Name: Preparación e implantación de electrodos para encender eléctricamente ratones VGAT-Cre para generar un modelo para la epilepsia del lóbulo temporal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprende a preparar e implantar electrodos en ratones VGAT-Cre mediante encendido eléctrico para generar un modelo de epilepsia del lóbulo temporal. Este método permite estudiar mecanismos de epileptogénesis con mínima degeneración hipocampal.

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Los autores agradecen a John Williamson por sus útiles discusiones sobre este protocolo. Este trabajo fue apoyado por la subvención NS112549 de NIH/NINDS.

El uso de animales siguió las pautas de ARRIVE12 y fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Virginia.
1. Fabricación de auriculares con dos electrodos bipolares (Figura 1)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62929/62929fig01.jpg"> Figura 1: Pasos clave en la fabricación de auriculares EEG. (A) Aparición de los electrodos en los distintos pasos del protocolo (números en el paso de coincidencia izquierda). (B) Una imagen del producto final montado en un soporte casero que se ajuste al marco estereotáxico. Tenga en cuenta que el soporte termina con un conjunto de pasador de collar que encaja en el pedestal del auricular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62929/62929fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol><li>Corte 3,5 cm de alambre de acero inoxidable recubierto de politetrafluoroetileno.</li>
	<li>Retire aproximadamente 1 mm de la capa de aislamiento del cable en ambos extremos. No tenga demasiado del alambre pelado.</li>
	<li>Coloque dos pines en un soporte de tornillo con la parte inferior del pasador que tiene una hendidura más larga hacia abajo.</li>
	<li>Aplique fundente en los extremos pelados del cable y en la parte superior de los pines.</li>
	<li>Coloque la parte pelada del cable con la soldadura suficiente para recubrirla.</li>
	<li>Agregue una cantidad mínima de soldadura a la parte superior del pasador sin desbordarse en los lados.</li>
	<li>Coloque un extremo de los extremos pelados del cable en el pasador tan profundo como lo permita mientras se derrite la soldadura. NOTA: Hay un orificio lateral donde el cable puede salir, no deje que el cable salga del pasador. Todo el cable pelado debe permanecer dentro del pasador.</li>
	<li>Repita los pasos 1.6-1.7 para el segundo pin, ahora con los otros extremos pelados del cable.</li>
	<li>Deje que los pines reposen durante 30 s para que se fijen, retírelos del soporte del tornillo y luego tire de ellos para asegurarse de que la conexión entre el cable y los pines sea fuerte y se mantenga.</li>
	<li>Enjuague los alfileres con agua fría y luego séquelos.</li>
	<li>Verifique la conductancia entre el pin 1 y el pin 2 usando un ohmímetro.</li>
	<li>Juntar los pasadores en los extremos del cable; Manténgalos paralelos y ciérrelos. Sujete un hemostático al centro del cable. Luego, gire el hemostático, de modo que el cable se tuerza bastante apretado. Retire el hemostático.</li>
	<li>Sujete una pinza al cable trenzado 2 mm por debajo de los pasadores y doble el cable a 90°.</li>
	<li>Empuje el mismo cable de nuevo 90° hacia atrás sobre las pinzas creando otra curva a 1 mm de la primera.</li>
	<li>Corte el alambre trenzado en un ángulo de 45° por debajo de la curva a 3,5 mm con tijeras pequeñas y afiladas.</li>
	<li>Prepare dos de estos electrodos bipolares (trenzados de doble clavijo) para cada auricular (opcional, el segundo es de respaldo en caso de problemas eléctricos con el primero).</li>
	<li>Prepare un solo electrodo de referencia cortando un alambre con clavijas soldadas en ambos extremos en dos (pasos 1.1-1.17, Figura 1A).</li>
	<li>Corte el cable a 7 mm.</li>
	<li>Dobla el extremo 1 mm por debajo de la punta.</li>
	<li>Luego, cubra la punta doblada de 1 mm del alambre con pinzas y gire el alambre firmemente alrededor de las pinzas para crear un pequeño bucle (1 mm de diámetro).</li>
	<li>Doble el bucle perpendicular a la parte recta del cable para que la punta del cable apunte hacia afuera nuevamente.</li>
	<li>Ensamble los dos electrodos bipolares y el electrodo de referencia único en el pedestal de seis pines de manera que los electrodos bipolares estén uno al lado del otro con una distancia de 6 mm entre ellos, y que el electrodo de referencia se coloque en el orificio exterior central (Figura 1B). NOTA: Un método alternativo es implantar los electrodos, cementarlos en su lugar y luego insertar sus pasadores en el pedestal.</li>
</ol>2. Implantación de electrodos estereotáxicos
<ol><li>Esterilice todas las herramientas quirúrgicas y el conjunto de electrodos de seis pines en autoclave antes de la cirugía. Se debe mantener un campo quirúrgico estéril durante la cirugía y se deben usar guantes quirúrgicos estériles. Se recomiendan cortinas estériles (por ejemplo, Press n' Seal) para cubrir al animal, excepto el área quirúrgica.</li>
