Name: Evaluación de la localización de proteínas submitochondriales en levaduras en ciernes Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprende a determinar la localización submitocondrial de proteínas mitocondriales en Saccharomyces cerevisiae mediante fraccionamiento y ensayos de proteasa. Este método permite estudiar la función molecular de proteínas en diferentes condiciones de crecimiento.

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Agradecemos al Dr. A. Tzagoloff (Universidad de Columbia) por proporcionar anticuerpos levantados contra las proteínas marcadoras submitochondrial Cyt. b2, αKGD y Sco1. También agradecemos al Dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) por la útil discusión y comentarios durante el establecimiento de este protocolo.
Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (beca 2013/07937-8).
Fernando Gomes y Helena Turano también cuentan con el apoyo de la FAPESP, las becas 2017/09443-3 y 2017/23839-7, respectivamente. Angélica Ramos también cuenta con el apoyo de la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

1. Crecimiento de células de levadura
<ol><li>Aísle colonias individuales de la cepa de interés rayando una pequeña porción de las células de una cepa de glicerol de -80 ° C en una placa de agar YPD (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa). Incubar la placa a 30 °C durante 2-3 días. NOTA: La cepa de S. cerevisiae utilizada en este protocolo se deriva de BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Con la excepción de los genes marcadores auxotróficos, esta cepa no contiene ningún gen eliminado y no lleva ningún plásmido. Por lo tanto, se puede cultivar con éxito en un medio rico, estimulando el crecimiento celular vigoroso. Cuando trabaje con cepas transformadas con plásmidos, utilice el medio mínimo apropiado para la selección de plásmidos.</li>
	<li>Prepare un cultivo iniciador inoculando 2-3 colonias individuales de placa de agar YPD en 10-20 ml de medio YPGal (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de galactosa) en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Incubar a 30 °C durante 24 h con agitación vigorosa. NOTA: La elección del medio de crecimiento depende de la cepa de levadura utilizada en el protocolo. Tanto YPD como YPGal contienen fuentes de carbono fermentables, que permiten el crecimiento de cepas que no realizan la respiración mitocondrial. Sin embargo, dado que la glucosa reprime la expresión de muchos genes mitocondriales, no se recomienda utilizar esta fuente de carbono, ya que producirá menores cantidades de mitocondrias. Cuando se trabaja con cepas respiratorias competentes que pueden respirar, también es posible utilizar fuentes de carbono como el glicerol y el etanol en un intento de obtener un mayor rendimiento de mitocondrias.</li>
	<li>Diluya el cultivo iniciador en 1 L de medio YPGal fresco a un OD600 inferior a 0.1. Cultive las células a 30 °C con agitación vigorosa hasta que OD600 alcance 1-1.5. NOTA: Determine la tasa de crecimiento (tiempo de duplicación) para cada cepa de levadura antes de realizar el experimento. Esto proporcionará una estimación precisa del tiempo de incubación requerido para que el cultivo alcance un OD600 de 1-1.5.</li>
</ol>2. Aislamiento de mitocondrias altamente purificadas
NOTA: Este protocolo está adaptado de17, con modificaciones menores.
<ol><li>Cosecha las células por centrifugación a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar las células con agua destilada y recogerlas por centrifugación a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Determinar el peso húmedo de las células. NOTA: La forma más fácil de medir el peso del pellet celular a partir del paso 2.2 es determinar el peso del tubo de centrífuga vacío justo antes de la recolección de las celdas. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y mida el peso del mismo tubo con las células. El peso de las células es la diferencia entre las dos medidas.</li>
	<li>Resuspend las células en tampón de TDT (2 ml por 1 g de células) utilizando una pipeta Pasteur o una punta P5000. Consulte la Tabla 1 para la composición del búfer de DDT.</li>
	<li>Incubar las células a 30 °C durante 20 min con agitación suave (~70 rpm).</li>
	<li>Centrifugar a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente para granular las células.</li>
	<li>Lave las células con tampón de zymolyase sin la enzima (aproximadamente 7 ml por 1 g de células). Consulte la Tabla 1 para la composición del tampón de la cimoliasa.</li>
