Name: In vitro Análisis celular multiparamétrico mediante matrices de transistores de efecto de campo moduladas por carga micro orgánica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a fabricar matrices micro OCMFET para análisis celular multiparamétrico in vitro. Este dispositivo flexible y de bajo costo permite monitorear actividades eléctricas y metabólicas en cultivos celulares electroactivos.

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Los autores reconocen la financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención n.º 882897-Search&Rescue y el proyecto PON "TEX-STYLE" ARS01_00996, PNR 2015-2020.

Se siguieron todas las pautas internacionales, nacionales y/o institucionales aplicables para el cuidado y uso de los animales. Se hicieron todos los esfuerzos para reducir el número de animales para el proyecto y minimizar su sufrimiento.
1. Preparación de la solución en desarrollo, las soluciones de grabado, la solución semiconductora orgánica y las máscaras fotolitográficas
<ol><li>Prepare la solución en desarrollo diluyendo los gránulos de NaOH en agua desionizada a una concentración de 175 mM. NOTA: Esta es una reacción exotérmica. Si se utiliza un recipiente de plástico, siga agitando el recipiente hasta que todos los gránulos se disuelvan por completo.</li>
	<li>Prepare la solución de grabado de titanio diluyendo ácido fluorhídrico (HF) en agua desionizada (1 parte de 48% de HF concentrado, 49 partes de agua desionizada). PRECAUCIÓN: El ácido fluorhídrico puede penetrar fácilmente en la piel, causando daños graves a las capas de tejido profundo. La neutralización rápida de la IC es necesaria para prevenir la destrucción de tejidos, que puede continuar durante días y provocar lesiones graves o incluso la muerte. Los riesgos asociados con la IC dependen de la concentración y la duración del contacto con el ácido. Use solo debajo de una campana de humos usando un protector facial. También se recomienda encarecidamente el doble guante.</li>
	<li>Prepare la solución de grabado de oro mezclando yodo, yoduro de potasio y agua desionizada (para 250 g de solución, use 200 ml de agua desionizada, 20 g de KI, 5 g de I2). Revuelva la solución a temperatura ambiente durante 1 h y déjela reposar durante la noche antes de usarla.</li>
	<li>Preparar la solución semiconductora disolviendo el pentaceno 6,13-bis(triisopropilsilsililetil))(TIPS Pentaceno) en anísole (1% de peso) y revolviendo suavemente durante 2 h en una placa caliente a 80 °C. NOTA: Siga agitando esta solución. Utilice viales de vidrio ámbar y/o guárdelos en condiciones de poca luz.</li>
	<li>Prepare el conjunto de máscaras fotolitográficas deseadas con un software de gráficos vectoriales. Prepare 5 máscaras para todo el proceso: la máscara para el modelado de las puertas flotantes (FG); la máscara para la apertura de las vías y las áreas de detección para los registros electrofisiológicos; la máscara para el proceso de autoalineación; la máscara para el modelado de la fuente, el drenaje y el contacto superior de la puerta de control; y la máscara para la activación plasmática de los canales de pH. NOTA: Dependiendo de la resolución necesaria y la configuración fotolitográfica específica, se pueden usar diferentes tipos de máscaras. En el caso de los dispositivos propuestos (que tienen una resolución lateral máxima de 40 μm), se han comprado máscaras flexibles de plástico simples en una tienda de fotocopias local.</li>
</ol>2. Selección y preparación del sustrato
<ol><li>Corte un cuadrado de 6 x 6 cm2 de tereftalato de polietileno (PET) de 250 μm de una lámina de PET prístina. NOTA: Comience con un sustrato ligeramente más grande que el dispositivo final para tener márgenes lo suficientemente amplios como para permitir la manipulación con pinzas de laboratorio estándar sin dañarlo.</li>
	<li>Inspeccione el sustrato con un microscopio óptico para excluir la presencia de surcos profundos y arañazos. Seleccione cuidadosamente los sustratos menos rayados, ya que las imperfecciones más grandes pueden provocar la falla del dispositivo final.</li>
	<li>Enjuague los sustratos de PET con acetona, alcohol isopropílico y agua desionizada (en este orden) y séquelos con corrientes de nitrógeno. Guarde los sustratos en placas/recipientes de Petri de plástico limpio.</li>
</ol>3. FG: deposición de titanio
<ol><li>Limpie previamente los sustratos con oxígeno plasmático (30 s a 100 W) y colóquelos en el soporte del sustrato dentro de la cámara de vacío del evaporador térmico.</li>
	<li>Coloque 60 mg de titanio en el crisol, cierre el obturador y bombee por la cámara de evaporación hasta que alcance un nivel de vacío inferior a 10-6 Torr. Aumente la potencia del evaporador hasta que el crisol brille en rojo y espere 30 s. Abra el obturador, aumente la potencia al 60% (o hasta que el crisol brille en blanco brillante) y espere 60 s. Cierra el obturador y baja la alimentación.</li>
	<li>Retire los sustratos del evaporador; límpielos con acetona, alcohol isopropílico y agua desionizada; y secarlos con corrientes de nitrógeno. Realizar un segundo tratamiento con plasma de oxígeno (60 s a 200 W) para oxidar ligeramente la superficie de titanio.</li>
</ol>4. Modelado FG
<ol><li>Coloque un sustrato a la vez en el revestimiento de centrifugado colocado dentro de una campana de humos. Deposite 4 mL de fotorresistencia sobre el sustrato utilizando una pipeta de plástico desechable. Utilice los siguientes parámetros de recubrimiento de espín para obtener una capa fotorresistente de 2 μm de espesor: velocidad de centrifugado: 3000 rpm; tiempo de centrifugado: 45 s; tiempo de aceleración: 0.5 s; tiempo de desaceleración: 0.5 s.</li>
	<li>Hornea suavemente la fotorresistente colocando el sustrato sobre una placa caliente (70 °C durante 5 min). Guarde el sustrato dentro de un recipiente de petri/plástico envuelto en papel de aluminio para evitar la exposición directa a la luz. NOTA: Evite la temperatura de horneado sugerida (100 °C durante 50 s) para evitar la deformación del sustrato. Sin embargo, hornear a una temperatura más baja durante más tiempo garantiza buenos resultados.</li>
	<li>Coloque el dispositivo en un bromógrafo y coloque la máscara fotolitográfica de plástico con el diseño FG deseado sobre el sustrato. Exponer a la luz ultravioleta (UV) de la parte superior durante 1 min, y retirar con cuidado la mascarilla, teniendo cuidado de minimizar los movimientos laterales de la mascarilla sobre el sustrato para evitar rascarla.</li>
	<li>Sumerja el sustrato durante 5 s en un recipiente de vidrio lleno de la solución en desarrollo (paso 1.1). Enjuáguelo rápidamente en agua desionizada y séquelo con nitrógeno. Use un microscopio óptico para buscar manchas subdesarrolladas / sobredesarrolladas en el sustrato. Repetir la inmersión del sustrato en solución en desarrollo en caso de subdesarrollo.</li>
	<li>Graba el titanio expuesto sumergiéndolo en la solución de grabado de titanio (paso 1.2) durante 15 s, enjuágalo con agua desionizada y sécalo con nitrógeno. Inspeccione ópticamente el sustrato y retire la fotorresistente con acetona. Enjuague el sustrato con alcohol isopropílico y agua desionizada, y séquelo con nitrógeno.</li>
</ol>5. Deposición dieléctrica de compuerta
<ol><li>Prepare la cámara de deposición del recubridor de parileno distribuyendo 2 ml del promotor de adhesión (silano - 3-(trimetoxisilil)metacrilato de propil) en las paredes de la cámara de deposición utilizando una toallita de laboratorio. Coloque 300 mg de dímero Parylene C (correspondiente a un espesor final de 150 nm) en el recubridor de Parylene. Establezca el valor de presión más bajo en 7 mbar y el valor de presión más alto en 10 mbar. Después de la deposición, limpie los sustratos con acetona, alcohol isopropílico y agua desionizada, y séquelos con nitrógeno.</li>
</ol>6. Apertura de las áreas de detección del OCMFET para el registro de la actividad eléctrica y la formación de las vías para acceder a la parte posterior de los FG