	<li>Use ratones VGAT-Cre de 8 semanas de edad (de la misma edad, tanto machos como hembras) para cirugías 4 semanas después del destete. Registrar el peso del animal antes de la cirugía para permitir la medición de la pérdida de peso postquirúrgica.</li>
	<li>Use un vaporizador de isoflurano certificado o un sistema de anestesia de bajo flujo equipado con una bomba de jeringa de precisión, vaporizador digital integrado y almohadilla térmica de retroalimentación. NOTA: Los sistemas de bajo flujo son capaces de administrar anestesia a bajas tasas de flujo proporcionales al tamaño del animal en una cámara de inducción o a través de un cono nasal en el marco estereotáxico (70 ml / min, la concentración de isoflurano en el aire es del 4% para la inducción y del 2% para la cirugía). Usar menos anestesia no solo beneficia al animal durante las cirugías, sino que también reduce el riesgo de exposición del personal de laboratorio al isoflurano.</li>
	<li>Coloque el animal anestesiado sobre una almohadilla caliente calentada a 37 °C para mantenerlo caliente durante la cirugía. Si utiliza un sistema de temperatura controlada por retroalimentación, inserte la sonda de temperatura ligeramente lubricada en el recto del animal para controlar la temperatura durante la cirugía.</li>
	<li>Monte al animal en el marco estereotáxico colocando suavemente barras para los oídos en las orejas y los dientes superiores frontales en la barra incisiva. Coloque el cono de la nariz sobre la nariz para la administración adecuada de anestesia. Asegúrese de que la cabeza esté nivelada y centrada y no se pueda mover cuando se sondee ligeramente.</li>
	<li>Inyecte por vía subcutánea 0,5 ml de normosol para la hidratación.</li>
	<li>Aplique lubricante ocular para evitar el secado de la córnea.</li>
	<li>Controle la profundidad de la anestesia por la ausencia del reflejo de abstinencia después de pellizcar un dedo del pie de la extremidad posterior, y luego disminuya el isoflurano a 1.5% -2.0% durante la cirugía.</li>
	<li>Elimine el vello en y alrededor del área quirúrgica depilando o usando cortapelos (afeitado) o crema depilatoria, y desinfecte la piel con tres ciclos de aplicación alterna de yodo y etanol, terminando con yodo. Se recomienda eliminar el vello del sitio quirúrgico solo si hay medios para mantener la anestesia en ese lugar. Si es necesario, use aplicadores de punta de algodón humedecidos en alcohol para eliminar el vello del área inmediata que rodea la cabeza. Inyecte 0,05 ml del analgésico local bupivacaína (0,25%) por vía subcutánea.</li>
	<li>Haga una incisión en el cráneo con un bisturí y luego corte una parte de la piel con tijeras quirúrgicas afiladas, exponiendo el cráneo. Empujando la piel a un lado, usando un hisopo de algodón, limpie el cráneo de todos los músculos y tejidos subyacentes que obstruyen la vista. NOTA: Para detener el sangrado accidental, aplique presión sobre el sitio de sangrado con un hisopo de algodón estéril hasta que se detenga.</li>
	<li>Limpie el cráneo con peróxido de hidrógeno usando hisopos de algodón estériles para hacer visibles las suturas del cráneo y tanto bregma como lambda.</li>
	<li>Seque bien el cráneo y luego aplique una gota de adhesivo dental autograbado con su aplicador. Cepíllelo en el cráneo, espere 60 s y cúrelo con una luz UV dental durante 40 s. Una superficie brillante indica que el adhesivo ha sido efectivamente reticulado con el cráneo. NOTA: Este paso es crítico para la fijación segura de los auriculares.</li>
	<li>Utilice una broca de 0,031" (0,79 mm) para perforar dos orificios de rebabas bilateralmente para la implantación de electrodos de profundidad del hipocampo (aproximadamente 5.000 rpm). Perfore un orificio de rebaba adicional para el electrodo de referencia sobre el cerebelo detrás de la lambda. NOTA: Al perforar, tenga cuidado de bajar el taladro lentamente y evite perforar en el cerebro.</li>
	<li>Las coordenadas de los electrodos son las siguientes (de bregma en mm): electrodos del hipocampo a 3 mm posterior, 3 mm lateral y 3 mm de profundidad; y electrodo de referencia cerebeloso a 6 mm posterior, 0 mm lateral y 0 mm de profundidad (subdural).</li>
	<li>Para aumentar la precisión, use un taladro montado estereotaxamente, ponga a cero el eje X / Y del manipulador estereotáxico al tocar bregma: este es el punto de referencia para las coordenadas.</li>
	<li>Ensamble un auricular insertando todos los electrodos en el pedestal de seis pines, asegurándose de que los pines estén empujados hasta el fondo en el pedestal. Monte el pedestal en el soporte del electrodo en un marco estereotáxico (Figura 1B).</li>
	<li>Alinee los electrodos por encima de los orificios de rebabas correspondientes. Implante estereotaxicamente electrodos de alambre bipolar bipolar de acero inoxidable trenzados en el hipocampo derecho e izquierdo y un electrodo de referencia en el cerebelo bajando lentamente los auriculares y guiando los electrodos hacia los orificios de la rebaba.</li>
