Name: Desarrollo de un modelo de cocultivo celular para imitar la isquemia/reperfusión cardíaca in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprende a desarrollar un modelo de cocultivo celular para estudiar la isquemia/reperfusión cardíaca in vitro. Este método permite evaluar el efecto protector de las células endoteliales sobre los cardiomiocitos.

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Este trabajo fue apoyado, en parte, por el Servicio de I + D del Laboratorio Biomédico del Departamento de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos (I01 BX003482) y por fondos institucionales a M.L.R.

1. Preparación/emplatado experimental
<ol><li>Mantenga los CM y ECs de acuerdo con las instrucciones del fabricante.<ol>
<li>Descongele ambas líneas celulares cuando lleguen de los vendedores. Placa en matraces T25 después de ser lavada con medios frescos. Se recomienda comprar cada medio de cultivo celular de los mismos proveedores a los que se compraron las células. Al día siguiente, actualice las celdas con medios y úselos cuando sean confluentes.</li>
		<li>Mantener la incubadora de cultivo celular a 37 °C con 21% O2, 5% CO2, 74% N2 y mantenerla humidificada. NOTA: Las células endoteliales de la arteria coronaria primaria del ratón utilizadas en este protocolo se aíslan de las arterias coronarias de ratones C57BL/6, y los cardiomiocitos de ratón adultos se aíslan de corazones de ratón adultos C57BL/6J y se obtienen comercialmente (ver Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placas CM en condiciones estériles en el fondo de placas de 24 pocillos (capa inferior). 24 h más tarde, placa eCs en el inserto (o porción superior) del pozo de co-cultivo. 24 h después del recubrimiento EC, coloque los insertos EC sobre las bases de la placa CM, comenzando el período de cocultivo. Permita que las células se coculten durante al menos 12-24 h antes de su uso. Estos pasos se describen en detalle a continuación.<ol>
<li>Estimar la confluencia de la línea celular CM bajo un microscopio de luz. Cuando las células parezcan ser 90% -100% confluentes en matraces de cultivo, proceda con el recubrimiento experimental.</li>
		<li>Retire los medios de los matraces que contienen cultivos celulares confluentes y tripsinize con 3-5 ml de ácido tripsina/etilendiaminotetraacético (EDTA) para los matraces T25. Agite el matraz suavemente, incube a 37 ° C durante 2-5 min y luego evalúe el progreso enzimático bajo un microscopio de luz. Una vez que las celdas comiencen a redondearse, use un raspador de celdas para separar las celdas de la superficie.</li>
		<li>Después del desprendimiento, inactive la solución de tripsina agregando la solución de tripsina/célula a un tubo de 50 ml que contenga 10 ml de medios para los matraces T25. Centrifugar la suspensión celular a 120 x g durante 2 min para obtener un pellet de células blandas. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 5 ml de medios.</li>
		<li>Para realizar el conteo celular y confirmar la viabilidad celular, mezcle una alícuota de 10 μL de células resuspendidas y 10 μL de colorante azul tripano. Cuente las células vivas usando un contador de células. Diluya las células con medios regulares frescos para lograr las densidades de siembra deseadas. Los volúmenes se calculan en función de la densidad de semillas deseada y la concentración celular de las soluciones madre. Todo el recubrimiento debe realizarse en condiciones estériles.</li>
		<li>Placas CM a densidades de siembra de 300,000 por pozo en el fondo de una placa de 24 pocillos pre-recubierta con matriz extracelular. Mantenga las células a 37 °C con 21% de O2 y 5% de CO2 durante la noche.</li>
		<li>Después de 24 h, las CE de placa se insertan a una densidad óptima de chapado de 100.000 por inserto (el área de cultivo es de 33,6 mm2), (Figura 1). Después de 24 h de recubrimiento EC, coloque insertos EC dentro de los pozos CM, iniciando el cocultivo. Permita que las células coculten durante 12-24 h antes de realizar los experimentos.</li>