	<li>Centrifugar a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente para granular las células.</li>
	<li>Resuspend las células en el tampón sin Zymolyase (7 mL por 1 g de células).</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a un matraz Erlenmeyer de 250 ml y agregue Zymolyase-20T (3 mg por g de peso húmedo).</li>
	<li>Incubar las células a 30 °C durante 30-40 min con agitación suave (~70 rpm). Compruebe la eficiencia de este proceso comparando la turbidez de la suspensión celular antes y después del tratamiento con zymolyase. NOTA: En este paso, las células se convertirán en esferoplastos debido a la digestión de la pared celular por la cimoliasa.<ol>
<li>Para esto, agregue 50 μL de cada suspensión celular para separar los tubos de vidrio que contienen 2 ml de agua. Después de mezclar vigorosamente, la turbidez de la suspensión celular tratada con Zymolyase debe disminuir rápidamente debido a la interrupción osmótica de los esferoplastos. Por otro lado, la turbidez de la suspensión celular no tratada debe permanecer sin cambios. NOTA: Los efectos de la turbidez también se pueden monitorear mediante una simple inspección visual o midiendo el OD600 de ambas muestras. En el segundo caso, el OD600 de la muestra tratada con Zymolyase debe ser del 10% al 20% de la muestra no tratada. Un método alternativo consiste en contar las células en ambas muestras mediante el uso de microscopía de luz.</li>
		<li>Si el rendimiento de la formación de esferoplastos es bajo, agregue más Zymolyase e incube durante un intervalo adicional de 15 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Cosecha los esferoplastos por centrifugación a 2500 x g durante 5 min a 4 °C. NOTA: Todos los pasos adicionales deben llevarse a cabo rápidamente y en hielo o a 4 ° C para evitar la degradación de proteínas por enzimas hidrolíticas.</li>
	<li>Lavar los esferoplastos dos veces con tampón de homogeneización en frío helado (aproximadamente 6,5 ml por 1 g de células) y pellet centrifugando a 2.500 x g durante 5 min a 4 °C. Consulte la Tabla 1 para la composición del tampón de homogeneización.</li>
	<li>Resuspend los esferoplastos en tampón de homogeneización helado -frío (6,5 ml por 1 g de células) y transfiéralo a un homogeneizador Dounce de vidrio preenfriado. Utilice un homogeneizador de vidrio grande de aproximadamente 30 ml.</li>
	<li>Homogeneizar los esferoplastos con 15 golpes usando un mortero. NOTA: El número de golpes debe ajustarse dependiendo del ajuste del mortero. Para el mortero apretado, 15 golpes son suficientes. Por otro lado, si se utiliza un mortero suelto, se recomienda realizar hasta 25 golpes.</li>
	<li>Transfiera el homogeneizado a un tubo centrífugo de 50 ml y agregue 1 volumen de tampón de homogeneización en frío helado.</li>
	<li>Centrifugar el homogeneizado a baja velocidad, 1.500 x g durante 5 min a 4 °C para granular núcleos, restos celulares y células intactas.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml utilizando una pipeta Pasteur o una punta P5000 teniendo cuidado de evitar que se interrumpa el pellet.</li>
	<li>Centrifugadora a 4.000 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga de alta velocidad y centrífuga a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C para granular la fracción cruda de mitocondrias.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y lave suavemente el gránulo mitocondrial crudo en un tampón de homogeneización helada de 20-30 ml mediante un pipeteo suave con una punta P5000.</li>
	<li>Transfiera la suspensión a un tubo centrífugo de 50 ml y centrífuga a 4.000 x g durante 5 min a 4 °C para granular los restos celulares.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga de alta velocidad y centrífuga a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C para granular la fracción cruda de mitocondrias.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspenda suavemente el pellet mitocondrial crudo en un pequeño volumen (típicamente 1000 μL) de tampón SEM helado mediante pipeteo suave con una punta P1000. Consulte la Tabla 1 para la composición del búfer SEM. NOTA: Aunque esta fracción mitocondrial cruda se puede utilizar directamente en algunas aplicaciones, como en ensayos de importación de proteínas organello , contiene cantidades sustanciales de otros componentes celulares. Estas contaminaciones pueden dar lugar a interpretaciones erróneas de los resultados al determinar la localización clientelar de una proteína. Por lo tanto, se requieren más pasos de purificación para obtener una preparación mitocondrial altamente purificada, como se describe a continuación.</li>