	<li>Cuando el electrodo de torsión del hipocampo está justo encima del agujero, ponga a cero el eje Z y baje lentamente a -3.0 mm.</li>
	<li>Cubra la superficie del cráneo y los electrodos con cemento dental y rellene el espacio entre la superficie del cráneo y la parte inferior del pedestal. Los bordes de la piel estarán adyacentes al cemento dental, de modo que ningún tejido subyacente quedará expuesto. Espere a que el cemento se seque y se endurezca. Luego retire el soporte del electrodo del brazo estereotáxico y retire el soporte del pedestal.</li>
	<li>Inyecte 0,1 mL de ketoprofeno (1 mg/mL, SC) para analgesia y una segunda dosis de 0,5 mL de normosol (SC) para hidratación y retire al animal del marco estereotáxico.</li>
	<li>Coloque una almohadilla isotérmica precalentada a 37 °C dentro de una jaula de vivero vacía cubierta con una toalla de papel. Una vez que esté completamente despierto, coloque al animal en una jaula limpia con ropa de cama y comida blanda, y devuélvalo al vivero. Los animales se alojan individualmente a partir de este momento para evitar masticar los auriculares de los demás. Las tolvas de barra de alambre no se usan para evitar que los auriculares se atasquen, y en su lugar, las botellas de agua están atadas a la parte inferior de la parte superior de la jaula, y la comida está presente en la ropa de cama.</li>
	<li>Alimente al animal con un poco de alimento blando durante 72 horas después de la cirugía y controle la pérdida de peso y la puntuación de la condición corporal. A los animales deshidratados se les puede administrar 0,5 ml de normosol por vía subcutánea si están deshidratados (pérdida de peso, aumento de la turgencia de la piel, ojos hundidos). El ketoprofeno se puede administrar por vía subcutánea una vez al día durante 2 días más después de la cirugía (siga el régimen de analgesia de acuerdo con las pautas locales de IACUC). Permita que los animales se recuperen completamente en sus jaulas durante 4-7 días antes de transferirlos al sistema de registro de EEG.</li>
</ol>3. Protocolo de encendido eléctrico
<ol><li>Conecte los ratones al sistema de grabación de EEG mediante un cable flexible que se ajuste a los enchufes de la cabeza del ratón y el conmutador (consulte la lista de materiales ). Permita que los animales se aclimaten durante un día antes de proceder con el protocolo de estimulación eléctrica a continuación. Controle su salud general y aclimatación diariamente, y elimínelos del sistema cuando haya signos de enfermedad, angustia y / o pérdida continua de peso corporal superior al 25%</li>
	<li>Conecte ambos cables del electrodo estimulante a la salida de un estimulador de corriente constante. NOTA: Es muy útil tener una placa de circuito que conmute estos electrodos lejos de la grabadora de EEG y hacia el estimulador.</li>
	<li>Ajuste el estimulador para que entregue pulsos de 1 ms a 50 Hz durante una duración de tren de 2 s.</li>
	<li>Ajuste la salida del estimulador a 20 microamperios (μA) y entregue el1er pulso.</li>
	<li>Controle el EEG para detectar una descarga característica posterior de picos de alta frecuencia que duran más que el pulso de estimulación eléctrica.</li>
	<li>Si no se observa descarga, aumente la cantidad de corriente inyectada en incrementos de 20 μA hasta que se active una descarga posterior. La cantidad de corriente requerida es el umbral posterior a la descarga (ADT).</li>
	<li>Las ADT típicas son de 20-50 μA. Si no se observa descarga incluso después de aumentar a 200 μA, se requiere solucionar problemas de conexiones eléctricas y cableado de auriculares con un ohmímetro de alta sensibilidad. Si el problema está en el electrodo estimulante, intente estimular con los otros electrodos de profundidad.</li>
	<li>Los animales se encienden estimulando 2x o 6x por día usando una corriente que es 1.5x el valor de ADT para ese ratón.</li>
	<li>Monitorear la respuesta conductual a la estimulación, que se eleva desde el cambio de estado a convulsiones tónico-clónicas bilaterales con caídas. Puntúe utilizando un sistema de clases Racine modificado11. Para evitar convulsiones tónicas fatales evocadas, se debe pausar el encendido si los estímulos sucesivos conducen a un aumento de la gravedad y la duración de las convulsiones hasta la puntuación de Racine modificada 6 (correr y saltar)</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Este informe describe un protocolo en el que la activación eléctrica de ratones conduce a la epilepsia. Dado que el electrodo estimulante se coloca en el hipocampo, esta es una epilepsia límbica focal que modela la epilepsia del lóbulo temporal (TLE) en pacientes. Un paso crítico en este protocolo es el uso de ratones VGAT-Cre, que debido a la inserción de un casete de recombinasa IRES-Cre en el gen Vgat , muestra corrientes GABA inhibidoras alteradas11. C57BL / 6 no desarrollan epilepsia...

