Name: Modelo animal grande para evaluar la eficacia de la terapia génica en el corazón isquémico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Aprende a evaluar la eficacia de la terapia génica miocárdica en enfermedad cardíaca isquémica usando un modelo animal grande. Este método de baja invasión permite evaluar seguridad antes de ensayos clínicos.

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Los autores desean agradecer a Maria Hedman, Tiina Laitinen, Tomi Laitinen, Pekka Poutiainen, Annika Viren y Severi Sormunen por su ayuda y el permiso de 15imágenes O-PET en el Hospital Universitario de Kuopio; y Heikki Karhunen, Minna Törrönen y Riikka Venäläinen del Centro Nacional de Animales de Laboratorio por su asistencia en el trabajo con animales.
Este estudio cuenta con el apoyo de subvenciones de la Academia Finlandesa, ERC y CardioReGenix EU Horizon 2020.

Los experimentos presentados aquí se realizan utilizando cerdos domésticos hembras de aproximadamente 10 semanas de edad y están aprobados por la Junta de Experimentación Animal en Finlandia. Los animales pesan 30-40 kg al comienzo del protocolo, lo que permite el mismo equipo de procedimiento y modalidades de imagen posibles para los humanos. La isquemia crónica se induce 14 días antes de la transferencia génica, y el tiempo de seguimiento después de la transferencia génica depende del vector viral utilizado. El protocolo del estudio se muestra en la Figura 1. Este protocolo se puede utilizar para realizar inyecciones de terapia génica adenoviral o mediada por AAV. El tiempo de recogida de la muestra debe ajustarse al pico de expresión transgénica, que depende del vector viral utilizado. Por ejemplo, cuando se realizan transferencias de genes adenovirales, el tiempo de recolección de la muestra se establece en 6 días después de la transferencia de genes.
1. Medicación
<ol><li>Administrar una dosis diaria de 200 mg de amiodarona y 2,5 mg de bisoprolol para prevenir arritmias ventriculares fatales. El medicamento comienza 1 semana antes de la operación de isquemia y se continúa diariamente hasta el seguimiento.</li>
	<li>Además, administrar dosis perorales de clopidogrel (300 mg) y ácido acetilsalicílico (300 mg) a los animales 1 día antes de la operación de isquemia para prevenir la trombosis aguda en el stent después de la colocación del stent.</li>
	<li>Administrar 100 mg de lidocaína y 2,5 ml de (246 mg/ml) de MgSO4 por vía intravenosa a los animales al comienzo de la operación de isquemia para prevenir arritmias ventriculares.</li>
	<li>Administrar inyección intramuscular de cefuroxima (500 mg) al comienzo de cada operación para la profilaxis de la infección.</li>
	<li>Administrar 30 mg de enoxaparina por vía intravenosa al comienzo de las operaciones de isquemia y por vía subcutánea después del procedimiento de operación para la prevención de la trombosis.</li>
	<li>Para anestesia y analgesia, administrar 1,5 mL de atropin, 6 mL de azaperona (40 mg/mL), propofol 20 mg/mL, a razón de 15 mg/kg/h, y fentanilo 50 μg/mL a razón de 10 μg/kg/h. Las dosis de medicamentos fueron las mismas para cada cerdo. Consulte las pautas locales de uso en animales para la administración de dosis.</li>
	<li>Anestesiar a los animales durante todas las operaciones. Todas las operaciones deben realizarse en un ambiente estéril utilizando una técnica estéril.</li>
</ol>2. Ecocardiografía transtorácica
<ol><li>Realizar ecocardiografía transtorácica antes de la operación de isquemia, transferencia de genes y eutanasia para evaluar cualquier líquido pericárdico detectable y determinar la tensión miocárdica.</li>
	<li>Coloque el transductor en el tercer o cuarto espacio intercostal debajo de la axila del cerdo para acceder a las vistas paraesternales de eje corto a nivel de la válvula mitral, el músculo papilar y los niveles apicales (Video 1). El marcador del transductor debe apuntar al esternón del cerdo. Para guardar un clip, pulse Adquirir.</li>
</ol>3. Operaciones endovasculares bajo guía fluoroscópica
<ol><li>Realizar imágenes de cine del ventrículo izquierdo después de angiografías coronarias antes de la operación de isquemia, transferencia de genes y recolección de tejido.</li>
	<li>Preparación de la operación
	<ol><li>Prepárese para las operaciones sedando a los cerdos con una inyección intramuscular de 1,5 ml de atropina y 6 ml de azaperona.</li>
		<li>Después de la sedación, inducir anestesia general con propofol y fentanilo para los procedimientos angiográficos a los cerdos con dosis de 15 mg/kg/h y 10 μg/kg/h, respectivamente. NOTA: Los cerdos son anestesiados durante todo el procedimiento.</li>
		<li>Apoyar la ventilación mediante intubación y ventilador y controlar los parámetros fisiológicos vitales, como el ECG y los parámetros respiratorios.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocación de la funda introductora
	<ol><li>Coloque una vaina introductora en la arteria femoral derecha para todas las operaciones como práctica estándar en cardiología. Use ultrasonido para rastrear la arteria femoral y perforarla con una aguja de entrada (18 G). NOTA: Utilice una vaina introductora 8F para las transferencias de genes intramiocárdicos y una vaina 6F para todas las demás operaciones. Introduzca el alambre guía de la vaina a través de la aguja para enhebrar la arteria y mantenga el alambre guía quieto mientras retira la aguja.</li>
		<li>Inserte la vaina introductora a lo largo del alambre guía y, cuando se coloque, retire el alambre guía y administre 1,25 mg de dinitrato sublingual al cerdo para inducir la vasodilatación coronaria.</li>
	</ol></li>
	<li>Angiografía coronaria
	<ol><li>Realizar una angiografía coronaria directamente antes de la operación de isquemia, la transferencia de genes y la recolección de tejido. La maquinaria necesaria para los angiogramas se muestra en la Figura 2.</li>
		<li>Use un catéter 6F bajo guía fluoroscópica con un agente de contraste de yodo para obtener imágenes de la arteria coronaria derecha y la arteria coronaria ascendente izquierda (Video 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Imágenes de cine del ventrículo izquierdo en reposo y estrés con dobutamina
	<ol><li>Administre un bolo de 21 ml de agente de contraste de yodo en el ventrículo izquierdo a través de un catéter pigtail 5F utilizando un autoinyector. Primero, establezca la duración del bolo en 3 s y el volumen total para 21 ml. Luego, presione Single y Sí.</li>