<ol><li>Deposite la fotorresistencia sobre los sustratos utilizando los mismos parámetros de los pasos 4.1 y 4.2.</li>
	<li>Coloque el dispositivo en un bromógrafo y coloque la máscara fotolitográfica de plástico sobre el sustrato de las vías (aberturas circulares con un diámetro de 50 μm sobre las áreas de detección y aberturas de 100 x 100 μm2 sobre las FG lejos de las áreas de detección (denominadas contacto posterior de las CG en la Figura 1 y figura 2)) bajo un microscopio estereoscópico para mejorar la precisión de alineación. Exponer a la luz UV de la parte superior durante 1 min, y retirar con cuidado la mascarilla, teniendo cuidado de minimizar los movimientos laterales de la mascarilla sobre el sustrato para evitar rascarla. NOTA: Las vías en el lado de los FG lejos del área de detección (que se muestran como contacto posterior de los FG en la Figura 1 y la Figura 2) son necesarias para el contacto durante la caracterización del transistor. Además, tener acceso eléctrico a los FG puede ser muy útil para diferentes tipos de funcionalización (por ejemplo, electrodeposición).</li>
	<li>Desarrolle la fotorresistencia como se describió anteriormente en el paso 4.4. Exponga el sustrato con el fotorresistente estampado (que actúa como una máscara aquí) al plasma de oxígeno (180 s a 200 W) para eliminar el Parylene C de las áreas de detección. NOTA: La velocidad de grabado de Parylene C en un limpiador de plasma isotrópico a 200 W es de aproximadamente 90 nm / min. Se realiza un ligero sobregrabado para limpiar aún más las áreas de detección. La fotorresistente también se graba durante el proceso. Sin embargo, su espesor (2 μm) es muy superior al del Parileno C.</li>
	<li>Coloque los sustratos en un recipiente de vidrio lleno de acetona dentro del baño ultrasónico durante 10 s para eliminar la fotorresistente por completo. Enjuague los sustratos con acetona, alcohol isopropílico y agua y séquelos con nitrógeno. NOTA: El uso de sonicación en lugar de simplemente enjuagar los sustratos con acetona es crucial para evitar el plegamiento no deseado y la redeposición de fragmentos de parileno C en la superficie de las áreas de detección.</li>
</ol>7. Autoalineación de fuente y drenaje con el FG
<ol><li>Deposite la fotorresistencia sobre los sustratos utilizando los mismos parámetros de los pasos 4.1 y 4.2. Coloque el dispositivo en un bromógrafo y coloque sobre el sustrato una máscara fotolitográfica de plástico con rectángulos negros simples que cubran completamente las áreas del transistor. Exponer a la luz UV durante 1 min tanto desde la parte superior como inferior, y retirar con cuidado la mascarilla, teniendo cuidado de minimizar los movimientos laterales de la mascarilla sobre el sustrato para evitar rayarla. NOTA: Con la exposición de doble cara, los FG actúan como máscaras fotolitográficas con respecto a la exposición inferior, mientras que la presencia de la máscara superior garantiza que solo la fotorresistencia presente en el canal de los transistores permanezca sin exponer.</li>
	<li>Desarrolle la fotorresistencia como se describió anteriormente en el paso 4.4.</li>
</ol>8. Deposición de oro, formación de canales y modelado de las fuentes, drenajes y puertas de control
<ol><li>Limpie los sustratos con un suave tratamiento por plasma (30 s a 30 W) para promover la adhesión del metal sobre el Parylene C y colóquelos en el soporte del sustrato dentro de la cámara de vacío del evaporador térmico.</li>
	<li>Coloque 30 mg de oro en el crisol, cierre el obturador y bombee por la cámara de evaporación hasta que alcance 10-5 Torr. Aumente la potencia del evaporador hasta que el crisol brille en rojo y espere 30 s. Abra el obturador, aumente la potencia al 40% (o hasta que el crisol brille en blanco brillante), espere 60 s, cierre el obturador y baje la alimentación.</li>
	<li>Coloque los sustratos en un recipiente de acetona dentro del baño ultrasónico durante 10 s para despegar la fotorresistencia, eliminando así el oro del canal de los transistores. Enjuague los sustratos con acetona, alcohol isopropílico y agua y séquelos con nitrógeno. Deposite la fotorresistencia sobre los sustratos utilizando los mismos parámetros de los pasos 4.1 y 4.2.</li>
	<li>Coloque el dispositivo en un bromógrafo y coloque sobre el sustrato una máscara fotolitográfica de plástico con las fuentes, los desagües y el diseño de la puerta de control deseados. Exponer a la luz UV durante 1 min desde la parte superior, y retirar con cuidado la mascarilla, teniendo cuidado de minimizar los movimientos laterales de la mascarilla sobre el sustrato para evitar rascarla.</li>
	<li>Desarrolle la fotorresistente como se describe en el paso 4.4. Graba el oro expuesto sumergiéndolo en la solución de grabado de oro (paso 1.3) durante 10 s, enjuágalo con agua desionizada y sécalo con nitrógeno. Inspeccione ópticamente el sustrato y retire la fotorresistente con acetona. Enjuague con alcohol isopropílico y agua desionizada y séquelo con nitrógeno.</li>
</ol>9. Deposición y activación del parileno C para la detección de pH
<ol><li>Deposite la fotorresistencia sobre los sustratos utilizando los mismos parámetros de los pasos 4.1 y 4.2.</li>
	<li>Coloque el dispositivo en un bromógrafo y coloque sobre el sustrato una máscara fotolitográfica de plástico con aberturas correspondientes a las áreas de detección de pH de los OCMFET. Exponer a la luz UV durante 1 min desde la parte superior, y retirar con cuidado la mascarilla, teniendo cuidado de minimizar los movimientos laterales de la mascarilla sobre el sustrato para evitar rascarla.</li>
	<li>Desarrolle la fotorresistente como se describe en el paso 4.4. Proteja todo el dispositivo, excepto las áreas de detección de pH, con cinta aislante de poliimida (consulte la Tabla de materiales). Depositar una capa de 500 nm de parileno C (correspondiente a 1 g de dímero parileno C) sobre el sustrato utilizando los mismos parámetros descritos en el paso 5.1. NOTA: El espesor total de parileno C en las áreas de detección de pH es de 650 nm. No se requiere silano para esta deposición.</li>
	<li>Retire con cuidado la cinta aislante de poliimida. Exponga el sustrato al plasma de oxígeno (5 min y 30 s a 200 W) para activar el Parileno C en las áreas de detección de pH de los OCMFET. NOTA: La cinta aislante de poliimida es necesaria aquí para limitar la deposición de Parylene C. De hecho, un simple despegue utilizando la fotorresistente no da resultados positivos debido a la naturaleza casi libre de agujeros de ester del recubrimiento conformado obtenido con Parylene C.</li>
	<li>Coloque los sustratos en un recipiente de acetona dentro del baño ultrasónico durante 10 s para eliminar completamente la fotorresistente. Enjuague los sustratos con acetona y alcohol isopropílico (sin agua) y séquelos con nitrógeno.</li>
</ol>10. Deposición de semiconductores, colocación de la cámara de cultivo y corte final del dispositivo a partir del PET
<ol><li>Coloque los sustratos sobre una placa caliente a 50 °C. Vierta una gota (1 μL) de solución semiconductora (paso 1.4) en cada área del canal, cubra todo el sustrato con una tapa y déjelo secar debajo de una campana química durante 30 min.</li>
	<li>Prepare la cámara de cultivo imprimiendo un anillo de acrilonitrilo butadieno estireno con un radio interno de 15 mm, un grosor de 1 mm y una altura de 7 mm con una impresora 3D. Pegue la cámara de cultivo en la parte central del sustrato con polidimetilsiloxano (proporción del agente de curado: 15% en peso). Recorte el dispositivo del PET manualmente o con un cortador láser.</li>
</ol>11. Caracterización eléctrica de transistores
<ol><li>Caracterizar cada transistor utilizando un medidor de fuente18,19,20,21 (ver la Tabla de Materiales). NOTA: Tanto la salida como las características de entrada deben medirse para extrapolar los parámetros de los transistores (principalmente la movilidad de los portadores, el voltaje umbral, la relación ION/IOFF y la pendiente subumbral).</li>
</ol>