La epilepsia es un trastorno neurológico importante con importantes cargas económicas y humanas. NINDS estima que hay 3 millones de estadounidenses con epilepsia. Aproximadamente 0,6 millones de estos pacientes tienen epilepsia del lóbulo temporal (TLE)1. Desafortunadamente, el tratamiento médico de TLE falla en un tercio de los pacientes debido a la ineficacia, el desarrollo de resistencia a los medicamentos o la intolerancia a los efectos secundarios2. Claramente, existe una necesidad significativa de desarrollar nuevas terapias para TLE, una conclusión compartida por el Comité de Ciencias Básicas de la Sociedad Americana de Epilepsia, el Grupo de Trabajo de la Liga Internacional contra la Epilepsia para el Descubrimiento Preclínico de Fármacos para la Epilepsia y el Consejo Asesor Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares 3,4.
Los modelos animales actuales de epilepsia del lóbulo temporal utilizan quimioconvulsivos (p. ej., kainato, pilocarpina) o estimulación eléctrica prolongada para inducir un estado epiléptico duradero 5,6,7. Muchos animales mueren durante el procedimiento (10% -30% en ratas, hasta 90% en ratones8). Los animales que sobreviven y desarrollan epilepsia muestran una muerte neuronal extensa en todo el cerebro 9,10. Esta muerte desencadena una cascada de respuestas, comenzando con la activación de microglía, astrocitos y monocitos infiltrantes. Las respuestas neuronales incluyen la reorganización de circuitos (por ejemplo, brotes de fibras musgosas), el nacimiento de nuevas neuronas que no se integran adecuadamente en los circuitos (por ejemplo, células granulares ectópicas) y cambios intrínsecos que conducen a la hiperexcitabilidad (por ejemplo, regulación positiva de los canales de Na +). Un modelo de epilepsia sin muerte neuronal significativa facilitará la búsqueda de nuevos fármacos antiepilépticos.
Mientras probaba la hipótesis GABA de la epilepsia, se descubrió que el tratamiento de ratones VGAT-Cre con un protocolo de encendido eléctrico leve condujo a las convulsiones motoras y electrográficas espontáneas11. En general, el encendido eléctrico de los roedores no conduce a convulsiones espontáneas que definen la epilepsia, aunque puede, en casos de sobreencendido11. Los ratones VGAT-Cre expresan Cre recombinasa bajo el control del gen transportador vesicular GABA (VGAT), que se expresa específicamente en las neuronas inhibidoras GABAérgicas. Se encontró que la inserción de Cre interrumpió la expresión de VGAT a nivel de ARNm y proteína, perjudicando así la transmisión sináptica GABAérgica en el hipocampo. Se concluyó que los ratones VGAT-Cre encendidos podrían ser útiles para estudiar los mecanismos implicados en la epileptogénesis y para el cribado de nuevas terapias11. En el presente informe se detallan los métodos utilizados para generar el modelo.