		<li>Asegúrese de que, para cuando se realicen los experimentos, tanto los CM como los CE hayan alcanzado una confluencia del 80% al 90%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Hipoxia/reoxigenación para simular lesión por isquemia/reperfusión in vitro
NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse como se describe, no se detenga en el medio.
<ol><li>Prepare los medios hipóxicos vertiendo ~ 25 ml de medios en un tubo cónico de 50 ml. Selle al aire la parte superior con una membrana de silicona y use una pipeta esterilizada para perforar un agujero. Cree otro agujero, esta vez dejando la pipeta sumergida aproximadamente 2/3 en el medio.</li>
	<li>Enjuague el medio con gas hipóxico (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99% N2) durante 5 min a un caudal de 30 L/min. Esto minimiza el O2 disuelto en el medio cuando comienza la hipoxia (paso 2.5).</li>
	<li>Deseche los medios de las placas de 24 pocillos o insertos de cultivo que contienen células adheridas y lave con 100 μL/pocillo de solución salina tamponada con fosfato al 10% (PBS) muy suavemente. Después, agregue 500 μL de los medios hipóxicos recién preparados a cada pocillo de las placas o insertos. NOTA: La hipoxia en los medios se interrumpe lo más brevemente posible durante este paso antes de que comience la hipoxia verdadera para las células y los medios en el paso 2.5.<ol>
<li>En el grupo de control normóxico, reemplace el medio original con medios normales frescos que contengan glucosa y suero.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Humidifique la cámara de hipoxia colocando una placa de Petri llena de agua estéril dentro de la cámara. A continuación, coloque las placas que comprenden los grupos hipóxicos en la cámara.</li>
	<li>Enjuague la cámara de hipoxia con gas hipóxico (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99% N2) durante 5 min a un caudal de 30 L/min. Coloque la cámara en la incubadora de 37 °C durante 24 h.</li>
	<li>Después de la hipoxia, cultive CM y CE en condiciones normales. Para ello, deseche el medio viejo de las placas/insertos, reemplácelo por medio normal (que contenga glucosa y suero; 500 μL de cada pocillo/inserto) y guárdelo en la incubadora en condiciones normales de cultivo (21% O2, 5% CO2, 74% N2, 37 °C) durante 2 h para imitar la reperfusión.</li>
	<li>Para controlar cualquier efecto del reemplazo de medios, cambie los medios de las células normóxicas al mismo tiempo que se cambian los medios hipóxicos. Nota : la figura 2 proporciona una descripción general esquemática de este protocolo.</li>
</ol>3. Evaluación de endpoints
<ol><li>Transfiera los medios de cultivo celular de la placa de 24 pocillos a una placa de 96 pocillos. Use 200 μL de medios de cada pozo de la placa de 24 pocillos y distribuya equitativamente en cuatro pozos de la placa de 96 pocillos, en consecuencia. Use una placa cada una para normoxia versus hipoxia versus HR.</li>
	<li>Determine el grado de lesión celular, por ejemplo, midiendo la absorbancia de la LDH utilizando un kit de ensayo de citotoxicidad siguiendo las instrucciones del fabricante. Realice el ensayo en una placa de 96 pocillos según las instrucciones del protocolo de ensayo.</li>
</ol>4. Estadísticas
<ol><li>Muestre los datos paramétricos como media/desviación estándar y los datos no paramétricos como gráficos de caja con rango mediano/intercuartílico. Se deben realizar pruebas de comparaciones múltiples paramétricas versus no paramétricas adecuadas con pruebas post-hoc aceptables para disminuir la posibilidad de un error de tipo 1. La significación se establece típicamente en un alfa de 0.05 (dos colas).</li>
	<li>Para todos los experimentos llevados a cabo en el estudio actual, realice al menos tres réplicas de pozos dentro de un experimento. Hubo de tres a seis repeticiones de cada experimento utilizado para el análisis estadístico.</li>
</ol>