		<li>Calcule la fracción de eyección mediante el software de medición de la estación de trabajo angiográfica. Para realizar el cálculo, seleccione Análisis ventricular de la imagen en cuestión. Desplácese por la imagen para seleccionar un marco de tiempo, uno en diástole y otro en sístole. Seleccione una herramienta para dibujar contornos ventriculares de cada marco de tiempo. NOTA: El software ahora calcula la fracción de eyección y el volumen sistólico por el método de Simpson. La medición de la fracción de eyección se realiza durante el reposo y bajo estrés inducido por dobutamina.</li>
	</ol></li>
	<li>Imágenes de estrés
	<ol><li>Dosis de dobutamina por vía intravenosa en dosis crecientes de 10 μg/kg/min a 20 μg/kg/min para las imágenes de estrés inducido por dobutamina hasta que se alcance la frecuencia cardíaca objetivo de 160 lpm. Luego, realice las imágenes de cine.</li>
	</ol></li>
	<li>Operación de isquemia
	<ol><li>Coloque un stent de cuello de botella en la arteria coronaria izquierda (LAD) 14 días antes de la transferencia del gen para inducir isquemia miocárdica crónica. Después de la colocación del stent en el cuello de botella, verifique si el stent del cuello de botella se coloca correctamente, lo que restringe el flujo sanguíneo coronario. NOTA: El stent de cuello de botella se coloca sobre un catéter de dilatación y consiste en un stent de metal desnudo cubierto por un tubo de politetrafluoroetileno formado en forma de cuello de botella para reducir el flujo sanguíneo coronario9.</li>
	</ol></li>
	<li>Definición del tamaño del stent
	<ol><li>Elija el tamaño del stent, ya sea 3,0/3,5/4,0 x 8 mm, de acuerdo con el tamaño de la arteria coronaria ascendente izquierda en el angiograma utilizando el software de medición automática en la estación de trabajo angiográfica (Video 3)12.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocación del stent
	<ol><li>Coloque una bobina en la arteria coronaria izquierda y deslice el stent del cuello de botella hacia el LAD, colocándolo distalmente a la primera diagonal.</li>
		<li>Infle el stent a la presión nominal en la arteria usando un deflactor con una relación stent-luz de 1.3, anclando el cuello de botella en su lugar. Después de 15 s adicionales, desinfle el stent y retraiga el equipo de la arteria. NOTA: Confirme la colocación correcta del stent de cuello de botella mediante angiografía.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Imágenes PET
NOTA: Un día antes de la transferencia de genes, realice reposo y estrés 15exploraciones PET/CT radioacuícolas marcadas con O (requiere ambiente hospitalario y técnicos radiológicos).
<ol><li>Imágenes de referencia
	<ol><li>Realice tomografías computarizadas (TC) antes del descanso y las imágenes de esfuerzo. Utilice la información de TC para la corrección de atenuación.</li>
	</ol></li>
	<li>15Imágenes de radioagua marcadas con O
	<ol><li>Realice imágenes de descanso y estrés utilizando un bolo de 800 MBq 15H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Imágenes de estrés
	<ol><li>Realice imágenes de estrés con un bolo de O-agua adicional de 800 MBq 15 después de una desintegración radiactiva adecuada de 12min. NOTA: La hiperemia es inducida por adenosina (200 μg/kg/min intravenosa), como se describió anteriormente12.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Transferencia génica
<ol><li>Mapeo electroanatómico
	<ol><li>Proceder al mapeo electroanatómico después de una angiografía coronaria y mediciones funcionales (ecocardiografía, imágenes de cine VI).</li>
		<li>Introducir un catéter de mapeo en el ventrículo izquierdo a través de la vaina femoral en la guía fluoroscópica. NOTA: Registre alrededor de 100-150 puntos alrededor del ventrículo izquierdo con el catéter de mapeo para crear el mapa electroanatómico.</li>
	</ol></li>
	<li>Terminando el mapa electroanatómico
	<ol><li>Elimine los puntos atípicos para garantizar un mapa electroanatómico más confiable del ventrículo izquierdo.</li>
		<li>Para ello, seleccione Clip Planes del mapa y elimine los puntos que difieren de los puntos que forman la forma ventricular. A continuación, seleccione Trayectorias para la vista de mapa y elimine los puntos que se han recorrido horizontalmente durante el registro de puntos. NOTA: Asegúrese de que los puntos restantes cubran el ventrículo izquierdo y registre más puntos si es necesario.</li>
	</ol></li>
	<li>Inyecciones de transferencia de genes
	<ol><li>Introducir un catéter de inyección intramiocárdica en el ventrículo izquierdo a través de la vaina femoral bajo guía fluoroscópica. Ajuste la longitud de la aguja de inyección a 3 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Criterios para las inyecciones intramiocárdicas
	<ol><li>Guiar las transferencias de genes mediante un sistema de mapeo electroanatómico y dirigir las inyecciones en áreas viables pero hipocinéticas del ventrículo izquierdo. NOTA: Para la viabilidad, utilice un voltaje unipolar superior a 5 mV como criterio. Para la hipocinesia, seleccione un acortamiento lineal local (LLS) tan bajo como esté disponible, al menos por debajo del 12%, pero preferiblemente por debajo del 6%13.</li>
	</ol></li>
	<li>Inyecciones intramiocárdicas
	<ol><li>Durante 30 s, inyecte el material vectorial en el punto de selección (paso 5.4) y mantenga la aguja de inyección dentro del miocardio durante 5 s adicionales antes de retraerse para evitar el reflujo al ventrículo izquierdo.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Eutanasia y recogida de muestras
NOTA: Después de la angiografía coronaria y las mediciones de la fracción de eyección descritas en los pasos 3.4.1 y 3.5.2, respectivamente, administrar 50 mL de cloruro de potasio saturado por vía intravenosa al cerdo anestesiado.
<ol><li>Fijación del corazón por perfusión
	<ol><li>Cosechar el corazón de la cavidad torácica. Enjuagar con agua. Coloque una aguja de 18 G por encima de la válvula aórtica y conecte la aguja a una bomba de perfusión. Perfundir el corazón con 750 ml de paraformaldehído al 1% (PFA).</li>
	</ol></li>
	<li>Recogida de muestras
	<ol><li>Corte el corazón en rodajas de 1 cm de grosor con un cuchillo de cocina afilado. Recoja las muestras del área de transferencia de genes en PFA al 4% y nitrógeno líquido. NOTA: Para cosechar controles negativos, recoja una muestra de control de la pared posterior del ventrículo izquierdo.</li>
	</ol></li>
	<li>Recolección de pañuelos de seguridad
	<ol><li>Recolecte muestras de tejidos remotos, como el pulmón, el hígado, el riñón, el bazo y los ovarios. Tome muestras en PFA al 4% y nitrógeno líquido.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Almacenamiento de muestras