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<li>Spanu, A., Tedesco, M. T., Martines, L., Martinoia, S., Bonfiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organic+neurophysiological+tool+for+neuronal+metabolic+activity+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">An organic neurophysiological tool for neuronal metabolic activity monitoring.</a> APL Bioengineering. 2 (4), 046105(2018).</li>
<li>Díaz-García, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+stimulation+triggers+neuronal+glycolysis+and+not+lactate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Neuronal stimulation triggers neuronal glycolysis and not lactate uptake.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 361-374 (2017).</li>
<li>Xie, Y., Dengler, K., Zacharias, E., Wilffert, B., Tegtmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+sodium+channel+blocker+tetrodotoxin+%28TTX%29+on+cellular+ion+homeostasis+in+rat+brain+subjected+to+complete+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of the sodium channel blocker tetrodotoxin (TTX) on cellular ion homeostasis in rat brain subjected to complete ischemia.</a> Brain Research. 652 (2), 216-224 (1994).</li>
<li>Caboni, A., Orgiu, E., Barbaro, M., Bonfiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+organic+thin-film+transistors+for+pH+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Sensors+Journal%22%5BJournal%5D)">Flexible organic thin-film transistors for pH monitoring.</a> IEEE Sensors Journal. 9 (12), 1963-1970 (2009).</li>
<li>Fraboni, B., Bonfiglio, A., Basiricò, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+printing+of+transparent%2C+flexible%2C+organic+transistors%5BTitle%5D)+AND+%22Thin+Solid+Films%22%5BJournal%5D)">Inkjet printing of transparent, flexible, organic transistors.</a> Thin Solid Films. 520, 1291-1294 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

A diferencia de los métodos anteriores para la fabricación de OCMFET para aplicaciones celulares18,29, el método propuesto está diseñado específicamente para preparar MOA que puedan detectar simultáneamente la actividad celular eléctrica y metabólica. Además, este enfoque para lograr la sensibilidad del pH tiene la ventaja de ser compatible con los protocolos de fabricación estándar y no implica ninguna modificación química del área de detección (este aspecto garantiza la biocompatibilidad de todo el dispositivo). La sensibilidad al pH se logra utilizando el mismo material utilizado como dieléctrico de compuerta (es decir, el biocompatible Parylene C), lo que hace que este enfoque sea rápido y reproducible.
El resultado final de este enfoque es una herramienta orgánica flexible, transparente, de bajo costo y multidetección para aplicaciones celulares in vitro . El hecho de que esto se pueda obtener utilizando una sola estructura de transistor y una simple modificación física del área de detección se suma a las ventajas que ofrece el uso de materiales y métodos electrónicos orgánicos. Además, debido a que el principio de transducción del OCMFET no depende estrictamente del semiconductor específico o del material FG, todo el proceso puede modificarse y ampliarse según la aplicación específica.
Un aspecto crítico de la técnica propuesta está relacionado con la reproducibilidad de la técnica de activación por plasma. Para obtener resultados consistentes, tanto el espesor del parileno C como su velocidad de grabado deben ser controlados. La calibración frecuente del proceso de deposición de Parylene C y el limpiador de plasma son absolutamente necesarios. Otros aspectos críticos, que también contribuyen a la reproducibilidad del proceso, son el manejo cuidadoso del dispositivo y la deposición del semiconductor orgánico. Aquí se utilizó una técnica simple de lanzamiento de gotas, que intrínsecamente plantea limitaciones de reproducibilidad. Para minimizar esos problemas, como se describe en el paso 10.1 del protocolo, se debe usar la misma cantidad de solución semiconductora cada vez, y la evaporación del solvente debe estandarizarse tanto como sea posible. Mantener una temperatura constante usando una placa caliente y cubriendo el sustrato después de cada deposición de gotas ayudará a ralentizar el proceso de evaporación. Para minimizar aún más este problema, se podría cambiar la técnica de deposición (por ejemplo, utilizando un método de impresión de inyección de tinta)30.
Una limitación del protocolo propuesto se deriva de la naturaleza de la funcionalización del OCMFET para la detección del pH. La estabilidad de los sensores de pH se limita a unas pocas semanas26. Sin embargo, la ventana de estabilidad del enfoque propuesto es lo suficientemente grande como para cubrir los tiempos de incubación estándar necesarios para el crecimiento del cultivo neuronal (2-3 semanas). Se deben considerar otros tipos de funcionalización del área de detección para experimentos más largos. El protocolo de fabricación utiliza un contacto posterior dedicado, lo que permite el acceso eléctrico a los FG. Este contacto, que se deja flotando durante el funcionamiento normal del dispositivo, puede ser explotado para la caracterización eléctrica del dispositivo y la funcionalización de las áreas de detección utilizando diferentes técnicas (por ejemplo, electrodeposición).
Este procedimiento representa una forma conveniente de preparar un dispositivo de detección múltiple para aplicaciones celulares sin la necesidad de materiales expansivos o instalaciones de sala limpia. A pesar de las limitaciones de rendimiento y estabilidad debido al empleo de un semiconductor orgánico y la funcionalización física (no química) del área de detección, se podrían utilizar enfoques similares para preparar sensores y biosensores de bajo costo (y potencialmente desechables), mecánicamente flexibles y ópticamente transparentes, que pueden proporcionar a los investigadores en biología celular, ingeniería de tejidos y neurociencia nuevas herramientas especializadas para estudiar sistemas celulares in vitro.