<ol><li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury%3A+a+30+year+voyage+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).</li>
<li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+ischemia-reperfusion+injury%3A+a+neglected+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li>
<li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+pathways+in+acute+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li>
<li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li>
<li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cell-cell+communication+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li>
<li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Research+%26+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research & Perspectives. 8 (6), 00639(2020).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li>
<li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li>
<li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li>
<li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661(2011).</li>
<li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711(2012).</li>
<li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li>
<li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-a-chip%3A+a+focus+on+compartmentalized+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li>
<li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661(2011).</li>
<li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Pasos críticos en el protocolo Se han utilizado modelos de cocultivo celular para estudiar los mecanismos celulares de cardioprotección. Cómo crear dos capas separadas con una distancia significativa entre ellas es, por lo tanto, crucial para el desarrollo de un modelo de co-cultura adecuado. Un desafío en el estudio de la lesión por IR simulada, es decir, la FC, es que no solo la isquemia (hipoxia) en sí, sino también la reperfusión (reoxigenación) agrava la disfunción celular. Por lo tanto, un model...

La cardiopatía isquémica es la principal causa de muerte y discapacidad en todo el mundo 1,2. Sin embargo, el proceso de tratamiento de la reperfusión puede causar la muerte de los cardiomiocitos, conocida como lesión por isquemia/reperfusión (IR) miocárdica, para la cual todavía no existe un remedio efectivo3. Se ha sugerido que las células endoteliales (CE) protegen los cardiomiocitos (CM) a través de la secreción de señales paracrinas, así como las interacciones de célula a célula4.
Los modelos de cocultivo celular se han utilizado ampliamente para investigar el papel de las interacciones célula-célula autocrina y /o paracrina en la función y diferenciación celular. Entre los modelos de cocultivo, el cocultivo mixto es el más simple, donde dos tipos diferentes de células están en contacto directo dentro de un solo compartimento de cultivo en una proporción celular deseada5. Sin embargo, los tratamientos separados entre tipos de células y el análisis posterior de un solo tipo de célula no son fácilmente factibles dada la población mixta.
Estudios previos indicaron que los insultos hipóxicos e isquémicos causan un daño significativo a la integridad de la membrana celular medido por la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH). Esta lesión empeora con la reoxigenación, imitando la lesión por reperfusión 6,7,8. El objetivo del protocolo actual era probar las hipótesis de que la presencia de CE puede atenuar la pérdida de CM en la membrana celular causada por hipoxia y reoxigenación (HR) y que el efecto protector de las CE puede optimizarse variando la distancia de contacto entre las dos líneas celulares. Por lo tanto, empleamos tres tipos de insertos de cultivo celular y células endoteliales de la arteria coronaria primaria del ratón y cardiomiocitos de ratón adulto. Los insertos, marcados por Corning, Merck Millipore y Greiner Bio-One, nos permitieron crear tres condiciones de diafonía de cultivo celular diferentes con distancias de línea intercelular de 0.5, 1.0 y 2.0 mm, respectivamente. Se enchaparon 100.000 CE por inserto en cada caso.
Además, para determinar si la densidad de LAS CE en el cocultivo contribuye a la atenuación de la lesión de la FC en este modelo, estudiamos la relación dosis-respuesta entre la concentración de CE y la liberación de LDH por los CM. Las CE se enchaparon en 25.000, 50.000 y 100.000 por inserto, respectivamente, en el inserto de 2,0 mm.
Este informe proporciona un enfoque paso a paso para que los investigadores utilicen este importante modelo a su favor.