<ol><li>Almacenar las muestras para teñir en PFA al 4% durante 48 h a 4 °C. NOTA: Reemplace el PFA diariamente con un líquido fresco.<ol><li>Después de 48 h, reemplace el PFA con sacarosa al 15% en agua desionizada. Conservar durante al menos 24 h antes de incrustar las muestras en bloques de parafina. Las muestras congeladas a presión se almacenan a -70 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Naghavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+age-sex+specifc+mortality+for+264+causes+of+death%2C+1980-2016%3A+A+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national age-sex specifc mortality for 264 causes of death, 1980-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).</li>
<li>Knuuti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2019+ESC+Guidelines+for+the+diagnosis+and+management+of+chronic+coronary+syndromes%3A+The+Task+Force+for+the+diagnosis+and+management+of+chronic+coronary+syndromes+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">2019 ESC Guidelines for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes: The Task Force for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes of the European Society of Cardiology (ESC).</a> European Heart Journal. 41 (3), 407-477 (2020).</li>
<li>Davies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+refractory+angina%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Management of refractory angina: An update.</a> European Heart Journal. 42 (3), 269-283 (2021).</li>
<li>Ylä-Herttuala, S., Baker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+gene+therapy%3A+Past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular gene therapy: Past, present, and future.</a> Molecular Therapy. 25 (5), 1095-1106 (2017).</li>
<li>Lähteenvuo, J., Ylä-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+cardiovascular+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in cardiovascular gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 28 (11), 1024-1032 (2017).</li>
<li>Hammond, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+gene+transfer+of+adenylyl+cyclase+6+in+patients+with+heart+failure%3A+A+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Intracoronary gene transfer of adenylyl cyclase 6 in patients with heart failure: A randomized clinical trial.</a> JAMA Cardiology. 1 (2), 163-171 (2016).</li>
<li>Hartikainen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+intramyocardial+VEGF-DDNDC+gene+transfer+increasesmyocardial+perfusion+reserve+in+refractory+angina+patients%3A+A+phase+I%2FIIa+study+with+1-year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Adenoviral intramyocardial VEGF-DDNDC gene transfer increasesmyocardial perfusion reserve in refractory angina patients: A phase I/IIa study with 1-year follow-up.</a> European Heart Journal. 38 (33), 2547-2555 (2017).</li>
<li>Laakkonen, J. P., Ylä-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+cardiovascular+gene+therapy+and+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in cardiovascular gene therapy and vascular biology.</a> Human Gene Therapy. 26 (8), 518-524 (2015).</li>
<li>Roth, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+left+circumflex+Ameroid+constrictor+placement+on+adrenergic+innervation+of+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of left circumflex Ameroid constrictor placement on adrenergic innervation of myocardium.</a> The American Journal of Physiology. 253 (6), Pt 2 1425-1434 (1987).</li>
<li>White, F. C., Carroll, S. M., Magnet, A., Bloor, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+collateral+development+in+swine+after+coronary+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Coronary collateral development in swine after coronary artery occlusion.</a> Circulation Research. 71 (6), 1490-1500 (1992).</li>
<li>Liu, C. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord-derived+mesenchymal+stromal+cells+improve+left+ventricular+function%2C+perfusion%2C+and+remodeling+in+a+porcine+model+of+chronic+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells improve left ventricular function, perfusion, and remodeling in a porcine model of chronic myocardial ischemia.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (8), 1004-1013 (2016).</li>
<li>Rissanen, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bottleneck+stent+model+for+chronic+myocardial+ischemia+and+heart+failure+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">The bottleneck stent model for chronic myocardial ischemia and heart failure in pigs.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1297-1308 (2013).</li>
<li>Greenberg, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doppler-derived+myocardial+systolic+strain+rate+is+a+strong+index+of+left+ventricular+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Doppler-derived myocardial systolic strain rate is a strong index of left ventricular contractility.</a> Circulation. 105 (1), 99-105 (2002).</li>
<li>Grönman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+myocardial+viability+with+%5B15O%5Dwater+PET%3A+A+validation+study+in+experimental+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Assessment of myocardial viability with [15O]water PET: A validation study in experimental myocardial infarction.</a> Journal of Nuclear Cardiology. , 1-10 (2019).</li>
<li>Tarkia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+68Ga-labeled+tracers+for+PET+imaging+of+myocardial+perfusion+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 68Ga-labeled tracers for PET imaging of myocardial perfusion in pigs.</a> Nuclear Medicine and Biology. 39 (5), 715-723 (2012).</li>
<li>Gyöngyösi, M., Dib, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+value+of+3D+NOGA+mapping+in+ischemic+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic value of 3D NOGA mapping in ischemic heart disease.</a> Nature Reviews. Cardiology. 8 (7), 393-404 (2011).</li>
<li>Shim, J., Al-Mashhadi, R. H., Sørensen, C. B., Bentzon, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models+of+atherosclerosis+-+New+tools+for+persistent+problems+in+cardiovascular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Large animal models of atherosclerosis - New tools for persistent problems in cardiovascular medicine.</a> Journal of Pathology. 238 (2), 257-266 (2016).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Los puntos de tiempo de este protocolo pueden modificarse de acuerdo con el vector viral utilizado. Además, los análisis inmunohistológicos pueden seleccionarse de acuerdo con el gen terapéutico. También es posible agregar más puntos de tiempo y puntos finales al protocolo si es necesario.
Este protocolo comprende etapas, que son esenciales para tener éxito e imposibles de corregir después. En primer lugar, si no se induce una isquemia adecuada, el animal debe ser excluido de otros procedimien...