El monitoreo in vivo de células electroactivas, como neuronas y cardiomiocitos, representa un enfoque válido y poderoso en aplicaciones de investigación fundamental para el cerebro humano, estudios de conectividad funcional, farmacología y toxicología. Las herramientas empleadas habitualmente para este tipo de estudios se basan principalmente en matrices de microelectrodos (AMUMA)1,2,3,4,5 y dispositivos de efecto de campo (FEDs) cada vez más eficientes y potentes6,7,8,9,10,11,12 . Estas dos familias de dispositivos permiten la monitorización y estimulación en tiempo real de la actividad eléctrica de neuronas y cardiomiocitos y suelen caracterizarse por su robustez, facilidad de uso y fiabilidad. Estas características hacen que los AMUMA y los FED sean el estándar de oro para aplicaciones electrofisiológicas, ya que actualmente se emplean para interactuar con cultivos celulares estándar, cortes cerebrales organotípicos y organoides tridimensionales13,14,15,16. A pesar de su uso generalizado y sus impresionantes características, los AMUMA y LOS FEDs presentan algunas limitaciones como el alto costo, la rigidez de los materiales y la presencia de un electrodo de referencia generalmente voluminoso, que debe colocarse en el entorno líquido de medición y es necesario para el correcto funcionamiento de los dispositivos.
Para explorar soluciones alternativas para la interfaz celular, se ha invertido mucho esfuerzo en la última década en el estudio de dispositivos electrónicos basados en materiales orgánicos y técnicas de fabricación innovadoras17. Entre los diversos dispositivos orgánicos estudiados para abordar las limitaciones antes mencionadas, recientemente se ha propuesto un transistor orgánico peculiar llamado OCMFET como una alternativa válida a los AMUMA y FEDs18. Además de las características estándar que ofrece la tecnología de electrónica orgánica, como materiales y técnicas de fabricación de bajo costo, propiedades mecánicas y químicas óptimas, transparencia óptica y biocompatibilidad, el OCMFET también ofrece una sensibilidad de carga ultra alta (debido a su estructura de doble puerta) sin la necesidad de un electrodo de referencia externo. Además, este sensor orgánico tiene la notable capacidad de detectar diferentes parámetros físicos/analitos, dependiendo de la funcionalización específica de su área de detección, que está separada del área del transistor19,20. Todas estas características pueden ser convenientemente explotadas para la adquisición de diferentes parámetros dentro de un cultivo celular. En particular, además de poder detectar la actividad eléctrica neuronal/cardíaca, también es posible explotar la sensibilidad de pH ultra alta que ofrece la peculiar estructura de doble puerta del OCMFET mediante el uso de una simple funcionalización física21 para monitorizar de forma fiable las ligeras variaciones locales de pH causadas por la actividad metabólica celular.
En la biodetección celular in vitro, el monitoreo de la actividad metabólica celular es un poderoso indicador del estado del cultivo y puede ser utilizado para evaluar la respuesta celular a diversos estímulos, como la administración de fármacos y la estimulación eléctrica22,23. Además, en el caso específico de las aplicaciones neuronales, el seguimiento tanto de las actividades eléctricas como metabólicas es de gran interés, particularmente en farmacología y toxicología24. Con la intención de abordar convenientemente los requisitos de la electrofisiología in vitro moderna y, al mismo tiempo, ofrecer todas las ventajas del OCMFET, recientemente se ha introducido un dispositivo llamado Micro OCMFET Array (MOA). El MOA es una matriz basada en OCMFET con áreas de detección especializadas diseñadas específicamente para la interfaz celular in vitro, lo que permite el análisis multiparamétrico de cultivos de células electrogénicas. En particular, dos canales MOA tienen áreas de detección más grandes para maximizar su sensibilidad y pueden funcionalizarse selectivamente para monitorear parámetros específicos de interés, como las variaciones de pH del medio de cultivo. Los otros OCMFET en la estructura actúan como sensores de actividad eléctrica extracelular. La Figura 1 muestra la estructura de un MOA de 16 canales. Esta capacidad, combinada con la ausencia de un electrodo de referencia externo, hace que el MOA sea una herramienta muy interesante para aplicaciones in vitro. Este trabajo presenta el protocolo de fabricación paso a paso de un MOA multidetección para la detección in vitro de las actividades eléctricas y metabólicas de neuronas y cardiomiocitos. La Figura 2 muestra los principales pasos de fabricación, los materiales utilizados y la estructura del dispositivo.

<table><tbody><tr><td>Metacrilato de 3-(trimetoxisilil)propilo,</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td>, impresora 3D 440159 <td></td></tr><tr><td>Makerbot Replicator 2x</td><td>Makerbot</td><td></td><td>https://www.makerbot.gr/. Precio estimado: 2k-3k euros.</td></tr><tr><td>Filamento</td><td></td><td></td><td></td>ABS</tr><tr><td></td><td>Anisole Sigma Aldrich 296295</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bromograph modelo Hellas</td><td>Bungard</td><td></td><td>https://www.bungard.de/. Precio estimado: 1k-2k euros.</td></tr><tr><td></td><td>Oro Vendedor</td><td></td><td></td>local</tr><tr><td>Ácido fluorhídrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695068</td><td></td></tr><tr><td>Yodo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>207772</td><td></td></tr><tr><td>Cinta</td><td></td><td></td> Kapton cinta <td>aislante de poliimida</td></tr><tr><td>Cortadora láser VLS2.30</td><td>Universal Laser Systems</td><td></td><td>https://www.ulsinc.com/it. Precio estimado: 20k euros.</td></tr><tr><td>Sistemas multicanal tarjeta de</td><td></td><td></td> adquisición <td>www.multichannelsystems.com</td></tr><tr><td>Pellets de NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Dímero de parileno C</td><td>SCS recubrimiento</td><td></td><td></td>de sistemas de recubrimiento</tr><tr><td>especiales PDMS Silgard 184</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>PDS 2010 LABCOATER 2 Sistema de deposición de parileno</td><td>Sistemas de recubrimiento</td><td></td> <td>especiales SCShttps://scscoatings.com/. Precio estimado: 50k euros</td></tr><tr><td>Película de PET orientada biaxialmente (espesor 0,25 mm)</td><td>Goodfellow</td><td>ES301450</td><td></td></tr><tr><td>Placas</td><td></td><td></td><td></td>de Petri</tr><tr><td>Limpiador de plasma Gambetti "Tucano"</td><td>Gambetti</td><td></td><td>https://www.gambetti.it/. Precio estimado: 20k euros.</td></tr><tr><td>Fotorresistencia positiva AZ1518</td><td>MicroChemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de potasio KI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221945</td><td></td></tr><tr><td>Source Meter 2636</td><td>Keithley</td><td></td><td>https://it.farnell.com/. Precio estimado: 18k euros</td></tr><tr><td>Unidad de hilado</td><td>Ossila</td><td></td><td>https://www.ossila.com/. Precio estimado: 2.5k euros.</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico SMZ745T</td><td>Nikon</td><td></td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. Precio estimado: 2k-3k euros.</td></tr><tr><td>Unidad evaporadora</td><td></td><td></td><td></td>térmica</tr><tr><td>TIPS pentaceno (6,13-Bis(triisopropilsililietinil)-pentaceno)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>716006</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de titanio</td><td>Goodfellow</td><td>TI005129</td><td></td></tr><tr><td>Baño ultrasónico</td><td>Falc Instruments</td><td></td><td>https://www.falcinstruments.it/. Precio estimado: 1k euros.</td></tr></tbody></table>