<table><tbody><tr><td>Cardiomiocitos de ratón adulto (CMs)</td><td>Celprogen Inc</td><td>11041-14</td><td>Aislado de tejido cardíaco de ratón adulto C57BL/6J</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess II</td><td>Invitrogen</td><td>A27977</td><td>Recuento de células para el cálculo del número</td></tr><tr><td>de células Cabina de bioseguridad</td><td>Nuaire</td><td>NU425400</td><td>Campana estéril de cultivo</td></tr><tr><td>celular Medio de congelación de cultivo celular</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>6916</td><td>Se utiliza para la congelación de células para el almacenamiento a largo plazo de líneas celulares</td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo celular</td><td>Nuaire</td><td>Nu-5500</td><td>Para proporcionar condiciones de vida celular normales (21%O2, 5%COCO2, 74%N2, 37&deg; C, humidificado)</td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo celular Tanque de gas</td><td>A-L Gases comprimidos</td><td>UN1013</td><td>Gas necesario para la incubadora de cultivo celular&nbsp;</td></tr><tr><td>Insertos de cultivo celular A (0,5 mm)</td><td>Corning Inc</td><td>353095</td><td>utilizado para el cocultivo EC-CM</td></tr><tr><td>Insertos de cultivo celular B (1,0 mm)</td><td>Millicell Millipore</td><td>PIHP01250</td><td>utilizado para el cocultivo EC-CM</td></tr><tr><td>Insertos de cultivo celular C (2,0 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662640</td><td>Utilizado para el cocultivo EC-CM</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Anstel Enterprises Inc</td><td>4235</td><td>Para el recubrimiento y el paso de cultivos celulares</td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular CMs T25</td><td>Celprogen Inc</td><td>E11041-14</td><td>Utilizado para el cultivo regular de CMs, recubierto por el fabricante</td></tr><tr><td>CMs Medio de cultivo celular completo</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14S</td><td>CMs medio de cultivo completo CMs Medio de</td></tr><tr><td>cultivo celular CMs completo libre de fenol</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14PN</td><td>Medio de cultivo CMs sin rojo de fenol utilizado durante la medición de LDH</td></tr><tr><td>CMs Placas de cultivo celular 96 pozo</td><td>Celprogen Inc</td><td>E11041-14-96pozo</td><td>Utilizado para experimentos de medición de LDH, recubierto por el fabricante</td></tr><tr><td>CMs Medio de cultivo celular de hipoxia</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14GFPN</td><td>Cultivo celular de CMs en condiciones hipóxicas (sin glucosa ni suero)</td></tr><tr><td>Portaobjetos de la cámara de recuento de células Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Portaobjetos de recuento utilizados para el contador de células</td></tr><tr><td>Cyquant LDH Kit</td> <td>de citotoxicidadThermo Scientific&nbsp;</td><td>C20301</td><td>Kit de medición de LDH</td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular ECs T25</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB012935</td><td>Se utiliza para ECs de cultivo regular</td></tr><tr><td>ECs Medio de cultivo celular</td> completo <td>Cell Biologics Inc</td><td>M1168</td><td>ECs medio completo de cultivo ECs</td></tr> Medio de <tr><td>cultivo celular completo libre de fenol</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>M1168PF</td><td>ECs medio de cultivo sin rojo de fenol utilizado durante la medición de LDH</td></tr><tr><td>ECs Placas de cultivo celular de 96 pocillos</td><td>Fisher Scientific (Costar)</td><td>3370</td><td>Utilizado para experimentos de LDH medición</td></tr><tr><td>ECs Cultivo Solución de recubrimiento a base de gelatina</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>6950</td><td>Se utiliza para el recubrimiento de matraces y placas para ECs ECs</td></tr><tr><td>Hipoxia Medio de cultivo celular Cell</td><td>Biologics Inc</td><td>GPF1168</td> Cultivo celular de <td>ECs en condiciones hipóxicas (sin glucosa ni suero)</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35011CV</td><td>FBS-HI Aprobado por el USDA para cultivo y mantenimiento celular</td></tr><tr><td>Cámara de hipoxia</td><td>StemCell Technologies</td><td>27310</td><td>Para crear una condición hipóxica con un entorno de 0,01%O2</td></tr><tr><td>Medidor de flujo de cámara de hipoxia</td><td>StemCell Technologies</td><td>27311</td><td>Para conectar con el tanque de gas hipóxico para una velocidad de flujo de gas constante</td></tr><tr><td>Tanque de gas hipóxico (0.01%O2 cilindro)</td><td>A-L Gases comprimidos</td><td>UN1956</td><td>Se utiliza para lavar el medio hipóxico y la cámara (0.01%O2/5%CO2/94.99N2</td></tr><tr><td>)Microscopio&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>Para observar la condición de la célula</td></tr><tr><td>Células endoteliales de la arteria coronaria primaria del ratón (EC)</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>C57-6093</td><td>Aislado de la arteria coronaria de ratones C57BL/6</td></tr><tr><td>Tubos NUNC 15ML CONICL Fisher</td><td>Scientific</td><td>12565269</td><td>Para el proceso de cultivo celular, experimentos, preparación de soluciones, etc.</td></tr><tr><td>Tubos NUNC 50ML CONICL</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271</td><td>Para procesos de cultivo celular, experimentos, preparación de soluciones, etc.</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>Se utiliza para el lavado de células durante el cultivo o los experimentos</td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>BioTek Instrument</td><td>11120533</td><td>Lectura de placas colorimétricas o fluorométricas</td></tr><tr><td>Reacción 96 Bien Palte (transparente, sin tapa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565226</td><td>Se utiliza para la lectura de placas de medición de LDH</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA para CM</td><td>Celprogen Inc</td><td>T1509-014</td> 1 x Tripsina/EDTA <td>estéril filtrada y probada en cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>para ECs</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>6914/0619</td><td>0.25%, probado en cutura celular</td></tr></tbody></table>