	<li>Preparar soluciones de sacarosa en el tampón EM a concentraciones de 60%, 32%, 23% y 15% (p/v). Estas soluciones son estables hasta por 1 mes a 4 °C. Consulte la Tabla 1 para la composición del búfer EM.</li>
	<li>Prepare un gradiente de sacarosa de 4 pasos en un tubo de ultracentrífuga de la siguiente manera: Coloque 1.5 ml de sacarosa al 60% (p/ v) en la parte inferior del tubo de centrífuga. A continuación, pipetee cuidadosamente paso a paso: 4 ml de 32%, 1,5 ml de 23% y 1,5 ml de sacarosa al 15% (p/v). Tenga cuidado de no interrumpir las fases.</li>
	<li>Cargue cuidadosamente la fracción mitocondrial cruda sobre el gradiente de sacarosa.</li>
	<li>Centrífuga durante 1 h a 134.000 x g a 4 °C en un rotor de cucharón oscilante.</li>
	<li>Mantenga cuidadosamente la eliminación de la solución de sacarosa hasta que se alcance la fracción mitocondrial altamente purificada, que está representada por una banda marrón en la interfaz de sacarosa al 60% / 32%.</li>
	<li>Recupere las mitocondrias purificadas con una punta cortada P1000 y colóquela en un tubo de centrífuga de alta velocidad preenfriado.</li>
	<li>Diluya las mitocondrias recuperadas con 5-10 volúmenes de tampón SEM helado.</li>
	<li>Centrifugadora durante 30 min a 12.000 x g a 4 °C.</li>
	<li>Resuspend las mitocondrias puras en 500 μL de tampón SEM helado mediante pipeteo suave con una punta cortada P1000.</li>
	<li>Determine la concentración de proteínas de la preparación mitocondrial altamente purificada utilizando el procedimiento de Bradford siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajuste la concentración de proteína a 10 mg de proteína/ml con tampón SEM helado. NOTA: Para el protocolo de fraccionamiento submitochondrial que se describe a continuación, se recomienda utilizar mitocondrias recién preparadas. Sin embargo, Vögtle y colaboradores realizaron un detallado análisis de control de calidad de la integridad mitocondrial y demostraron que los orgánulos congelados también pueden ser utilizados en este protocolo13. Para ello, hacer alícuotas de 40 μL y congelarlas en nitrógeno líquido. Conservar a -80 °C.</li>
</ol>3. Protocolo de fraccionamiento Submitochondrial
NOTA: Este protocolo está adaptado de la referencia18 y se compone de dos pasos: (1) hinchazón hipotónica en presencia o ausencia de proteinasa K, y (2) sonicación seguida de extracción de carbonato. Realice todos los pasos de ambos protocolos en hielo o a 4 °C para evitar la degradación de proteínas.
<ol><li>Hinchazón hipotónica en presencia de proteinasa K
	<ol>
<li>Transfiera 40 μL de mitocondrias altamente purificadas a 10 mg/mL (400 μg) en cuatro tubos de microcentrífuga etiquetados preenfriados de 1,5 ml.</li>
		<li>Añadir 360 μL de tampón SEM en los tubos 1 y 2.</li>
		<li>Añadir 360 μL de tampón EM en los tubos 3 y 4.</li>
		<li>Añadir 4 μL de proteinasa K (10 mg/ml) en los tubos 2 y 4. Utilice el esquema de pipeteo que aparece en la Tabla 2 para evitar errores. NOTA: Prepare una solución de 10 mg/ml de proteinasa K en agua inmediatamente antes de su uso. La concentración final de proteinasa K en el experimento debe ser de alrededor de 50-100 μg/mL. Consulte la sección Discusión para obtener más detalles.</li>
		<li>Mezclar todos los tubos suavemente e incubar en hielo durante 30 min con mezcla ocasional.</li>
		<li>Agregue 4 μL de PMSF de 200 mM a los cuatro tubos para detener la actividad de la proteinasa K. PRECAUCIÓN: El PMSF es altamente tóxico. Use guantes cuando trabaje con soluciones que contengan PMSF.</li>
		<li>Centrifugadora a 20.000 x g durante 30 min a 4 °C.</li>
		<li>Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga etiquetado preenfriado de 1,5 ml. Tenga cuidado de evitar la interrupción del pellet. NOTA: El pellet se puede resuspendir directamente en el búfer de muestra para un análisis adicional de SDS-PAGE y western blot. Sin embargo, los rastros de proteinasa K pueden permanecer activos incluso después del tratamiento con PMSF y, finalmente, pueden digerir algunas proteínas después de que el pellet se haya disuelto en el tampón de muestra que contiene SDS. Para evitar este problema, la proteinasa K podría ser completamente inactivada por el tratamiento de las muestras con ácido tricloroacético (TCA) como se describe a continuación. PRECAUCIÓN: El TCA es altamente tóxico. Use guantes cuando trabaje con soluciones que contengan TCA.</li>
		<li>Resuspend el pellet desde el paso 3.1.8 en 400 μL de tampón SEM helado.</li>
