Diseño y desarrollo de un modelo para estudiar el efecto del oxígeno suplementario en el microbioma de las vías respiratorias de la fibrosis quística

Estos protocolos están diseñados para modelar los efectos in vitro del uso de oxígeno suplementario en el microbioma pulmonar de pacientes con fibrosis quística. Esta receta de medios está diseñada para reflejar la composición fisiológica del esputo para las personas que viven con fibrosis quística. El proceso de sparging introduce la capacidad de cultivo bajo diferentes condiciones de oxígeno.

Las alteraciones en el medio de esputo artificial le permiten imitar otras enfermedades pulmonares crónicas y modelar comunidades microbianas en otras condiciones, como diferentes concentraciones de glucosa en pacientes con fibrosis quística y diabetes concurrentes. Una descripción general de los pasos para la preparación del medio de esputo artificial muestra la mezcla de los ASCM, ASMM y ASBM preparados. El tampón de fregonas se utiliza para ajustar el pH a 6.3 y la esterilización por filtro del medio se lleva a cabo en una cámara frigorífica en un agitador orbital.

Para empezar, prepare un medio de esputo artificial agregando 250 mililitros de ASCM a la botella de un litro que contiene ASMM. Luego agregue 250 mililitros de ASBM a la botella mediana. Valore el medio con un tampón básico de fregonas de un molar para alcanzar un pH de 6.3 en un papel de pH.

Refrigere el medio de esputo artificial a cuatro grados centígrados hasta la filtración. Luego, para iniciar el proceso de filtración, transfiera 200 mililitros de medio de esputo artificial sin filtrar a un sistema de filtración al vacío con un filtro de tamaño de poro de 0.22 micrómetros. Después de conectar el sistema de filtración a la bomba de vacío, encienda la bomba de vacío, luego coloque la cámara en un agitador orbital, agitando a 90 rotaciones por minuto en una cámara frigorífica a cuatro grados centígrados.

Cambie el filtro después de que se filtren 350 mililitros de medio para superar el problema de obstrucción. Después de filtrar una cantidad considerable, a un medio adicional de 150 mililitros para la filtración. Repita la filtración con cámaras adicionales hasta que se filtren todos los medios.

Descripción general del ahorro de oxígeno que demuestra la adición de esputo del paciente al medio de esputo artificial en una botella de suero en autoclave. A continuación, esparce la botella de suero sellada con una mezcla de gases. Finalmente, se incuba el frasco de suero para obtener el cultivo de Alec Watts en el intervalo de 24 horas para su posterior secuenciación metagenómica.

Para comenzar el cultivo de botellas séricas, etiquete las botellas de suero en autoclave de 500 mililitros con identificadores de muestra, fecha y hora de inoculación y porcentaje de oxígeno objetivo. En una campana biológica, agregue 24 mililitros del medio de esputo artificial a cada botella de suero que se esté configurando. Para obtener un volumen de muestra suficiente para cada condición de cultivo, si es necesario, diluya la muestra con solución salina tamponada con fosfato estéril, luego homogeneice el esputo con una aguja de calibre 18 y agregue un mililitro del esputo del paciente a cada frasco de suero.

A continuación, con pinzas estériles, coloque los tapones de goma en autoclave en la parte superior de cada botella de suero, presione los tapones de goma sin tocar la parte inferior del tapón. Después de retirar las botellas de la campana, aplique y engarce los sellos de aluminio. Retire la pieza central de los sellos y limpie la parte superior de las botellas con una toallita con alcohol y pase el sello de la botella a través de una llama de quemador Bunsen.

Ahora fije una aguja estéril de calibre 18 a una jeringa de lista de émbolo con un filtro, inserte primero la jeringa de liberación de gas fijada en la botella. Ahora fije una aguja estéril de calibre 18 a la salida de gas del sistema e inserte la aguja de salida de gas en la botella también. Dirija las uniones T desde los tanques a través del monitor de oxígeno.

Después de verificar la concentración de oxígeno objetivo que fluye a través del sistema, apunte aproximadamente cinco litros por minuto de flujo de gas. Desvíe las uniones T desde los tanques hasta la salida de gas. A medida que el gas comienza a fluir a través de la botella de suero, preste mucha atención al manómetro y, si la presión aumenta inesperadamente, apague el sistema de inmediato.

Después de correr, el oxígeno pasa a través de la botella de suero durante un minuto a cinco litros por minuto, los ajustes permiten 10 intercambios de aire y aseguran que la atmósfera interna alcance la concentración deseada de 100% de oxígeno. Retire la aguja de liberación de gas, calibre 18. Después de permitir que la presión en la botella de suero se acumule en una atmósfera, retire inmediatamente la aguja de salida de gas.

Incubar los frascos de suero en un agitador de incubadora de 37 grados Celsius a 150 rotaciones por minuto durante intervalos de 3, 24 horas. Alec Watts se toman en cada intervalo de 24 horas para el análisis aguas abajo y las muestras se vuelven a analizar cada vez. El ejemplo aquí muestra cómo puede ser un cultivo antes y después de la incubación.

Los niveles de oxígeno y pH de salida se midieron en el transcurso del proceso de cultivo para muestras de esputo mantenidas a 37 grados centígrados. Con ambos intervalos de ahorro de 12 horas y 24 horas, las concentraciones de oxígeno se mantuvieron aproximadamente a lo largo del tiempo con una caída moderada en la concentración de oxígeno observada para las tres afecciones. Los niveles de pH medidos estaban dentro del rango fisiológico sin cambios significativos a lo largo del tiempo.

La comparación de la carga microbiana, la diversidad y la composición de la comunidad entre el esputo no cultivado y cultivado reveló un aumento de 20 veces en la carga microbiana en el esputo cultivado. Las métricas de diversidad indicaron la preservación de la composición de la comunidad con diferencias globales mínimas introducidas por el proceso cultural. El análisis comparativo de las 120 especies microbianas en esputo cultivado y no cultivado se realizó mediante secuenciación metagenómica.

46 de estas especies fueron identificadas tanto en muestras no cultivadas como cultivadas. Mientras que 35 se identificaron exclusivamente en muestras no cultivadas y 39 se identificaron exclusivamente en muestras cultivadas. Se generaron curvas de crecimiento basadas en absorbentes para patógenos pulmonares comunes de la FQ cultivados en medios artificiales de esputo a partir de aislados de muestras de pacientes bajo una concentración normal de oxígeno del 21%.

Ningún cambio a lo largo del tiempo en la densidad óptica a 600 nanómetros en la MAPE solo el control negativo indicó un cultivo libre de contaminación. Los patrones típicos de la curva de crecimiento observados indican que el medio ASM se puede utilizar para la generación de curvas de crecimiento utilizando métodos ópticos. La secuenciación metagenómica se utiliza aquí para describir la composición de la comunidad microbiana.

Otras técnicas como la secuenciación metatranscriptómica se pueden utilizar para evaluar la expresión génica o la metabolómica para evaluar la producción de metabolitos.