<table><tbody><tr><td>Amplificador de CA diferencial extracelular de 16 canales (115 V/60 Hz)</td><td>AD Instruments</td><td>AM3500-115-60</td><td>Amplificador de EEG alternativo</td></tr><tr><td>363/CP COLLAR DE ENCHUFE, MANGUITO DE CLAVIJAS</td><td>P1 Technologies</td><td>363SLEEVPIN0NL</td><td>Para cable portaelectrodos</td></tr><tr><td>, 363-363 5CM - 100CM C/MESH 6TCM</td><td>P1 Technologies</td><td>363363XXXXCM004</td><td>cable de ratón a conmutador</td></tr><tr><td>Cámaras CCTV Qcwox HD Sony IR LED</td><td>Conmutador</td><td>Sony QC-SP316</td><td></td></tr><tr><td>SL6C/SB (un solo cepillo)</td><td>P1 Technologies</td><td>8BSL6CSBC0MT</td><td>anteriormente Plastics One, Inc.</td></tr><tr><td>Amplificador de corriente</td><td>A-M Systems</td><td>Modelo 2100</td><td></td></tr><tr><td>Cemento dental</td><td>Stoelting</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>Brocas, #75, OD&nbsp; 0.310" LOC 130 PT</td><td>Kyocera</td><td>105-0210.310</td><td></td></tr><tr><td>E363/0 SOCKET CONTACTO SESGADO</td><td>P1 Technologies</td><td>8IE3630XXXXE</td><td>pines para conector</td></tr><tr><td>iBond Pegamento Self Etch</td><td>Kulzer</td><td>CE0197</td><td></td></tr><tr><td>MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN BLANCO</td><td>P1 Technologies</td><td>8K000229801F</td><td>Conector de auriculares EEG</td></tr><tr><td>Ohmeter</td><td>Simpson</td><td>260</td><td>Alta sensibilidad</td></tr><tr><td>PowerLab 16/35 y LabChart Pro</td><td>AD Instruments</td><td>PL3516/P</td><td>Software de EEG alternativo</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>Kent Scientific Corp.</td>Unidad de anestesia <td>SS-01</td><td>& Monitoreo RightTemp</td></tr><tr><td>Taladro estereotáctico y kit de micromotor</td><td>Foredom Electric Co.</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Marco estereotáctico</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 940</td><td></td></tr><tr><td>Alambre recubierto de teflón para electrodo de profundidad, OD 0.008'A-M</td> <td>Systems</td><td>791400</td><td></td></tr><tr><td>Ratones VGAT-Cre sobre fondo C57BL/6J congénito</td><td>The Jackson Laboratory 000664</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación e implantación de electrodos para encender eléctricamente ratones vgat-cre para generar un modelo para la epilepsia del lóbulo temporal