		<li>Precipitar el sobrenadante (a partir del paso 3.1.8) y el pellet resuspendido (a partir del paso 3.1.9) con TCA a una concentración final del 10% (p/v).</li>
		<li>Incubar todos los tubos en hielo durante 10 min.</li>
		<li>Centrifugar las muestras tratadas con TCA durante 10 min a 12.000 x g a 4 °C.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 200 μL de tampón de muestra. NOTA: Es posible que el indicador de pH azul de bromofenol se vuelva amarillo debido al tratamiento ácido. Si esto sucede, agregue pequeñas alícuotas (1-5 μL) de 1 M de base Tris hasta que se vuelva azul.</li>
		<li>Añadir 4 μL de PMSF de 200 mM a todos los tubos.</li>
		<li>Almacene todas las muestras a -80 °C hasta su posterior análisis por SDS-PAGE y western blot.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonicación y extracción de carbonato NOTA: En este protocolo, no es necesario utilizar mitocondrias recién preparadas una vez que la sonicación provoca la ruptura de las membranas mitocondriales.<ol>
<li>Transfiera 200 μL de mitocondrias altamente purificadas a 10 mg/ml (2 mg de proteína) a un tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 ml.</li>
		<li>Diluya las mitocondrias una sola vez con un tampón SEM helado.</li>
		<li>Sonicar mitocondrias durante 3 x 30 s sobre hielo. Utilice un sonicador compatible para pequeños volúmenes.</li>
		<li>Centrifugar la muestra durante 30 min a 100.000 x g a 4 °C.</li>
		<li>Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 ml. Manténgalo en hielo. Esta muestra se denominará fracción de proteína soluble (S).</li>
		<li>Resuspenda el pellet del paso 3.2.4 en 400 μL de tampón SEM helado.</li>
		<li>Tome 100 μL del pellet resuspendido del paso 3.2.6 y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 ml. Manténgalo en hielo. Esta muestra se denominará fracción de partículas submitochondrial (SMP).</li>
		<li>Diluya los 300 μL restantes del paso 3.2.6 una vez con carbonato de sodio de 200 mM recién preparado.</li>
		<li>Incubar la muestra a partir del paso 3.2.8 en hielo durante 30 min.</li>
		<li>Centrifugar la muestra durante 30 min a 100.000 x g a 4 °C.</li>
		<li>Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 ml. Manténgalo en hielo. Esta muestra se denominará fracción sobrenadante de carbonato (CS).</li>
		<li>Resuspender el pellet del paso 3.2.10 en 400 μL de tampón SEM helado. Esta muestra se denominará fracción precipitada de carbonato (CP).</li>
		<li>Precipitar todas las muestras (S, SMP, CS y CP) con TCA a una concentración final del 10% (p/v).</li>
		<li>Incubar todos los tubos en hielo durante 10 min.</li>
		<li>Centrifugar las muestras tratadas con TCA durante 10 min a 12.000 x g a 4 °C.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y vuelva a suspender cada gránulo en el tampón de muestra. Si el tampón de la muestra se vuelve amarillo, agregue pequeñas alícuotas (1-5 μL) de 1 M de base Tris hasta que se vuelva azul.</li>
		<li>Añadir 1 μL de 200 mM PMSF a todos los tubos.</li>
		<li>Almacene todas las muestras a -80 °C hasta su posterior análisis por SDS-PAGE y western blot.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).</li>
<li>Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+and+energetics+of+mitochondrial+protein+import+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).</li>
<li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).</li>
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<li>Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+disulfide+bonds+reveals+an+evolutionarily+conserved+mechanism+involved+in+mitochondrial+protein+translocase+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly.</a> Scientific Reports. 6, 27484(2016).</li>
<li>Callegari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIM29+is+a+subunit+of+the+human+carrier+translocase+required+for+protein+transport%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport.</a> FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).</li>
<li>Neupert, W., Herrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+proteins+into+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Translocation of proteins into mitochondria.</a> Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).</li>
<li>Meineke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outer+membrane+form+of+the+mitochondrial+protein+Mcr1+follows+a+TOM-independent+membrane+insertion+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway.</a> FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

