte una vez. Incubar las células a temperatura ambiente durante 3

automated-high-throughput-detection-bacterial-adherence-to-host

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este protocolo es un ensayo simple adhesión bacteriana consiste en contar el número de unidades formadoras de colonias bacterianas que se adhieren a las células cultivadas. El ensayo es sólida, independiente de la adhesina estudiados, y numerosas variantes se utilizan en la mayoría de los laboratorios que trabajan en la patogénesis bacteriana.

Ensayo in vitro de la adhesión bacteriana a las células epiteliales de mamíferos

Durante el proceso de infección, un paso clave es la adhesión de los patógenos con las células huésped. En la mayoría de los casos este paso la adhesión se produce en presencia de la tensión mecánica generada por el flujo de líquidos. Se describe una técnica que presenta el esfuerzo cortante como un parámetro importante en el estudio de la adhesión bacteriana.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

El diseño de un operón que codifica sintético tanto el aparato secretor y los monómeros estructurales de fibras curli se describe. La sobreproducción de estos amiloides y polímeros adherentes permite una ganancia apreciable de adhesión de...

Ingeniería bacterias adherentes mediante la creación de un único operón sintético curli

Fuente: Stones, D. H., et al. Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el uso de perlas bacteriomiméticas para cuantificar la adhesión bacteriana a las células epiteliales del huésped en condiciones competitivas. Describe los pasos involucrados en el tratamiento de las células, la lisis y la siembra de diluciones en serie para medir las unidades formadoras de colonias.

Evaluación de las interacciones bacteria-célula huésped mediante perlas biomiméticas

Este video muestra el ensayo de adherencia bacteriana para evaluar la adherencia bacteriana marcada con GFP al cultivo de células epiteliales para estudiar la dinámica de las interacciones huésped-patógeno utilizando imágenes basadas en microscopía de fluorescencia.

Detección de la adherencia bacteriana a las células huésped mediante imágenes de fluorescencia

Este video muestra la tinción y preparación de células bacterianas para estudios inmunológicos utilizando colorante fluorescente rojo. Las bacterias teñidas se diluyen y se resuspenden en un medio de crecimiento para lograr la concentración bacteriana deseada para la infección de la célula huésped, lo que representa la multiplicidad de la infección.

Tinción de células bacterianas y preparación para estudios inmunológicos

Este vídeo muestra un ensayo de opsonoadherencia para examinar la interacción entre las bacterias opsonizadas y las células inmunitarias. Las bacterias marcadas con fluorescencia, tratadas con suero de prueba que contiene anticuerpos anticápsulas, se incuban con macrófagos. Después de teñir los macrófagos con fluorescencia, las bacterias adheridas a la superficie del macrófago se observan bajo un microscopio para su visualización.

Un ensayo de opsonoadherencia para evaluar la opsonización de bacterias encapsuladas por anticuerpos anticápsulas

La unión bacteriana a las células huésped es un paso clave durante la colonización e infección del huésped. Este protocolo describe la generación de adhesinas recombinantes acopladas a polímeros como materiales biomiméticos que permiten analizar la contribución de adhesinas individuales a estos procesos, independientemente de otros factores bacterianos.

Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

Se describen dos ensayos para el cribado de alto rendimiento basado en microscopía de los factores del huésped implicados en la infección por Brucella. El ensayo de entrada detecta los factores del huésped necesarios para la entrada de Brucella y el ensayo de punto final los necesarios para la replicación intracelular. Si bien es aplicable para enfoques alternativos, el cribado de siRNA en células HeLa se utiliza para ilustrar los protocolos.

Los ensayos basados ​​en la microscopía para la selección de alto rendimiento de los factores del huésped que participan en<em&gt; Brucella</em&gt; Infección de células Hela

El ensayo de adhesión a opsono es un método alternativo al ensayo de muerte opsonótico-fagocítico para evaluar las funciones opsónicas de los anticuerpos en el desarrollo de vacunas.

Ensayo de adhesión a Opsono para evaluar anticuerpos funcionales en el desarrollo de vacunas contra la antrasis bacillus y otros patógenos encapsulados

Aprende a detectar la adherencia bacteriana a células huésped mediante un método automatizado de alto rendimiento con marcaje fluorescente. Esta técnica reduce el tiempo de manipulación y mejora la reproducibilidad en estudios de interacciones patógeno-huésped.

Detección automatizada y de alto rendimiento de la adherencia bacteriana a las células huésped

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