La enfermedad arterial coronaria es responsable de la gran proporción de mortalidad y carga de enfermedad en todo el mundo1. Las estrategias de tratamiento actuales son las intervenciones percutáneas, el tratamiento farmacológico y la cirugía de derivación2. Sin embargo, a pesar de la progresión de estas terapias actuales, muchos pacientes sufren de la llamada angina refractaria, lo que subraya la necesidad insatisfecha de nuevos enfoques de tratamiento3. La angiogénesis terapéutica mediada por terapia génica podría dirigirse a este grupo de pacientes.
La terapia génica miocárdica se administra con mayor frecuencia mediante el uso de diferentes vectores virales, más comúnmente adenovirus4 deficiente en replicación. Como genes terapéuticos, se utilizan varios factores de crecimiento angiogénicos. Los factores de crecimiento angiogénico más estudiados son los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que median su señalización angiogénica a través de los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) y sus correceptores5. Varios ensayos clínicos han demostrado el beneficio y la seguridad de la terapia génica cardíaca y han hecho de este nuevo método de tratamiento una opción realista para el tratamiento de las cardiopatías isquémicas 6,7. Sin embargo, este concepto todavía necesita mejorar los genes terapéuticos y los vectores virales puestos a prueba en modelos animales grandes antes de ingresar a las clínicas. El cerdo se ha utilizado con frecuencia como animal de laboratorio ya que su corazón es muy similar al corazón humano. El tamaño del sistema cardiovascular de un cerdo permite el uso de invenciones de catéter similares a las utilizadas en humanos. Todas las modalidades de imagen disponibles para humanos se pueden utilizar en cerdos8.
Hay varios modelos animales grandes para la isquemia crónica. El más utilizado es el ameroide constrictor modelo 9,10,11. La desventaja de este método es la invasividad, ya que se necesita toracotomía para acceder a la vasculatura coronaria. Previamente en nuestro grupo, se ha desarrollado un modelo de stent de cuello de botella miniinvasivo para la isquemia miocárdica crónica12. Este método también se utiliza en este manuscrito para inducir isquemia miocárdica.
La usabilidad de las imágenes de ultrasonido ha evolucionado sustancialmente a pesar de la edad de la modalidad de imagen. Por ejemplo, la tensión miocárdica todavía está principalmente en uso de investigación debido a su novedad. La tensión miocárdica refleja los cambios en la función contráctil del corazón mejor que la medición tradicional de la fracción de eyección en modo M13. Por lo tanto, aquí en el modelo animal grande, se utiliza la medición de la tensión miocárdica. Para evaluar la función del corazón, el gasto cardíaco también se mide mediante imágenes de cine del ventrículo izquierdo durante la angiografía. El gasto cardíaco se mide tanto en reposo como bajo estrés inducido por dobutamina para evaluar la función miocárdica bajo estrés.
Además de las mediciones de la función cardíaca, la información sobre la perfusión miocárdica es esencial en los estudios de terapia génica destinados a la angiogénesis terapéutica. En este modelo animal, se obtienen imágenes de los animales con una tomografía por emisión de positrones radioacuídica marcada con 15 O (15H2O-PET), ya que este es el estándar de oro para medir la perfusión miocárdica. 15ElH2O-PET ha sido previamente validado para medir la perfusión del corazón porcino isquémico14.
Por lo tanto, los métodos y modalidades mencionados anteriormente constituyen una excelente perspectiva para evaluar la eficacia de la terapia génica en el corazón isquémico.