El protocolo aquí presentado ha sido utilizado con éxito y optimizado continuamente durante mucho tiempo para determinar la localización de proteínas en los compartimentos peticionarios13,14,18,21,22,23. La fiabilidad y reproducibilidad de este protocolo dependen en gran medida de la pureza e integridad de los preparados <sup...

Las mitocondrias son orgánulos esenciales de las células eucariotas que desempeñan un papel crucial en la bioenergética, el metabolismo celular y las vías de señalización1. Para ejecutar adecuadamente estas tareas, las mitocondrias dependen de un conjunto único de proteínas y lípidos responsables de su estructura y función. La levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae ha sido ampliamente utilizada como sistema modelo para investigaciones sobre procesos mitocondriales, así como para otros orgánulos2. El genoma mitocondrial codifica solo ocho proteínas en la levadura; la gran mayoría de las proteínas mitocondriales (~99%) están codificadas por genes nucleares, que se traducen en ribosomas citosólicos, y posteriormente se importan a sus compartimentos electorales correctos mediante sofisticadas maquinarias de importación de proteínas3,4,5. Así, la biogénesis mitocondrial depende de la expresión coordinada de los genomas nuclear y mitocondrial6,7. Las mutaciones genéticas que causan defectos en la biogénesis mitocondrial están asociadas con enfermedades humanas8,9,10.
En las últimas dos décadas, los estudios proteómicos de alto rendimiento dirigidos a mitocondrias altamente purificadas dieron como resultado una caracterización integral del proteoma mitocondrial de levadura, que se ha estimado que está compuesto por al menos 900 proteínas11,12,13,14. Aunque estos estudios proporcionaron información valiosa, la localización suborganular de cada proteína en los cuatro subcompartimentos mitocondriales, a saber, la membrana externa (OM), el espacio intermembrana (IMS), la membrana interna (IM) y la matriz, todavía es necesaria. Esta cuestión se abordó parcialmente con estudios proteómicos de los dos subcompartimentos mitocondriales más pequeños (OM e IMS)15,16. Más recientemente, Vögtle y sus colaboradores dieron un gran paso adelante al generar un mapa global de alta calidad de la distribución de proteínas submitochondrial en levadura. Utilizando un enfoque integrado que combina espectrometría de masas cuantitativa basada en SILAC, diferentes protocolos de fraccionamiento submitocondrial y el conjunto de datos de los proteomas OM e IMS, los autores asignaron 818 proteínas a los cuatro subcompartimentos mitocondriales13.
A pesar de los avances logrados por estos estudios proteómicos de alto rendimiento, nuestro conocimiento sobre la composición del proteoma submitochondrial está lejos de ser completo. De hecho, entre las 986 proteínas reportadas por Vögtle y colaboradores como localizadas en mitocondrias de levadura, 168 no pudieron ser asignadas en ninguno de los cuatro compartimentos submitocondriales13. Además, los autores no proporcionaron información sobre la topología de membrana de las proteínas que se predijo que estaban unidas periféricamente a la periferia de las membranas mitocondriales. Por ejemplo, no es posible saber si una proteína que fue asignada como periféricamente unida a la membrana interna está frente a la matriz o al espacio intermembrana. Aparte de estos datos faltantes de los estudios de todo el proteoma, hay información contradictoria sobre la localización suborganular de un número significativo de proteínas mitocondriales. Un ejemplo es la proteasa Prd1, que ha sido asignada como una proteína espacial intermembrana en las bases de datos comunes como Saccharomyces Genome Database (SGD) y Uniprot. Sorprendentemente, utilizando un protocolo de subfraccionamiento similar al aquí descrito, Vögtle y colaboradores demostraron claramente que Prd1 es una proteína genuina de la matriz13. Como se mencionó anteriormente, la localización submitocondrial de muchas proteínas mitocondriales necesita ser dilucidada o reevaluada. Aquí, proporcionamos un protocolo simple y confiable para determinar la localización suborganular de las proteínas mitocondriales de levadura. Este protocolo fue desarrollado y optimizado por diversos grupos de investigación y se ha utilizado de forma rutinaria para determinar la localización submitocondrial, así como la topología de membrana de muchas proteínas mitocondriales.