in vitro análisis celular multiparamétrico mediante matrices de transistores de efecto de campo moduladas por carga micro orgánica

In Vitro Multiparametric Cellular Analysis by Micro Organic Charge-modulated Field-effect Transistor Arrays

La electrofisiología moderna ha sido constantemente alimentada por el desarrollo paralelo de herramientas y materiales cada vez más sofisticados. A su vez, los descubrimientos en este campo han impulsado el progreso tecnológico en un proceso de ida y vuelta que finalmente determinó los impresionantes logros de los últimos 50 años. Sin embargo, los dispositivos más empleados utilizados para la interfaz celular (a saber, las matrices de microelectrodos y los dispositivos microelectrónicos basados en transistores) todavía presentan varias limitaciones, como el alto costo, la rigidez de los materiales y la presencia de un electrodo de referencia externo. Para superar parcialmente estos problemas, ha habido desarrollos en un nuevo campo científico llamado bioelectrónica orgánica, lo que resulta en ventajas como menor costo, materiales más convenientes y técnicas de fabricación innovadoras.
Durante la última década se han propuesto varios dispositivos orgánicos nuevos e interesantes para interactuar convenientemente con cultivos celulares. Este artículo presenta el protocolo para la fabricación de dispositivos para la interfaz celular basados en el transistor de efecto de campo modulado por carga orgánica (OCMFET). Estos dispositivos, llamados micro OCMFET arrays (MOAs), combinan las ventajas de la electrónica orgánica y las características peculiares del OCMFET para preparar herramientas transparentes, flexibles y sin referencia con las que es posible monitorear las actividades eléctricas y metabólicas de cardiomiocitos y neuronas in vitro, permitiendo así una evaluación multiparamétrica de modelos celulares electrogénicos.