<table><tbody><tr><td>1% PFA</td><td>VWR</td><td>VWRC28794.295</td><td>Preparado a partir de paraformaldehído en polvo 15</td></tr><tr><td>% sacarosa</td><td>VWR</td><td>VWRC27480.294</td><td>Preparado a partir de sacarosa sólida</td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>VWR</td><td>VWRC28794.295</td><td>Preparado a partir de polvo de paraformaldehído</td></tr><tr><td>Catéter flexible 5 F</td><td>Cordis</td><td>534-550S</td><td></td></tr><tr><td>Catéter 6 F AR2</td><td>Cordis</td><td>670-112-00</td><td></td></tr><tr><td>Vaina introductora 6 F</td><td>Cordis</td><td>504-606X</td><td></td></tr><tr><td>8 F vaina introductora</td><td>Cordis</td><td>504-608X</td><td></td></tr><tr>Ácido <td></td><td></td><td>acetilsalicílico</td><td>Productor variable</td></tr><tr><td>Amiodarona</td><td></td><td></td><td>Productor variable</td></tr><tr><td>Estación angiográfica</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Angiolaboratory set</td><td>M&ouml; lnlycke</td><td></td><td>diseñado para las necesidades de nuestro laboratorio de angio, contiene paños estériles, copas e hisopos</td></tr><tr><td>Bisoprolol</td><td></td><td></td><td>Productor variable</td></tr><tr><td>Cefuroxima</td><td></td><td></td><td>Productor variable</td></tr><tr><td>Clopidogrel</td><td></td><td></td><td>Productor variable</td></tr><tr><td>Stent Coroflex Blue</td><td>B.Braun Medical</td><td>5029012</td><td>El número de catálogo depende del tamaño del stent</td></tr><tr><td>Crile pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciclotrón</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dobutamina</td><td></td><td></td><td>Productor variable</td></tr><tr><td>Sistema de mapeo electroanatómico</td><td>Sistemas de administración de productos biológicos, Johnson & Johnson company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enoxaparin</td><td></td><td></td><td>Productor variable</td></tr><tr><td>Fentanilo</td><td></td><td></td><td>Productor variable</td></tr><tr><td>Catéter de inyección intramiocárdica</td><td>Johnson & Johnson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agente de contraste de yodo</td><td>Iomeron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuchillo</td><td></td><td></td> de cocina <td>Productor variable</td></tr><tr><td>Lidocaína</td><td></td><td></td><td>Productor variable</td></tr><tr><td>Nitrógeno</td><td></td><td></td> líquido <td>Productor</td></tr><tr><td>variable MgSO4</td><td>Productor variable</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Aguja 18 G</td><td>Cordis</td><td>12-004943</td><td></td></tr><tr><td>Bomba</td><td></td><td></td><td></td>de perfusión</tr><tr><td>Escáner PET-CT</td><td>Siemens Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr>Tubo <td></td><td></td><td></td>de<td>politetrafluoroetileno</td></tr><tr><td>Propofol</td><td></td><td></td><td>Productor variable</td></tr><tr><td>Bisturí n.º 11</td><td>VWR</td><td>SWAN0503</td><td></td></tr><tr><td>Dinitrato sublingual</td><td>Takeda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ecógrafo</td><td>Philips</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modelo animal grande para evaluar la eficacia de la terapia génica en el corazón isquémico