<table><tbody><tr><td>Bacto Peptona</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Extracto de levadura</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Tubos de centrífuga ultratransparentes, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (sin ácidos grasos BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Componente del tampón de homogeneización</td></tr><tr><td>DL-Ditiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td>Componente del tampón DDT</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Galactosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonilo fluoruro (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>Se utiliza para inactivar la proteinasa K</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético (TCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase-20T de Arthrobacter luteus</td><td>MP Biomedicals, Irvine, CA 320921</td><td></td><td>Se utiliza para lisar las paredes celulares de levadura viva para producir esferoplasto</td></tr></tbody></table>

evaluación de la localización de proteínas submitochondriales en levaduras en ciernes saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

A pesar de los recientes avances en la caracterización del proteoma mitocondrial de levadura, la localización submitocondrial de un número significativo de proteínas sigue siendo difícil de alcanzar. Aquí, describimos un método robusto y efectivo para determinar la localización suborganeular de las proteínas mitocondriales de levadura, que se considera un paso fundamental durante la elucidación de la función de la proteína mitocondrial. Este método implica un paso inicial que consiste en obtener mitocondrias intactas altamente puras. Estas preparaciones mitocondriales se someten a un protocolo de subacccionamiento que consiste en shock hipotónico (hinchazón) e incubación con proteinasa K (proteasa). Durante la hinchazón, la membrana mitocondrial externa se interrumpe selectivamente, lo que permite que la proteinasa K digiera las proteínas del compartimento espacial intermembrana. Paralelamente, para obtener información sobre la topología de las proteínas de membrana, las preparaciones mitocondriales se sonican inicialmente y luego se someten a extracción alcalina con carbonato de sodio. Finalmente, después de la centrifugación, las fracciones de pellets y sobrenadantes de estos diferentes tratamientos son analizadas por SDS-PAGE y western blot. La localización submitocondrial así como la topología de membrana de la proteína de interés se obtiene comparando su perfil de western blot con estándares conocidos.

El éxito del protocolo de fraccionamiento submitochondrial depende de la obtención de mitocondrias intactas altamente purificadas. Para ello, es fundamental que durante la lisis celular de levadura, la integridad de los orgánulos permanezca casi totalmente conservada. Esto se logra mediante el uso de un protocolo de lisis celular que combina la digestión enzimática de la pared celular seguida de la interrupción física de la membrana plasmática mediante el uso de un homogeneizador Dounce. El contenido mitocondrial se reco...

A pesar de los avances recientes, muchas proteínas mitocondriales de levadura aún permanecen con sus funciones completamente desconocidas. Este protocolo proporciona un método sencillo y fiable para determinar la localización submitocondrial de proteínas, que ha sido fundamental para la elucidación de sus funciones moleculares.