El potencial del MOA se ha validado aquí tanto para los registros de actividad eléctrica como para el monitoreo de la actividad metabólica. La estimación precisa de las capacidades del dispositivo para detectar potenciales de acción extracelular se basó en una caracterización exhaustiva con cultivos de cardiomiocitos de rata (particularmente en cardiomiocitos primarios de rata medidos a los 8 días in vitro [DIV])18. La Figura 3A muestra un MOA completo con 16 OCMFET. El recuadro superior muestra un ejemplo de un cultivo de cardiomiocitos de rata confluente que se adhiere a la superficie del MOA. Para resaltar su salud, las células han sido inmunoteñidas para la proteína sarcomérica, tropomiosina, después de la sesión de grabación. El recuadro inferior muestra una sola señal de cardiomiocitos medida con un OCMFET.
Curiosamente, el dispositivo podría detectar la actividad eléctrica espontánea y la actividad inducida por la administración de diferentes productos químicos, como se muestra en la Figura 3B. Esta validación fue crucial para demostrar la viabilidad de utilizar este enfoque para la interfaz de células electrogénicas. Debido a la configuración de la matriz, el MOA también permitió la reconstrucción de la velocidad de propagación de la señal cardíaca, demostrando así la idoneidad del sistema para el estudio de las redes celulares (Figura 3C). Para una mayor validación para determinar el límite de detección real del dispositivo, el MOA también se probó con neuronas estriatales (21 DIV)18, con resultados interesantes en términos de amplitud de señal y la fiabilidad de las grabaciones. Como se ve en la Figura 3D, el OCMFET podría amplificar los potenciales del campo neuronal con una estabilidad notable, mostrando relaciones señal-ruido (SNRS) de hasta 3,2 (en el mismo rango que el de los SNR obtenidos con MEAs estándar25). La configuración de grabación consistió en electrónica multicanal personalizada para el sesgo del transistor y la lectura y acondicionamiento de la señal. Cada canal para la grabación eléctrica tiene una primera etapa que consiste en un convertidor de I / V con una resistencia de retroalimentación de 1 MΩ y un filtro de paso de banda de 150 Hz-1.3 kHz con una ganancia de voltaje de 110. Para todas las mediciones presentadas, los transistores estaban sesgados con VDS = VGS = -1 V. La conversión A/D y la visualización y almacenamiento de datos se realizaron utilizando un tablero de adquisición de datos (ver la Tabla de Materiales). Todas las sesiones de medición se llevaron a cabo dentro de una jaula de Faraday para minimizar el ruido eléctrico y ambiental en el sistema.
Como se mencionó anteriormente, al explotar la funcionalización física simple presentada en el protocolo, fue posible preparar sensores de pH altamente sensibles con una respuesta supernernstiana. Debido al enfoque de fabricación presentado, estos dispositivos de pH podrían integrarse en un MOA y utilizarse para monitorizar las ligeras variaciones de pH inducidas por la actividad metabólica de las neuronas primarias de ratas del hipocampo26. En particular, como se muestra en la Figura 4, sólo uno de los dos OCMFET dedicados a la detección de baja frecuencia se funcionalizó selectivamente para demostrar la viabilidad del enfoque. Esta funcionalización selectiva permitió evaluar la respuesta de los dos OCMFET a las variaciones metabólicas inducidas químicamente: en particular, se puede obtener un estado metabólico alto utilizando bicucullina (BIC), un inhibidor de los receptores GABA A27, mientras que un estado metabólico bajo puede ser inducido por la adición de tetrodotoxina (TTX), que eventualmente causa la muerte celular28 . La configuración de grabación consistió en la misma electrónica multicanal personalizada utilizada para las mediciones electrónicas de actividad.
A diferencia del caso anterior, se utilizaron dos canales dedicados para registrar las variaciones lentas inducidas por la actividad metabólica celular. Cada canal consistía en un circuito simple compuesto por dos bloques principales: un convertidor de I / V con una resistencia de retroalimentación de 1 MΩ y un filtro de paso bajo con una frecuencia de corte de 10 Hz. Los transistores estaban sesgados con VDS = VGS = -1 V, y todas las mediciones se llevaron a cabo dentro de una jaula de Faraday para minimizar el impacto del ruido externo en las grabaciones (este es un aspecto particularmente importante teniendo en cuenta las bajas fluctuaciones de corriente inducidas por la actividad metabólica celular). Durante los experimentos, los cultivos se mantuvieron en un medio de cultivo de bajo amortiguamiento, y todo el sistema se colocó en un ambiente controlado (37 ° C y un flujo continuo de CO2 / aire). Como era de esperar, solo la corriente del OCMFET sensible al pH podría modularse mediante la adición de 25 μM BIC. Esto se confirmó aún más por la inducción de la variación actual por la variación correspondiente de la actividad metabólica celular.
El mismo experimento se repitió después de la adición de 10 μM TTX, lo que resultó en una desaceleración gradual del metabolismo celular. Después de la adición del TTX, ni el OCMFET sensible al pH ni el insensible al pH mostraron respuesta alguna, lo que demuestra la eficacia del enfoque. Estos resultados demuestran la efectividad de la funcionalización propuesta y su relativa estabilidad hasta por 2 semanas. Una conclusión importante que se puede extraer de los experimentos propuestos (tanto la actividad eléctrica como la actividad metabólica) es que es posible preparar diferentes tipos de sensores mediante la funcionalización selectiva de diferentes OCMFET dentro de la misma área de cultivo. Este aspecto representa un logro no trivial en biodetección para aplicaciones celulares porque poder monitorear diferentes parámetros dentro de un mismo cultivo celular es crucial para una mejor caracterización de la complejidad de esos sistemas biológicos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62907/62907fig01.jpg"> Figura 1: Vista superior de un MOA de 16 canales para el monitoreo metabólico y eléctrico de células electroactivas. Barra de escala = 1 cm. Abreviaturas: OCMFETs = transistores orgánicos de efecto de campo modulado por carga; FG = puerta flotante; S/D = fuente/drenaje; MOA = matriz micro OCMFET. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62907/62907fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62907/62907fig02.jpg"> Figura 2: Principales pasos de fabricación de un MOA para el monitoreo metabólico y eléctrico de células electroactivas. (A y B) La película de Ti evaporada se modela utilizando un proceso fotolitográfico estándar para preparar la compuerta flotante de los OCMFET. (C) Deposición de 15 nm de Parylene C. Esta capa, junto con el óxido de Ti nativo, actúa como el dieléctrico de compuerta de los transistores. (D y E) La capa de parileno C se modela mediante tratamiento con oxígeno por plasma. Se utiliza una capa fotorresistente estampada para exponer selectivamente las áreas de detección para las grabaciones eléctricas y los contactos posteriores de la puerta flotante. (F) Modelado de los contactos superiores Au, es decir, la fuente, el drenaje, la puerta de control y el contacto posterior de la puerta flotante. Se utiliza una técnica de autoalineación para mejorar el rendimiento eléctrico del dispositivo. (G-I) Deposición de la segunda capa de parileno C en el área de detección de los OCMFET para el monitoreo de la actividad metabólica. Después de la exposición al plasma de oxígeno, esta capa actuará como la membrana sensible al pH (J). (K) Sección transversal de un MOA completo (con materiales) después de la deposición del semiconductor orgánico (PENTACENO TIPS) y el posicionamiento de la cámara de cultivo. Abreviaturas: OCMFETs = transistores orgánicos de efecto de campo modulado por carga; FG = puerta flotante; S/D = fuente/drenaje; MOA = matriz micro OCMFET; CG = puerta de control; PET = tereftalato de polietileno; Par C = Parileno C; TIPS = 6,13-bis(triisopropilsililetil) pentaceno; ABS = acrilonitrilo butadieno estireno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62907/62907fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62907/62907fig03.jpg"> Figura 3: Registros de actividad eléctrica celular con un MOA. (A) Un cultivo confluente de cardiomiocitos de rata (8 DIV) adheridos a la superficie de un MOA, fijados después de una sesión de registro e inmunoteñidos para la proteína sarcomérica, tropomiosina (recuadro superior). Recuadro inferior: ejemplo de una sola señal de cardiomiocitos medida con un OCMFET. Barra de escala = 150 μm. (B) Ajuste químico de la actividad eléctrica de un cultivo de cardiomiocitos. La aceleración de la actividad resultó de la adición de 100 mM de norepinefrina, mientras que la supresión resultó de la adición de 100 mM de verapamilo. Izquierda: modulación de frecuencia de latido; derecha: estadísticas sobre 5 OCMFETs-media y desviación estándar: recuento de picos en 4 min de actividad basal (129 ± 4.6), mediada por norepinefrina (280 ± 28.6) y mediada por verapamilo (15 ± 1.9). (C) Reconstrucción de la propagación de una señal cardíaca. Derecha: gráfico ráster de la actividad espontánea del cultivo que indica la propagación de la señal desde el sitio 14 hasta el sitio 41 (derecha). (D) Potenciales de acción de células estriatales de embrión de rata (21 DIV). Esta cifra ha sido modificada de 18. Abreviaturas: OCMFET = transistor de efecto de campo modulado por carga orgánica; MOA = matriz micro OCMFET; NE = norepinefrina; VER = verapamilo; DIV = días in vitro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62907/62907fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62907/62907fig04.jpg"> Figura 4: Registros de actividad metabólica con un MOA. Respuesta de los canales (A) sensibles al pH y (B) insensibles al pH de un MOA a la adición de 25 μM BIC antes y después de la adición de 10 μM de TTX. Después de la adición de TTX, el comportamiento del canal sensible al pH se vuelve similar al del canal insensible al pH. En particular, no se puede observar ninguna variación de corriente después de la adición de BIC debido a la muerte celular inducida por TTX. (C) MOA para registros de actividad metabólica. Los OCMFET sensibles al pH y los INSENSIBLES al pH se delinean en verde y rojo, respectivamente. Recuadro: neuronas sanas del hipocampo cultivadas en el dispositivo después de 15 DIV. Barra de escala = 50 μm. Esta cifra ha sido modificada de 26. Abreviaturas: OCMFET = transistor de efecto de campo modulado por carga orgánica; MOA = matriz micro OCMFET; BIC = bicucullina; TTX = tetrodotoxina; DIV = días in vitro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62907/62907fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, presentamos el protocolo de fabricación de un dispositivo basado en transistor de efecto de campo modulado por carga orgánica (OCMFET) para la interfaz celular in vitro . El dispositivo, llamado matriz micro OCMFET, es un dispositivo flexible, de bajo costo y sin referencias, que permitirá el monitoreo de las actividades eléctricas y metabólicas de los cultivos celulares electroactivos.

In vitro Análisis celular multiparamétrico mediante matrices de transistores de efecto de campo moduladas por carga micro orgánica

Modern electrophysiology has been constantly fueled by the parallel development of increasingly sophisticated tools and materials. In turn, discoveries in ...