Large Animal Model for Evaluating the Efficacy of the Gene Therapy in Ischemic Heart

La enfermedad arterial coronaria es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. A pesar de la progresión de la terapéutica actual, una proporción considerable de pacientes con enfermedad arterial coronaria siguen siendo sintomáticos. La angiogénesis terapéutica mediada por terapia génica ofrece un nuevo método terapéutico para mejorar la perfusión miocárdica y aliviar los síntomas. La terapia génica con diferentes factores angiogénicos se ha estudiado en pocos ensayos clínicos. Debido a la novedad del método, el progreso de la terapia génica miocárdica es un camino continuo desde el banco hasta la cabecera. Por lo tanto, se necesitan modelos animales grandes para evaluar la seguridad y la eficacia. Cuanto más identifica el modelo animal grande la enfermedad original y los criterios de valoración utilizados en las clínicas, más predecibles son los resultados de los ensayos clínicos. Aquí, presentamos un modelo animal grande para evaluar la eficacia de la terapia génica en el corazón porcino isquémico. Utilizamos métodos de imagen clínicamente relevantes, como imágenes de ultrasonido y 15H2O-PET. Para dirigir las transferencias de genes al área deseada, se utiliza el mapeo electroanatómico. El objetivo de este método es: (1) imitar la enfermedad arterial coronaria crónica, (2) inducir angiogénesis terapéutica en áreas hipóxicas del corazón, y (3) evaluar la seguridad y eficacia de la terapia génica mediante el uso de criterios de valoración relevantes.

El éxito de la operación de isquemia se puede confirmar con este protocolo mediante angiografía coronaria y determinando el área hipocinética mediante ecografía transtorácica (Figura 1) antes de proceder a la entrega del gen. El estado de la oclusión coronaria se puede evaluar mediante angiografía coronaria, y el mapeo electroanatómico asegura las áreas isquémicas e hibernantes.
La eficacia de la terapia génica se puede analizar midiendo la tensión circunferencial...