desarrollo de un modelo de cocultivo celular para imitar la isquemia/reperfusión cardíaca in vitro

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

La cardiopatía isquémica es la principal causa de muerte y discapacidad en todo el mundo. La reperfusión causa lesiones adicionales más allá de la isquemia. Las células endoteliales (CE) pueden proteger a los cardiomiocitos (CM) de la lesión por reperfusión a través de las interacciones célula-célula. Los cocultivos pueden ayudar a investigar el papel de las interacciones célula-célula. Un cocultivo mixto es el enfoque más simple, pero es limitado ya que los tratamientos aislados y los análisis posteriores de tipos de células individuales no son factibles. Para investigar si las CE pueden atenuar el daño de las células CM dependiendo de la dosis y si esta protección puede optimizarse aún más variando la distancia de contacto entre las dos líneas celulares, utilizamos células endoteliales de la arteria coronaria primaria de ratón y cardiomiocitos de ratón adulto para probar tres tipos de insertos de cultivo celular que variaron en su distancia de capa intercelular a 0,5, 1,0 y 2,0 mm, respectivamente. Solo en los CM, la lesión celular evaluada por la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) aumentó significativamente durante la hipoxia y más adelante tras la reoxigenación cuando la distancia fue de 2,0 mm en comparación con 0,5 y 1,0 mm. Cuando los CE y los CM estaban en contacto casi directo (0,5 mm), solo hubo una atenuación leve de la lesión por reoxigenación de los CM después de la hipoxia. Esta atenuación aumentó significativamente cuando la distancia espacial fue de 1,0 mm. Con una distancia de 2,0 mm, las CE atenuaron la lesión de CM durante la hipoxia y la hipoxia / reoxigenación, lo que indica que es necesario un distanciamiento de cultivo suficiente para que las CE se diaguen con los CM, de modo que las moléculas de señal secretadas puedan circular y estimular completamente las vías protectoras. Nuestros hallazgos sugieren, por primera vez, que la optimización del entorno espacial de cocultivo CE/CM es necesaria para proporcionar un modelo in vitro favorable para probar el papel de las CE en la protección contra la CM contra la lesión simulada de isquemia/reperfusión. El objetivo de este informe es proporcionar un enfoque paso a paso para que los investigadores utilicen este importante modelo a su favor.

Los tres tipos de insertos (A, B, C) utilizados en este experimento tienen el mismo tamaño de poro de 0,4 μm. La única diferencia entre ellos es la altura de inserción a base, que permite que las distancias entre las dos capas de células cocultivadas sean de 0,5, 1,0 y 2,0 mm, respectivamente, (Figura 3) y que sean de diferentes proveedores (para más detalles, consulte la Tabla de materiales).
Para establecer un modelo de cocultivo in vitro</e...