Este método proporciona una solución original para el análisis celular, un campo que actualmente carece de sistemas de registro adecuados que sean multiparamétricos, biocompatibles, mecánicamente compatibles y, finalmente, de bajo costo. Con este método, es posible obtener sistemas de detección con diferentes capacidades de detección, como la capacidad de monitorear tanto la actividad eléctrica como la metabólica de las células utilizando un solo tipo de dispositivo orgánico electrónico. Además de ayudar a reducir la experimentación in vivo con animales, los sistemas multiparamétricos in vitro son una herramienta extremadamente prometedora en una variedad de campos biomédicos, como la medicina personalizada y los estudios sobre enfermedades neurodegenerativas.Todo en la alta versatilidad de la carga orgánica, transistor de efecto de campo modulador, también es posible integrar otros sensores, como por ejemplo, sensores para la detección de volúmenes de diferentes biomarcadores. Corte piezas de 6 por 6 centímetros cuadrados de una nueva lámina de PET de 250 micrómetros, luego enjuague los sustratos de PET con acetona, alcohol isopropílico y agua desionizada. Séquelos con corrientes y nitrógeno, y guárdelos en placas de Petri de plástico limpias.Para la deposición de titanio, limpie previamente los sustratos con oxígeno plasmático y colóquelos en el soporte del sustrato dentro de la cámara de la trastienda del evaporador térmico. A continuación, coloque 60 miligramos de titanio en el crisol, cierre el obturador y bombee por la cámara de evaporación hasta que alcance 10 a 6 recorridos. Aumente la potencia del evaporador hasta que el crisol brille en rojo y espere 30 segundos.Luego, abra el obturador, aumente la potencia al 60% y espere 60 segundos. Después de 60 segundos, cierre el obturador y baje la alimentación. Para el estampado, coloque un sustrato a la vez en el Spin Coater colocado dentro de una campana de humos.Utilizando una pipeta de plástico desechable, deposite cuatro mililitros de fotorresistencia sobre el sustrato para obtener una capa fotorresistente de dos micrómetros de espesor utilizando los parámetros de recubrimiento de espín mencionados en el manuscrito de texto. Hornea suavemente la fotorresistente colocando el sustrato en una placa caliente y luego almacena el sustrato dentro de una placa de Petri envuelta en papel de aluminio o un recipiente de plástico. A continuación, coloque el sustrato en un gráfico brahma y coloque la máscara fotolitográfica de plástico, pero el diseño de puerta flotante deseado sobre el sustrato, exponga la máscara a la luz UV desde la parte superior durante un minuto.Luego retire cuidadosamente la máscara, teniendo cuidado de minimizar los movimientos laterales de la máscara sobre el sustrato, sumerja el sustrato durante 10 segundos en un recipiente de vidrio lleno de la solución en desarrollo. Luego enjuáguelo rápidamente en agua desionizada, grabe el titanio expuesto sumergiéndolo en la solución de grabado de titanio durante 15 segundos, luego enjuague con agua desionizada y seque con nitrógeno. Ópticamente, inspeccione el sustrato y retire la resistencia fotográfica con acetona.Luego enjuague el sustrato con alcohol isopropílico y agua desionizada y séquelo con nitrógeno. Para la deposición dieléctrica de compuerta, coloque 300 miligramos de dímero Parylene C sobre el recubridor de parileno y establezca los valores de presión. Después de la deposición, limpie los sustratos con acetona, alcohol isopropílico y agua desionizada y séquelos con nitrógeno como se demostró anteriormente.Después de depositar la fotorresistencia sobre el sustrato como se demostró anteriormente, coloque el sustrato en un bromógrafo y coloque la máscara fotolitográfica de plástico sobre el sustrato para el sesgo bajo un microscopio estereoscópico. Después de una exposición UV de un minuto desde la parte superior, con cuidado, retire la máscara como se demostró anteriormente. Desarrolle la fotorresistencia como se demostró anteriormente, luego exponga el sustrato con la fotorresistencia estampada al plasma de oxígeno para eliminar el parileno C de las áreas de detección.Coloque los sustratos en un recipiente de vidrio lleno de acetona dentro del baño ultrasónico durante 10 segundos para eliminar la resistencia fotográfica por completo, luego enjuague los sustratos con acetona, alcohol isopropílico y agua y séquelos con nitrógeno como se demostró anteriormente. Después de depositar la fotorresistencia sobre el sustrato, como se demostró anteriormente, coloque el sustrato en un burmógrafo y coloque sobre el sustrato una máscara fotolitográfica de plástico con rectángulos negros simples, que cubra completamente las áreas de los transistores. Después de una exposición de un minuto a la luz UV de la parte superior e inferior con cuidado, retire la máscara y desarrolle la resistencia fotográfica, como se demostró anteriormente.Limpie los sustratos con el suave tratamiento de plasma para promover la adhesión del metal en el parileno C y luego colóquelos en el soporte del sustrato dentro de la cámara de vacío del evaporador térmico. Coloque 30 miligramos de oro en el crisol, cierre el obturador y bombee por la cámara de evaporación hasta que alcance de 10 a menos cinco Tor. Aumente la potencia del evaporador hasta que el crisol brille en rojo y espere 30 segundos.Abra el obturador, aumente la potencia al 40% y espere 60 segundos. Luego cierre el obturador y baje la alimentación. Coloque los sustratos en un recipiente de acetona dentro del baño ultrasónico durante 10 segundos para despegar la resistencia fotográfica y eliminar así el oro del canal de los transistores.Enjuague, seque y deposite la fotorresistencia sobre los sustratos como se demostró anteriormente. Después de colocar el sustrato en un bromógrafo, coloque sobre el sustrato una máscara fotolitográfica de plástico con las fuentes deseadas, los desagües y el diseño de la puerta de control. Después de una exposición UV de un minuto desde la parte superior, retire cuidadosamente la máscara y desarrolle la resistencia fotográfica como se demostró anteriormente.Graba el oro expuesto sumergiéndolo en la solución de grabado de oro durante 10 segundos, luego enjuaga con agua desionizada y sécalo con nitrógeno como se ha demostrado. Después de inspeccionar ópticamente el sustrato, retire la fotorresistencia con acetona, enjuague con alcohol isopropílico y agua desionizada y seque con nitrógeno. Después de depositar la fotorresistencia sobre el sustrato, coloque, el sustrato y un Bromógrafo en posición sobre el sustrato una máscara fotolitográfica de plástico con aberturas correspondientes a las áreas de detección de pH del OCMFET.Después de una exposición UV de un minuto desde la parte superior, retire cuidadosamente la máscara como se demostró anteriormente. Desarrolle la fotorresistencia como se demostró anteriormente, luego proteja todo el dispositivo excepto las áreas de detección de pH con cinta aislante de poliimida y deposite una capa de 500 nanómetros de parileno C sobre el sustrato utilizando los parámetros mencionados en el manuscrito de texto. Después de retirar cuidadosamente la cinta aislante de poliamida, exponga el sustrato al plasma de oxígeno para activar el parileno C en las áreas de detección de pH de los OCMFET.Luego, coloque los sustratos en un recipiente de acetona dentro del baño ultrasónico durante 10 segundos para eliminar completamente la resistencia fotográfica. Enjuague los sustratos con acetona y alcohol isopropílico y séquelos con nitrógeno. Coloque los sustratos en una placa caliente a 50 grados Celsius antes de fundir una gota de un microlitro de solución semiconductora en cada área del canal.Cubra todo el sustrato con la tapa y séquelo bajo una campana química durante 30 minutos. Recorte el dispositivo del PET, ya sea manualmente o usando un cortador láser. Un cultivo confluente de cardiomiocitos de rata adheridos a la superficie de un MOA fue inmunoestado para la proteína sarcomérica tropomiosina.Aquí se muestra un ejemplo de una sola señal de cardiomiocitos medida con un OCMFET. El dispositivo podría detectar tanto la actividad eléctrica celular espontánea como la actividad inducida por la administración de diferentes productos químicos o medicamentos. Gracias a la configuración de la matriz del MOA, se trataba de estimar la velocidad de propagación de la señal cardíaca dentro del cultivo celular.El OCMFET también fue capaz de amplificar los potenciales del campo neuronal con una estabilidad notable y una buena relación señal-ruido. Las diferentes respuestas de un canal sensible al pH e insensible al pH de un MOA a la estimulación química con bicucullina y tetrodotoxina demostraron la capacidad del dispositivo para discriminar entre diferentes estados metabólicos celulares. Inspeccione cuidadosamente el sustrato antes de cada paso del protocolo de fabricación.Esto aumentará dramáticamente el rendimiento del proceso. Mediante el uso de diferentes métodos de funcionalización, es posible obtener sensores químicos y físicos que se pueden utilizar en aplicaciones como laboratorio en un chip y piel robótica.