La terapia génica miocárdica para la cardiopatía isquémica es muy prometedora para futuras terapias. Aquí, presentamos un modelo animal grande para evaluar la eficacia de la terapia génica en el corazón isquémico.

Modelo animal grande para evaluar la eficacia de la terapia génica en el corazón isquémico

Coronary artery disease is one of the significant causes of mortality and morbidity worldwide. Despite the progression of current therapeutics, a ...

Los métodos y modalidades de imagen utilizados en este protocolo constituyen una excelente imagen de la seguridad y eficacia de la terapia génica en el corazón isquémico antes de proceder a los ensayos clínicos. Las principales ventajas de esta técnica son la baja invasividad del modelo de isquemia, pero también la orientación precisa de la terapia génica a áreas hipocinéticas pero aún viables del corazón. Comience realizando la ecocardiografía transtorácica antes de la operación de isquemia, la transferencia de genes y la eutanasia para evaluar cualquier líquido pericárdico detectable y determinar la tensión miocárdica.Coloque el transductor en el tercer o cuarto espacio intercostal debajo de la axila del cerdo con un marcador que apunte al esternón del cerdo para acceder a las vistas paraesternales de eje corto a nivel de la válvula mitral, el músculo papilar y los niveles apical. Luego presione adquirir para guardar un clip. Para realizar la angiografía coronaria directamente antes de la operación de isquemia, use un catéter 6-F bajo guía fluoroscópica con un agente de contraste de yodo para obtener imágenes de la arteria coronaria derecha, la arteria coronaria ascendente izquierda y la arteria descendente anterior izquierda.Para imágenes de cine en el autoinyector, ajuste la duración del bolo en tres segundos y el volumen total para 21 mililitros, y luego presione simple, y sí para administrar agente de contraste de yodo en el ventrículo izquierdo a través de un catéter de coleta 5-F. Realizar imágenes de cine del animal en reposo y luego administrar dobutamina por vía intravenosa y dosis crecientes para la inducción de estrés. Una vez que se alcanza la frecuencia cardíaca objetivo de 160 latidos por minuto, se realiza una imagen de cine y se retira el catéter pigtail.Para calcular la fracción de eyección abra el software de medición, seleccione análisis ventricular de la imagen en cuestión. Desplácese por la imagen para seleccionar un período de tiempo, uno en diástole y otro en sístole, y luego seleccione una herramienta para dibujar contornos ventriculares de cada período de tiempo. Para inducir la isquemia miocárdica crónica, 14 días antes de la transferencia de genes, coloque una bobina en la arteria coronaria izquierda, deslice el stent del cuello de botella hasta la arteria coronaria izquierda, y coloque el stent distalmente en la primera diagonal.Infle el stent a la presión nominal en la arteria, utilizando un indeflactor con una relación stent/lumen de 1,3 para anclar el cuello de botella en su lugar. Después de 15 segundos adicionales, desinfle el stent, retraiga el equipo de la arteria y asegúrese de colocar correctamente un stent de cuello de botella mediante angiografía. Después de la angiografía y las mediciones funcionales bajo guía fluoroscópica, introduzca un catéter de mapeo en el ventrículo izquierdo a través de la vaina femoral para el mapeo electroanatómico, y recoja al menos 100 puntos del ventrículo izquierdo, y haga clic en aceptar para aprobar un punto.En el mapa final, para la viabilidad, use un voltaje unipolar de más de cinco milivoltios como criterio. Y para la hipocinesia, seleccione un acortamiento lineal local lo más bajo posible, al menos tan bajo como 12%, pero preferiblemente por debajo del 6% Después de sacrificar al animal, extraiga el corazón de la cavidad torácica. Una vez que se enjuague el corazón extraído, coloque una aguja de calibre 18 sobre la válvula aórtica y conecte la aguja a una bomba de perfusión.Perfundir el corazón con 750 mililitros de paraformaldehído al 1%. Use un cuchillo afilado para cortar el corazón en rodajas de un centímetro de grosor y recoja las muestras del área de transferencia de genes en paraformaldehído al 4% y nitrógeno líquido. Almacene las muestras para teñir en paraformaldehído al 4% durante 48 horas a cuatro grados centígrados.La eficacia de la terapia génica se analizó midiendo la tensión circunferencial, la fracción de eyección y la perfusión miocárdica mediante una exploración PET de 15O-agua. Las muestras de tejido se pueden recolectar directamente del área de transferencia de genes, comparando el corazón con el mapa electroanatómico. La expresión transgénica y la angiogénesis terapéutica se evaluaron mediante análisis histológico inmune mediante el análisis del número de células positivas después de la tinción de Beta-galactosidasa, y mediante el análisis del área capilar miocárdica, después de la tinción de la molécula-1 de adhesión plaquetaria/célula endotelial.Es importante confirmar la colocación del stent de cuello de botella mediante angiografía y recolección de muestras del área de transferencia de genes, lo que podría confirmarse comparando el corazón con el mapa electroanatómico. En general, es crucial hacer todas las mediciones de la manera más reproducible.