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

Se descubrió que la excitación eléctrica de los ratones VGAT-Cre condujo a las convulsiones motoras y electrográficas espontáneas. Un artículo reciente se centró en cómo se utilizaron ratones VGAT-Cre únicos en el desarrollo de convulsiones recurrentes espontáneas (SRS) después de encender y un mecanismo probable, la inserción de Cre en el gen VGAT, interrumpió su expresión y redujo el tono GABAérgico. El presente estudio extiende estas observaciones a una cohorte más grande de ratones, centrándose en cuestiones clave como cuánto tiempo continúa el SRS después de encenderse y el efecto del sexo y la edad del animal. Este informe describe los protocolos para los siguientes pasos clave: fabricación de auriculares con electrodos de profundidad del hipocampo para la estimulación eléctrica y para la lectura del electroencefalograma; cirugía para fijar el auricular de forma segura en el cráneo del ratón para que no se caiga; y detalles clave del protocolo de encendido eléctrico, como la duración del pulso, la frecuencia del tren, la duración del tren y la cantidad de corriente inyectada. El protocolo de encendido es robusto, ya que conduce de manera confiable a la epilepsia en la mayoría de los ratones VGAT-Cre, proporcionando un nuevo modelo para probar nuevos medicamentos antiepileptogénicos.

Animales El modelo fue desarrollado originalmente usando ratones VGAT-Cre (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)13 sobre un fondo mixto. Sin embargo, también se ha aplicado a la cepa VGAT-Cre que es congénita con C57BL/6J. No se han observado diferencias en la epilepsia que se desarrolla entre las cepas. Ambas cepas expresan Cre recombinasa bajo el control del promotor transportador vesicular GABA. Estos ratones se generaron golpeando un casete IRES-Cre después del codón de parada ...