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Bioengineering

Bioingeniería

Un método combinatorio cribado funcional para obtener ideas sobre los impactos de la composición molecular de los microambientes sobre las funciones celulares se describe. El método aprovecha existentes basados ​​en las tecnologías de microarrays para generar matrices de microambientes definidos combinatorias que soportan la adhesión de células y análisis funcional.

Fabricación y uso de microarrays microambiente (MEArrays)

Hemos desarrollado un cultivo de células automatizado y la plataforma de interrogación para experimentos de estimulación de células micro-escala. La plataforma ofrece un control sencillo, versátil y precisa en el cultivo y estimular las pequeñas poblaciones de células, y la recuperación de lisados ​​de análisis moleculares. La plataforma se adapta bien a los estudios que utilizan las células preciosos y / o reactivos.

Una plataforma automatizada versátil para Micro escala experimentos de estimulación celular

Este protocolo revisa eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección, un método para registrar y analizar el espectro de impedancia de las células adherentes para la cuantificación de la unión celular, la proliferación, motilidad, y las respuestas celulares a estímulos farmacológicos y tóxicos. La detección de la permeabilidad endotelial y la evaluación de los contactos célula-célula y célula-sustrato que se obtienen.

Eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección para la cuantificación de la proliferación endotelial, la función de barrera, y la motilidad

Se han desarrollado muchos dispositivos microfluídicos para su uso en el estudio de la electrotaxis. Sin embargo, ninguno de estos chips permite el estudio eficiente de los efectos simultáneos del campo químico y eléctrico (FE) en las células. Desarrollamos un dispositivo basado en polimetilmetacrilato que ofrece una FE coexistente mejor controlada y estimulación química para su uso en la investigación de electrotaxis.

Estudios electrotaxis de pulmón células de cáncer utilizando un Multicanal Dual-campo eléctrico chip de microfluidos

Se describen protocolos para cuantificar las interacciones mecánicas entre las células adherentes y los sustratos microestructurados. Estas interacciones están estrechamente relacionadas con comportamientos celulares esenciales, como la migración, la proliferación, la diferenciación y la apoptosis. Los protocolos presentan un software de análisis de imágenes de código abierto llamado MechProfiler, que permite la determinación de las fuerzas involucradas para cada microposte.

Fácil y Precisa mecanoterapia perfiles en micropost Arrays

La diferenciación celular está regulada por una serie de factores microambientales, incluyendo tanto la composición de la matriz y de material de sustrato propiedades. Se describe aquí una técnica utilizando microarrays de células en combinación con microscopía de fuerza de tracción para evaluar tanto la diferenciación celular y las interacciones célula-sustrato biomecánicas como una función del contexto microambientales.

Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

Demostramos una tecnología de chip de complemento para realizar inmunoensayos sandwich multiplexados Cruz-reactivity-free simplemente chasquear dos diapositivas. Un aparato de presión se utiliza para transferir confiablemente reactivos de microarray de microarrays. El chip del broche de presión puede utilizarse reacciones bioquímicas que requieren colocalización de diferentes reactivos sin contaminación cruzada.

Rápido Chip para Cruz-reactivity-libre y observador de tiro multiplexado inmunoensayos de Sandwich

Este protocolo describe una estrategia general para regenerar comerciales microelectrodos de oro vestidas para un analizador de célula libre de etiqueta para ahorro en los alta ejecución costos ofmicrochip-ensayos. El proceso de regeneración incluye la digestión de la tripsina, enjuague con agua y etanol y un paso de giro, que permite el uso repetido de los microchips.

Regeneración de microelectrodos de oro vestidas para un analizador en tiempo real de la célula

Este artículo describe la metodología detallada para preparar una matriz de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulación de alto rendimiento de física y química señales mímico en vivo microambientes celulares y a identificar el entorno celular óptimo para las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) con perfiles de unicelulares.

Fabricación de una Matriz microambiente celular Artificial multiplexados

El propósito del método presentado aquí es mostrar cómo los microarrays de microambiente (MEMA) pueden ser fabricados y utilizados para interrogar el impacto de miles de microambientes combinatorios simples en el fenotipo de las células cultivadas.

Uso de microarrays para interrogar el impacto microambiental en fenotipos celulares en cáncer

El ensayo de micronúcleos in vitro es un método bien establecido para evaluar la genotoxicidad y la citotoxicidad, pero la puntuación del ensayo mediante microscopía manual es laboriosa y sufre de subjetividad y variabilidad entre marcadores. Este documento describe el protocolo desarrollado para realizar una versión totalmente automatizada del ensayo utilizando citometría de flujo de imágenes multiespectral.

Un método automatizado para realizar el ensayo de micronúcleos In Vitro mediante citometría de flujo de imágenes multiespectral

Aprende a fabricar matrices micro OCMFET para análisis celular multiparamétrico in vitro. Este dispositivo flexible y de bajo costo permite monitorear actividades eléctricas y metabólicas en cultivos celulares electroactivos.

In vitro Análisis celular multiparamétrico mediante matrices de transistores de efecto de campo moduladas por carga micro orgánica (Video) | JoVE Journal

In vitro Análisis celular multiparamétrico mediante matrices de transistores de efecto de campo moduladas por carga micro orgánica

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