La distancia espacial es un parámetro clave en la evaluación de la lesión por hipoxia/reoxigenación en un modelo de cocultivo de capas separadas de células endoteliales y cardiomiocitarias, lo que sugiere, por primera vez, que la optimización del entorno espacial de cocultivo es necesaria para proporcionar un modelo in vitro favorable para probar el papel de las células endoteliales en la protección de los cardiomiocitos.

Desarrollo de un modelo de cocultivo celular para imitar la isquemia/reperfusión cardíaca in vitro

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

Nuestro hallazgo sugiere que la optimización del entorno espacial de cocultivo de cardiomiocitos de células endoteliales es necesaria para proporcionar un modelo in vitro favorable para probar el papel de las células endoteliales en la protección de cardiomiocitos contra la lesión por reprofusión de isquemia simulada. Los modelos de cocultivo celular se han utilizado ampliamente para investigar el papel de las interacciones célula-célula en la función y diferenciación celular. Sin embargo, los tratamientos separados entre tipos de células y el análisis posterior de un solo tipo de célula no son fácilmente factibles en el cocultivo mixto.El estudio actual tuvo como objetivo crear dos capas celulares separadas con una distancia significativa entre ellas donde se puede inducir una lesión por hipoxia de reprofusión y estudiar el resultado y los efectos en un solo tipo de célula. Comience la preparación descongelando ambas líneas celulares. Coloque las células en matraces T25 después de lavarlas con medios frescos.Al día siguiente, actualice las celdas con medios y úselos cuando sean confluentes. Mantenga la incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados con 21% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono y 74% de nitrógeno. Manténgalo humidificado.Estimar la confluencia de la línea celular de los cardiomiocitos bajo un microscopio de luz. Retire los medios de los matraces que contienen cultivos celulares confluentes y tripsinize con tres a cinco mililitros de tripsina-EDTA por matraz. Agitar el matraz suavemente e incubar a 37 grados centígrados durante dos a cinco minutos.Después de eso, evalúe el progreso enzimático bajo un microscopio de luz. Después del desprendimiento, inactive la solución de tripsina agregando la trysina o la solución celular a un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de medios por matraz T25. Centrifugar la suspensión celular a 120 x g durante dos minutos para obtener un pellet de célula blanda.Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de un medio. A continuación, realice el recuento de células y confirme la viabilidad celular. Mezcle y alícuota de 10 microlitros de células resuspendidas y 10 microlitros de colorante azul de tripano, luego cuente las células vivas usando un contador celular.Diluya las células con medios regulares frescos para lograr las densidades de siembra deseadas. Tome una placa de 24 pocillos previamente recubierta con matriz extracelular y cardiomiocitos de placa a densidades de siembra de 300, 000 por pozo en la parte inferior de la placa. Mantenga las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante la noche.Después de 24 horas, las células endoteliales de la placa en insertos a una densidad óptima de recubrimiento de 100, 000 por inserto. Después de 24 horas de recubrimiento de células endoteliales, coloque insertos de células endoteliales dentro de los pocillos de cardiomiocitos e inicie el cocultivo. Permita que las células coculten durante 12 a 24 horas antes de realizar los experimentos.Prepare los medios hipóxicos vertiendo aproximadamente 25 mililitros de medios en un tubo cónico de 50 mililitros. Selle al aire la parte superior con una membrana de silicona y use una pipeta esterilizada para perforar un agujero. Después de eso, cree otro orificio y deje aproximadamente 2/3 de las pipetas sumergidas en el medio.Enjuague el medio con gas hipóxico durante cinco minutos a un caudal de 30 litros por minuto, luego deseche los medios de las placas de 24 pocillos o insertos de cultivo que contienen células adheridas. Lávelos muy suavemente con 100 microlitros de 10% PBS por pozo agregue 500 microlitros de los medios hipóxicos