Evaluación de la localización de proteínas submitochondriales en levaduras en ciernes Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Este protocolo está diseñado para determinar la localización submitocondrial de las proteínas mitocondriales de levadura, que se considera como un paso fundamental durante la elucidación de la función de la proteína mitocondrial. El protocolo es adecuado para nuestras cepas de levadura mantenidas en diferentes condiciones de crecimiento. Representando una poderosa herramienta para la investigación como el estudio de las mitocondrias.Para empezar, las células de rayas de la cepa de glicerol almacenadas a 80 C, en una placa de agar YPD para aislar colonias individuales de la cepa de interés. E incubar la placa a 30 C durante 2 a 3 días. Prepare un cultivo iniciador inoculando de 2 a 3 colonias individuales de placa de agar YPD en un matraz Erlenmeyer de 100 ml que contenga de 10 a 30 ml de medio YPGal.Incubar el matraz a 30 C durante 24 horas con agitación vigorosa a 180 a 200 rpm. Diluya el cultivo iniciador en 1 L de medio YPGal fresco a una densidad óptica inferior a 0,1 a 600 nm. Cultive las células a 30 C con agitación vigorosa a 180 a 200 rpm durante aproximadamente 12 horas, hasta que la densidad óptica alcance de 1 a 1.5.Realizar el aislamiento de mitocondrias altamente purificadas como se describe en el texto. Y determine la concentración de proteínas de la preparación mitocondrial altamente purificada, utilizando el ensayo Bradford, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajuste la concentración de proteína a 10 mg/ml con tampón SEM helado.Transfiera 40 l de mitocondrias altamente purificadas a cuatro tubos de microcentrífuga preenfriados y etiquetados de 1,5 ml. Añadir 360 l de tampón SEM en el primer y segundo tubo. Y 360 l de tampón EM en el tercer y cuarto tubo.Usando el esquema de pipeteo, según el texto, agregue 4 L de proteinasa K recién preparada en el segundo y cuarto tubo. Después de mezclar todos los tubos suavemente, incubar en hielo durante 30 minutos con mezcla ocasional. Para detener la actividad de la proteinasa K, agregue 4 L de 200 mM PMSF a los cuatro tubos.Centrifugar los tubos a 20,000 x g durante 30 minutos a 4 C.Y recoger el sobrenadante, sin molestar el pellet, en un nuevo tubo de microcentrífuga etiquetado preenfriado de 1,5 ml. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 400 l de tampón SEM helado. Para inactivar las posibles trazas de proteinasa K, precipitar el sobrenadante recogido y resuspendir el pellet con ácido tricloroacético hasta una concentración final del 10%Incubar los tubos sobre hielo durante 10 minutos.Centrifugar las muestras tratadas con ácido tricloroacético durante 10 minutos a 12, 000 x g a 4 C.Y después de retirar el sobrenadante, resuspendir el pellet en 200 l de tampón de muestra. Si el azul de bromofenol se vuelve amarillo, agregue de 1 a 5 l de base 1 M Tris, hasta que se vuelva azul. Añadir 4 l de PMSF de 200 mM a todos los tubos.Almacene las muestras a 80 C hasta un análisis adicional por SDS-PAGE y western blot. Transfiera 200 l de mitocondrias altamente purificadas a un tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 ml. Diluya las mitocondrias una sola vez con un tampón SEM helado.Usando un sonicador compatible con pequeños volúmenes, sonicar las mitocondrias 3 veces durante 30 segundos en hielo. Centrifugar la muestra durante 30 minutos a 100, 000 x g a 4 C.Y recoger el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 ml. Después de etiquetar el tubo como S"para la fracción de proteína soluble, mantenga el tubo en hielo.Vuelva a suspender el pellet del paso anterior en 400 l de tampón SEM helado. Transfiera 100 l del pellet resuspendido a un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 ml. Etiquete el tubo como SMP"para la fracción de partículas de submitochondrial, y mantenga el tubo en hielo.Diluya los 300 l restantes de pellet resuspendido una sola vez con carbonato de sodio de 200 mM recién preparado. E incubar la muestra diluida en hielo durante 30 minutos. Luego, centrifugue la muestra durante 30 minutos a 100, 000 x g a 4 C.Recoja el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado de 1.5 ml.Etiquete la muestra como CS"para la fracción sobrenadante de carbonato y mantenga el tubo en hielo. Vuelva a suspender el pellet del paso anterior en 400 l de tampón SEM helado. Y nombrar la muestra como CP"para la fracción precipitada de carbonato.Precipitar todas las muestras con ácido tricloroacético a una concentración final del 10% e incubar los tubos en hielo durante 10 minutos. Luego, centrifugue las muestras durante 10 minutos a 12, 000 x g a 4 C.Después de quitar el sobrenadante, vuelva a suspender cada gránulo en el tampón de muestra. Si el tampón de muestra se vuelve amarillo, agregue de 1 a 5 l de base Tris de 1 M hasta que se vuelva azul.Agregue 1 l de PMSF de 200 mM a todos los tubos y guárdelo a 80 C hasta un análisis adicional por SDS-PAGE y western blot. La fracción mitocondrial cruda se purificó en la centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa, y se observó una reducción en otros contaminantes celulares. La conversión de mitocondrias a mitóticos fue monitoreada por la desaparición de la proteína espacial intermembrana citocromo b2 en el pellet.Con la aparición concomitante en el sobrenadante. La degradación mediada por la proteinasa K de la proteína intermembrana Sco1 se observó debido a la interrupción de la membrana externa por choque osmótico. La integridad de la membrana mitocondrial externa fue confirmada por la protección del citocromo b2 y Sco1 contra la degradación de la proteinasa K en la fracción de pellets.Del mismo modo, la protección de la proteína soluble en matriz KGD confirmó la integridad de la membrana mitocondrial interna. El perfil de Western Blot de Prx1 sugirió una localización mitocondrial dual en el espacio intermembrana y la matriz. Las mitocondrias fueron sometidas a sonicación y extracción de carbonato para investigar la topología de las proteínas de membrana.El vertido integral de proteínas de membrana permaneció en las fracciones de pellets. El KGD se detectó en la fracción sobrenadante. La detección de la proteína KGD en el pellet se debió a variaciones de los parámetros de sonicación que afectaron a la formación de SMP.Después del tratamiento con carbonato de sodio, el KGD y la fracción SMP se solubilizaron y se encontraron en la fracción sobrenadante. El perfil de Western Blot prx1 sugirió una asociación con la periferia de la membrana. Para el éxito del protocolo de fraccionamiento submitochondrial, es importante detener la actividad de la proteinasa K después de la hinchazón hipotónica agregando PMSF a las muestras.Los sitios proporcionan información sobre la localización de la proteína submitochondrial. Este protocolo también se puede utilizar para comprobar la integridad de las preparaciones mitocondriales, lo cual es fundamental durante los estudios proteómicos de los subcompartimentos mitocondriales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