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Investigación

JoVE Journal

Medicine

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Un método de transferencia génica para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca isquémica se describe usando un modelo porcino de infarto de miocardio. Nuestro método simple y reproducible que nos permite evaluar fácilmente la eficacia de la transferencia de genes diferentes con una forma muy sencilla y reproducible.

Transferencia génica para la insuficiencia cardiaca isquémica en un modelo preclínico

Este protocolo describe el modelo porcino infarto de miocardio (IM) con un 90 min a tórax cerrado oclusión coronaria con balón de la arteria descendente anterior izquierda (LAD), seguido de reperfusión. Por otra parte, el protocolo para varios parámetros de resultado, como la función cardiaca, hemodinámica, la resistencia microvascular, y el tamaño del infarto, también se presentan.

Infarto de miocardio y la evaluación de resultados funcionales en los cerdos

El propósito de este protocolo es demostrar la colocación de un dispositivo constricting retrasada (un ameroid constrictor) alrededor de una arteria coronaria en un modelo porcino. Este dispositivo crea un área isquémico del corazón que es útil para el estudio de nuevas técnicas de imagen diagnósticas y nuevos métodos de tratamiento.

Un modelo de isquemia cardíaca crónica en cerdos usando un Constrictor Ameroid

Aquí presentamos un protocolo para la inducción de la criocauterización ventricular izquierdo seguido de la implantación de un parche de músculo cardiaco, derivado de los cardiomiocitos células iPS humanas en un modelo del conejillo de Indias.

Implantación de parches hiPSC derivado de músculo cardiaco después de lesión del miocardio en un modelo del conejillo de Indias

Aquí, describimos un modelo preclínico de gran animal (porcino) de trasplante de corazón ortotópico que ha sido firmemente establecido y utilizado para investigar nuevas estrategias cardioprotectoras.

Un modelo preclínico porcino de trasplante ortotópico de corazón

Buscamos establecer un modelo porcino de insuficiencia cardíaca inducida por la obstrucción de la arteria circunfleja izquierda y un ritmo rápido para probar el efecto y la seguridad de la administración intramiocardial de células madre para terapias basadas en células.

Establecer un modelo porcino de infarto de infarto post-miocardio insuficiencia cardíaca para el tratamiento de células madre

Este protocolo tiene como objetivo trasplantar un parche bioimpreso 3D en el epicardio de ratones infartos modelando insuficiencia cardíaca. Incluye detalles sobre la anestesia, la abertura quirúrgica del pecho, la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) y la aplicación de un parche bioimpreso en la zona infarta del corazón.

Trasplante de un parche bioimpreso 3D en un modelo murino de infarto de miocardio

El presente protocolo describe métodos para la expresión transgénica en corazones de rata y ratón mediante inyección intramiocárdica directa del virus bajo guía ecocardiográfica. Los métodos para la evaluación de la susceptibilidad de los corazones a las arritmias ventriculares mediante la estimulación eléctrica programada de corazones aislados, perfundidos con Langendorff, también se explican aquí.

Expresión de transgenes virales en corazones de roedores y la evaluación del riesgo de arritmia cardíaca

El presente protocolo describe tres métodos de administración de agentes terapéuticos cardioactivos en un modelo porcino. Las hembras de cerdo criollo recibieron tratamiento mediante: (1) toracotomía e inyección transepicárdica, (2) inyección transendocárdica basada en catéter o (3) infusión intravenosa a través de una minibomba osmótica de la vena yugular.

Administración de terapias cardioactivas en un modelo de infarto de miocardio porcino

El presente estudio demuestra un modelo animal altamente reproducible de isquemia miocárdica regional aguda y lesión por reperfusión en conejos utilizando una minitoracotomía izquierda para los casos de supervivencia o una esternotomía de línea media para los casos de no supervivencia.

Modelo de lesión por isquemia y reperfusión en conejos

Aprende a evaluar la eficacia de la terapia génica miocárdica en enfermedad cardíaca isquémica usando un modelo animal grande. Este método de baja invasión permite evaluar seguridad antes de ensayos clínicos.

Modelo animal grande para evaluar la eficacia de la terapia génica en el corazón isquémico

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