Este informe describe los métodos para generar un modelo de epilepsia del lóbulo temporal basado en el encendido eléctrico de ratones transgénicos VGAT-Cre. Los ratones VGAT-Cre encendidos pueden ser útiles para determinar qué causa la epilepsia y para detectar nuevas terapias.

Preparación e implantación de electrodos para encender eléctricamente ratones VGAT-Cre para generar un modelo para la epilepsia del lóbulo temporal

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...

Este protocolo genera un nuevo modelo para la epilepsia del lóbulo temporal en el que los ratones desarrollaron convulsiones espontáneas, y ha sido muy útil para investigar los mecanismos de la epileptogénesis y también para detectar nuevas terapias. Este procedimiento en ratones VGAT-Cre conduce de manera confiable a convulsiones electrográficas y motoras y motoras compuestas recurrentes espontáneas sin causar una muerte celular extensa del hipocampo que a menudo se observa después del estado epiléptico desencadenado con quimioconvulsivos o estimulación eléctrica continua. Para comenzar a fabricar auriculares, corte el alambre de acero inoxidable recubierto de politetrafluoroetileno de 3,5 centímetros de largo y quite aproximadamente un milímetro de la capa de aislamiento de ambos extremos del cable.Coloque dos pasadores en un soporte de vicio, con la parte inferior del pasador con una hendidura más larga hacia abajo. Luego, aplique fundente en los extremos pelados del cable y la parte superior de los pines. Coloque la parte pelada del cable y la parte superior de los pasadores con la soldadura suficiente para recubrirla sin desbordarse en los lados.Coloque uno de los extremos pelados del cable en el pasador lo más profundo posible mientras la soldadura se derrite. Repita el proceso para el segundo pin con el otro extremo pelado del cable. Después de enfriar los pines y soldar durante 10 segundos, retire los pines del soporte del vicio y luego tire de los pines para asegurarse de que la conexión entre el cable y los pines sea fuerte y se mantenga.Enjuague los alfileres en agua fría seguido de secado. Más tarde, use un ohmímetro para verificar la conductancia entre el pin uno y el pin dos. Juntar los pines al final del cable para mantenerlos paralelos y cerrados.Sujete un hemostático al centro del cable y gire el hemostático para girar el cable alrededor de sí mismo con fuerza. Después de quitar el hemostático, sujete las pinzas al alambre trenzado a dos milímetros por debajo de los pasadores para doblar el cable a 90 grados. Empuje el cable 90 grados hacia atrás sobre las pinzas, creando una curva más a un milímetro de la primera.Use tijeras pequeñas y afiladas para cortar el alambre retorcido a 45 grados y 3.5 milímetros por debajo de la curva. Prepare dos electrodos trenzados bipolares o de doble clavija para cada auricular. Para preparar un electrodo de referencia, corte un cable con un alfiler soldado en ambos extremos en dos.Luego, corte el cable a siete milímetros y doble el extremo del cable a un milímetro por debajo de la punta. Cubra la punta doblada de un milímetro del alambre con pinzas y gire el alambre apretado alrededor de las pinzas para crear un pequeño lazo con un milímetro de diámetro. Luego, doble el bucle perpendicular a la parte recta del cable para que la punta del cable apunte hacia afuera nuevamente.Ensamble todos los electrodos en el pedestal de seis pines uno al lado del otro con una distancia de seis milímetros entre los dos electrodos bipolares. Coloque el electrodo de referencia en el orificio exterior central. Antes de proceder con la cirugía, registre el peso de los ratones VGAT-Cre de ocho semanas de edad.Luego, coloque al animal en una cámara de inducción para inducir la anestesia. Coloque el ratón anestesiado en una almohadilla térmica a 37 grados centígrados. Si utiliza un sistema de temperatura controlada por retroalimentación, inserte la sonda de temperatura en el recto del animal para controlar la temperatura durante la cirugía.Para comenzar la cirugía, redirija el flujo de anestesia inhalante al cono de la nariz y monte al animal en el marco estereotáxico colocando suavemente los dientes superiores frontales en la barra incisiva y mueva el cono hacia su nariz. Luego, coloque las barras para los oídos en las orejas y fíjelas en el marco estereotáxico. Asegúrese de que la cabeza del animal esté nivelada y centrada y no se pueda mover cuando se sondee ligeramente.Una vez montado el animal, inyecte 0,5 mililitros de Normosol en los ratones para hidratarse y aplique lubricante ocular para evitar el secado corneal. Controle la profundidad de la anestesia pellizcando una pata de la extremidad posterior. Si el reflejo de retirada está ausente en el animal, proceda a eliminar el pelo del cuero cabelludo del ratón alrededor del área quirúrgica.Cuando haya terminado, desinfecte el área limpia de la piel tres veces con una aplicación alterna de etanol y yodo, terminando con yodo, e inyecte 0.05 mililitros de bupivacaína al 0.25% por vía subcutánea. Haga una incisión en el cráneo con un bisturí y luego corte una parte de la piel con tijeras quirúrgicas, exponiendo el cráneo. Empuje la piel a un lado antes de limpiar el cráneo de todos los tejidos subyacentes con un hisopo de algodón.Limpie el cráneo con peróxido de hidrógeno usando hisopos de algodón estériles y haga visibles las suturas del cráneo, el bregma y la lambda. Con el taladro montado estereotaxamente, mueva la punta de taladro a bregma en coordenadas cero X, Y y Z. Luego, levante y mueva el taladro a lambda para determinar sus coordenadas y determinar si el cabezal está nivelado.Después de secar bien el cráneo, aplique una gota de adhesivo dental autograbado con el aplicador. Espere 60 segundos antes de curar el adhesivo dental con una luz UV dental durante 40 segundos. Una superficie brillante indica que el adhesivo ha sido efectivamente reticulado con el cráneo.Con la ayuda de una broca de 0.031 pulgadas, perfore cuidadosamente dos orificios de rebabas bilateralmente en el cráneo a 5, 000 rotaciones por minuto, o RPM, evitando perforar el cerebro. Aplique gota de solución salina para mejorar la perforación de los orificios de rebaba. Para la implantación de electrodos de profundidad del hipocampo, perfore a tres milímetros posterior y tres milímetros laterales desde bregma.Perfore un orificio de rebabas para el electrodo de referencia sobre el cerebelo detrás de la lambda a seis milímetros posteriores y cero milímetros laterales de bregma. A continuación, monte el pedestal de seis pines con electrodos ensamblados en el soporte del electrodo en el marco estereotáxico. Al alinear los electrodos por encima de los orificios de rebabas correspondientes, baje lentamente y navegue por los auriculares para ubicar las dos puntas de electrodos bipolares justo encima de los orificios de rebabas del hipocampo izquierdo y derecho, y si es necesario, ajuste el electrodo de referencia para flotar por encima del orificio sobre el cerebelo.Cuando los electrodos de torsión del hipocampo estén justo encima de los agujeros, ponga a cero el eje Z y baje lentamente el electrodo a menos tres milímetros en el hipocampo derecho e izquierdo y guíe el electrodo de referencia hacia el orificio sobre el cerebelo. Preparó el cemento dental mezclando el polvo y el líquido en un tazón para mezclar. Luego, cubra la superficie del cráneo, los electrodos y el espacio entre la superficie del cráneo y la parte inferior del pedestal con cemento dental.Una vez que el cemento se seque y se endurezca, separe el soporte del electrodo del brazo estereotáxico, levante el brazo y retire el soporte del pedestal. Después de administrar el ratón por vía subcutánea con ketoprofeno y Normosol, retire al animal del marco estereotáxico para mover al animal a la almohadilla térmica en la jaula del vivero. Una vez completamente despierto, devuelva al animal soltero a la jaula del vivero, alimente al animal con alimentos blandos y controle la pérdida de peso diariamente hasta 72 horas después de la cirugía.En el diagrama de violín representativo, se muestra el número de estimulaciones requeridas por los ratones para el criterio de estado encendido. Los ratones típicamente alcanzaron el estado encendido o experimentaron cinco convulsiones motoras tónico-clónicas bilaterales después de 15 estimulaciones. Se encontró que la latencia a las convulsiones recurrentes espontáneas, o SRS, era de 10,7, y la frecuencia promedio de las convulsiones fue de 1,3 convulsiones por día.La distribución confiable de SRS mostró que los ratones fueron epilépticos durante aproximadamente 23 días. En las imágenes representativas, se puede ver el número de neuronas anti-NeuN positivas o muertes neuronales en varios subcampos del hipocampo y la corteza entorrinal. Es importante que los dos electrodos bipolares entren suavemente en los dos orificios de rebaba, por lo que deben estar justo encima de los orificios de rebaba.Y también, es importante aplicar cuidadosamente el cemento dental y dejar que se endurezca completamente antes de retirar el soporte del electrodo. Esta técnica nos permite generar ratones epilépticos y monitorearlos continuamente con grabación de EEG y también grabación de video, simultáneamente. Y con los experimentos que hacemos, podemos probar nuevas estrategias de tratamiento, como la terapia génica, para reducir la frecuencia, la duración y la gravedad de las convulsiones.