De fusión GFP-proteínas son ampliamente utilizados para visualizar los orgánulos por microscopía confocal. Sin embargo, la detección de mutaciones que afectan a la morfología de los orgánulos por lo general requiere de mutagénesis individual y requiere mucho tiempo. En este caso, se demuestra un método para incorporar al mismo tiempo orgánulo-GFP marcadores en casi 5.000 genes no esenciales en la levadura.

Un método de alto rendimiento a nivel mundial para estudiar la morfología orgánulo en S. cerevisiae

Para estudiar la relación entre la homeostasis de las proteínas, el estrés y el envejecimiento, monitoreamos los cambios en el plegamiento de las proteínas siguiendo la disfunción de las proteínas, la localización de las proteínas en la célula y la estabilidad de las proteínas a nivel de organismo, celular y proteína, utilizando el metazoo genéticamente tratable Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Uso de Caenorhabditis elegans como sistema modelo para estudiar la homeostasis de proteínas en un organismo multicelular

Muchos ARNm que codifican proteínas mitocondriales se asocian con la membrana externa mitocondrias. Se describe un procedimiento de fraccionamiento subcelular destinada a aislamiento de las mitocondrias de levadura con sus ARNm y ribosomas asociados. Este protocolo se puede aplicar a las células cultivadas bajo diversas condiciones con el fin de revelar los mecanismos de la localización del mRNA y la traducción localizada cerca de las mitocondrias.

Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada

Este artículo describe un ensayo basado en el crecimiento de levaduras para la determinación de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas. También demuestra un método para la extracción rápida de proteínas de levadura, adecuado para la transferencia de Western para confirmar bioquímicamente los requisitos de degradación. Estas técnicas se pueden adaptar para monitorear la degradación de una variedad de proteínas.

Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este manuscrito describe la detección de sumoylation y ubiquitinación de proteínas del cinetocoro, Ndc10 y Ndc80, en la levadura Saccharomyces cerevisiae en ciernes.

Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80

El genoma mitocondrial de levadura de Baker codifica ocho polipéptidos. El objetivo del protocolo actual es etiquetarlos todos ellos y posteriormente visualizarlos como bandas separadas.

Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae

La microscopía de lapso de tiempo es una herramienta valiosa para estudiar la meiosis en levaduras en ciernes. Este protocolo describe un método que combina la sincronización del ciclo celular, la microscopía de lapso de tiempo y el agotamiento condicional de una proteína diana para demostrar cómo estudiar la función de una proteína específica durante la segregación cromosómica meiótica.

Uso de microscopía de lapso de tiempo y agotamiento nuclear de proteínas en etapa específica para estudiar la meiosis en S. cerevisiae

Los sitios de contacto mitocondrial son complejos proteicos que interactúan con las proteínas de la membrana interna y externa mitocondrial. Estos sitios son esenciales para la comunicación entre las membranas mitocondriales y, por lo tanto, entre el citosol y la matriz mitocondrial. Aquí, describimos un método para identificar candidatos que califican para esta clase específica de proteínas.

Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial

La levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe está emergiendo como un modelo atractivo para el estudio de las mitocondrias. En este trabajo se describe un protocolo para analizar la abundancia y ensamblaje de los complejos respiratorios mitocondriales en S. pombe. Esto permite la caracterización de las nuevas funciones de los genes conservados en la cadena respiratoria mitocondrial.

Análisis de la Expresión y Ensamblaje de Complejos de las Proteínas de la Cadena Respiratoria Mitocondrial en la Levadura de Fisión Schizosaccharomyces pombe

Este protocolo detalla dos métodos de detención del ciclo celular de levadura y liberación opcional, y elabora el uso de microscopía de fluorescencia para estudiar los procesos dependientes del ciclo celular en S. cerevisiae.

Manipulación y análisis de procesos dependientes del ciclo celular en levaduras en ciernes

Aprende a determinar la localización submitocondrial de proteínas mitocondriales en Saccharomyces cerevisiae mediante fraccionamiento y ensayos de proteasa. Este método permite estudiar la función molecular de proteínas en diferentes condiciones de crecimiento.

Evaluación de la localización de proteínas submitochondriales en levaduras en ciernes Saccharomyces cerevisiae

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