recién preparados a cada pocillo de las placas o insertos. Reemplace el medio original con medios normales frescos que contengan glucosa y suero en el grupo de control normóxico.Coloque una placa de Petri llena de agua estéril en la cámara de hipoxia para humidificar la cámara. Luego coloque las placas que contienen los grupos hipóxicos en la cámara. Enjuague la cámara de hipoxia con gas hipóxico durante cinco minutos a un flujo de 30 litros por minuto.Después de eso, coloque la cámara dentro de una incubadora a 37 grados centígrados durante 24 horas. Después de la hipoxia, deseche los medios viejos de las placas o insertos y agregue 500 microlitros de medios normales que contengan glucosa y suero a cada pared de las placas, luego almacene las placas dentro de una incubadora en condiciones normales de cultivo durante dos horas para imitar la reperfusión. Transfiera los medios de cultivo celular de la placa de 24 pocillos a una placa de 96 pocillos, luego tome 200 microlitros de medios de cada pozo de la placa de 24 pocillos y distribuya equitativamente en cuatro pozos de la placa de 96 pocillos.Mida la absorbancia de LDH utilizando un kit de ensayo de citotoxicidad en una placa de 96 pocillos y siga las instrucciones del fabricante para determinar el grado de lesión celular. En este estudio, se evaluaron tres tipos de insertos. Los tres insertos tenían el mismo tamaño de poro de 0,4 micrómetros.La única diferencia entre ellos fue la altura del inserto a la base, lo que permitió que las distancias entre las dos capas celulares cocultivadas fueran de 0.5, 1.0 y 2.0 milímetros. Usando este protocolo, las células se cultivaron en condiciones normales de oxígeno y luego se dividieron en dos grupos, un grupo de control normóxico y el grupo de hipoxia. Después de 24 horas, ambos grupos se actualizaron con medios y se cultivaron en condiciones normales de oxígeno durante otras dos horas antes de realizar los ensayos de punto final.Una comparación de los tres tipos de insertos de cultivo para evaluar la liberación de lactato deshidrogenasa para cardiomiocitos solos, células endoteliales solas y cocultivo de cardiomiocitos con células endoteliales se muestra aquí en condiciones normóxicas, hipoxia solamente y reoxigenación por hipoxia. Con una distancia de 0,5 milímetros entre las capas celulares, la hipoxia condujo a un aumento significativo de la liberación de LDH en comparación con la normoxia cuando los cardiomiocitos se cultivaron solos. Sin embargo, la LDH solo aumentó ligeramente en el grupo de reoxigenación por hipoxia en comparación con el grupo de solo hipoxia.Cuando las células endoteliales y los cardiomiocitos se cocultivaron juntos, el aumento de la liberación de LDH en condiciones de hipoxia solamente no se atenuó. Esto indica que las células endoteliales no tuvieron ningún efecto protector en comparación con el grupo de cardiomiocitos solos bajo las condiciones de hipoxia solamente. Sin embargo, las células endoteliales ejercieron una protección leve pero significativa sobre los cardiomiocitos durante la FC. Cuando la distancia entre las capas celulares era de un milímetro, la liberación de LDH también aumentó significativamente en los cardiomiocitos solo bajo la condición de hipoxia solamente.Sin embargo, a diferencia del inserto de 0,5 milímetros, el aumento de la LDH en los cardiomiocitos solo fue potenciado por la FC sobre las condiciones de hipoxia solamente. Este aumento fue aún más pronunciado con el inserto de dos milímetros. La concentración de células endoteliales chapadas en insertos de dos milímetros se tituló a 25, 000, 50, 000 y 100, 000 células por inserto, respectivamente.se encontró que el aumento de la intensidad de las células endoteliales en el cocultivo condujo a una atenuación dependiente de la dosis de la liberación de LDH causada por la FC. Sin embargo, no se observó tal efecto en condiciones normóxicas. Esta metodología de cocultivo no se limita a las células endoteliales y los cardiomiocitos. Estos métodos deberían ayudar a una investigación de interacciones célula-célula específicas entre líneas celulares variadas a través de múltiples órganos de interés.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

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