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Neurociencia

Parcialmente aisladas corteza ("socavar") es un modelo animal eficiente de epileptogénesis postraumático. Aquí se demuestra cómo hacer que un dispositivo quirúrgico novedoso y lo utilizan para hacer que las lesiones más preciso y consistente para generar este modelo.

La preparación de modelos Recorte de Epileptogénesis postraumático en roedores

Se describe un procedimiento para la manipulación de la actividad de las neuronas piramidales corticales cerebrales optogenetically mientras que el electroencefalograma, electromiograma, y ​​la concentración de lactato cerebral son monitoreados. Grabaciones experimentales se realizaron en ratones de cable-atados mientras se someten espontáneas de sueño / vigilia ciclos. Optogenético equipo es ensamblado en nuestro laboratorio; aparato de control está disponible comercialmente.

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Este video muestra una técnica para implantar un conjunto de electrodos en el cerebro de un ratón. El conjunto contiene electrodos bipolares para registrar la actividad del hipocampo y un electrodo de referencia para obtener la actividad basal del cerebelo. Un ratón anestesiado se coloca en un marco estereotáxico y el conjunto de electrodos se implanta en la región del cerebro objetivo. A continuación, se permite que el animal se recupere antes de realizar el registro electrofisiológico.

Implantación de un conjunto de electrodos en el cerebro de un ratón para su registro electrofisiológico

Los estudios han demostrado que la estimulación catódica transcraneal de corriente directa puede producir efectos supresores sobre las convulsiones resistentes a los medicamentos. En este estudio, se diseñó una configuración experimental in vitro en la que se evaluó la estimulación de corriente continua y el registro de la matriz de múltiples electrodos de la actividad similar a las convulsiones en la preparación de cortes de cerebro de ratones. Se evaluaron los parámetros de estimulación de...

La estimulación de corriente directa y multi-electrodo matriz de registro de la actividad convulsiva en ratones cerebro rebanada preparación

Este artículo demuestra el rendimiento de la acupuntura, modelos de epilepsia y el análisis del sueño en roedores. Se describe el procedimiento de acupuntura y la identificación de los puntos de acupuntura. La pilocarpina o pentilenetetrazol (PTZ) se usa para inducir la epilepsia. Para el análisis del sueño se emplean el electrocorticograma (ECoG), el electromiograma (EMG), la temperatura cerebral y los registros de la actividad locomotora.

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Ilustramos cómo realizar grabación y eléctrica de la modulación de la actividad epileptiforme inducida por 4-aminopiridina en rebanadas de cerebro de roedores utilizando microelectrodos. Una cámara de grabación personalizada mantiene la viabilidad del tejido a lo largo de prolongadas sesiones experimentales. Asignación de electrodo en vivo y selección de pares estimulantes son realizados por una interfaz de usuario gráfica personalizada.

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Modelos de convulsión aguda son importantes para el estudio de los mecanismos subyacentes a los eventos epileptiformes. Además, la capacidad para generar eventos epileptiformes en demanda proporciona un método altamente eficiente para estudiar la secuencia exacta de los eventos subyacentes a su iniciación. Aquí, describimos los modelos de crisis cortical aguda 4-aminopiridina en tejido humano y ratón.

Generación y demanda inicio de la actividad Ictal aguda en roedores y tejido humano

El reto de la investigación de la epilepsia es desarrollar tratamientos novedosos para los pacientes donde la terapia clásica es inadecuada. El uso de un nuevo protocolo — con la ayuda de un sistema de administración de fármacos implantables — somos capaces de controlar las convulsiones en ratones anestesiados por la entrega electroforética de GABA en el foco epiléptico.

La entrega electroforética de ácido γ-aminobutírico (GABA) en el enfoque epiléptico previene las convulsiones en ratones

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Aprende a preparar e implantar electrodos en ratones VGAT-Cre mediante encendido eléctrico para generar un modelo de epilepsia del lóbulo temporal. Este método permite estudiar mecanismos de epileptogénesis con mínima degeneración hipocampal.

Preparación e implantación de electrodos para encender eléctricamente ratones VGAT-Cre para generar un modelo para la epilepsia del lóbulo temporal (Video) | JoVE Journal

Preparación e implantación de electrodos para encender eléctricamente ratones VGAT-Cre para generar un modelo para la epilepsia del lóbulo temporal

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