Tinción inmunohistoquímica fluorescente multiplexada de cuatro tipos de células inmunes endometriales en aborto espontáneo recurrente
4 de agosto de 2021
A pesar de los avances en inmunohistoquímica multiplex e imágenes multiespectrales, la caracterización de la densidad y la agrupación de las principales células inmunes simultáneamente en el endometrio sigue siendo un desafío. Este artículo describe un protocolo detallado de tinción multiplex e imágenes para la localización simultánea de cuatro tipos de células inmunes en el endometrio.
La tecnología actual permite el uso de anticuerpos criados en la misma especie para detectar hasta siete marcadores. La demostración del procedimiento estará a cargo de Loucia Chan, técnica del laboratorio. Comience preparando los portaobjetos de vidrio incrustados de parafina fija de formalina montados con la muestra de tejido, colocando los portaobjetos planos en un horno, para hornear a 60 grados centígrados con el tejido hacia arriba.
Después de una hora, descere y rehidrate las diapositivas cada 10 minutos cada una con la serie de productos químicos, como se describe en el manuscrito. Sumerja los portaobjetos en solución salina tamponada con tris, y luego en una caja de diapositivas de plástico llena de una mezcla de formaldehído diluido en metanol, para fijar las muestras. A continuación, lave los toboganes dos veces en agua desionizada durante dos minutos.
Proceda a la recuperación del epítopo, colocando el bastidor de portaobjetos en una caja de resistencia al calor llena de tampón de ácido cítrico a pH 6.0. Y luego colocar la caja en el microondas, para calentar las diapositivas primero al 100% de potencia durante 50 segundos, seguido de 20 minutos al 20% de potencia, para mantener la misma temperatura. Después de enjuagar los portaobjetos en agua destilada y lavarlos con TBST, sumerja el portaobjetos en un frasco que contenga una solución de bloqueo de peroxidación durante 10 minutos.
Después de la incubación, enjuague los portaobjetos en agua destilada y lávese con TBST, luego use una pluma de barrera hidrofóbica para marcar un límite alrededor de la sección de tejido en el portaobjetos. Luego enjuague el portaobjetos en TBST, cubra las secciones de tejido con el tampón de bloqueo e incube los portaobjetos en una cámara humidificada durante 15 minutos. Para eliminar los reactivos de bloqueo, primero incube los portaobjetos con el anticuerpo primario de interés y luego elimine el anticuerpo primario lavando los portaobjetos tres veces con TBST, antes de incubarlos con el polímero de rábano picante peroxidasa marcado, anticuerpo secundario.
Después de la incubación, lave las diapositivas antes de aplicar la flora opal para la solución de trabajo TSA y luego enjuague la diapositiva con el tampón de recuperación de antígenos. Realice el desmontaje basado en microondas calentando las diapositivas en el búfer de recuperación de antígenos en un microondas al 100% de potencia, durante 50 segundos, seguido de un 20% de potencia durante 20 minutos en los contenedores seguros para microondas. Después de enfriar las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos, enjuague los portaobjetos en agua destilada y TBST y luego incube con una solución dappy durante cinco minutos.
A continuación, seque al aire la corredera antes de montarla con el medio de montaje adecuado. Antes de obtener imágenes de las diapositivas, preestablezca los filtros apropiados en la estación de trabajo. Capture un mínimo de 10 campos para su análisis con un aumento de 200 veces.
Para contar las celdas, haga clic en el botón contar objetos en la barra de pasos, para mostrar el panel de configuración de conteo de objetos. Si el tejido se ha segmentado, seleccione la categoría de tejido en la que se encuentran los objetos. A continuación, seleccione la escala de señal deseada de escala automática o escala fija.
Para la segmentación de objetos, seleccione el componente principal en la lista desplegable. Para detectar objetos que tocan otros objetos como objetos individuales y no combinados, marque la casilla tamaño máximo y píxeles y luego opte por la división refinada. A continuación, cuente todas las células estromales en las células inmunes por separado, para expresar los datos como los porcentajes de las células inmunes en relación con el número total de células estromales para cada imagen capturada.
Más tarde, informe el recuento final de celdas como un promedio de todos los campos. Con el editor de vistas, examine las tablas de datos resultantes después del procesamiento y, a continuación, exporte la tabla de datos de recuento. En el análisis representativo, se diferencian cuatro tipos de células inmunes en la muestra de endometrio.
La imagen procesada muestra la segmentación tisular como compartimentos epiteliales y estromales. La inmunotinción multiplex se realizó en las biopsias endometriales de una mujer control fértil y una mujer con aborto espontáneo recurrente inexplicable, se reveló un solo piso para nosotros que representa CD3, CD56, CD68 y CD20 en la inmunotinción. Una vez que se ha identificado el sonido inmunológico, una mayor tinción debajo de la citoquina puede ayudar a abordar su interacción y mecanismo para el éxito de la implantación.
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Descripción general
Este estudio aborda los desafíos de caracterizar simultáneamente la densidad y la agrupación de los principales tipos de células inmunitarias en el endometrio mediante inmunohistoquímica múltiple e imagen multispectral. Se describe un protocolo detallado de tinción para la localización simultánea de cuatro tipos de células inmunitarias en el endometrio.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Inmunología
- Biología endometrial
- Técnicas de imagen múltiple
Antecedentes
- Importancia de la caracterización de las células inmunitarias en la biología reproductiva.
- Dificultades en los métodos tradicionales de tinción.
- Avances en la tecnología de imágenes.
Métodos Utilizados
- Inmunohistoquímica múltiple
- Muestras de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina
- Imagen multispectral
Resultados Principales
- Diferenciación exitosa de cuatro tipos de células inmunitarias (CD3, CD56, CD68, CD20) en el endometrio.
- Visualización de la distribución y agrupación de células inmunitarias.
- Proporcionó mejoras al protocolo para estudios posteriores.
Conclusiones
- El estudio demuestra un método confiable para el análisis de células inmunitarias en el endometrio.
- Esto tiene implicaciones para comprender la salud reproductiva y el éxito de la implantación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La tinción inmunohistoquímica fluorescente multiplex permite la cuantificación simultánea de múltiples poblaciones de células inmunitarias dentro de una única sección de tejido, abordando una brecha crítica en la investigación de la inmunología reproductiva. Este enfoque facilita la reducción mecanicista de hipótesis sobre el microentorno endometrial al proporcionar datos de perfilado inmunitario multiplex con resolución espacial directamente a partir de muestras derivadas de pacientes. El método mejora la confianza predictiva en los esfuerzos de validación de dianas relacionados con el fracaso de implantación y el aborto recurrente, al permitir la comparación directa de la densidad y agrupamiento de células inmunitarias entre estados fértiles y patológicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la exploración de hipótesis terapéuticas relacionadas con las interacciones de células inmunitarias en el endometrio mediante la detección simultánea de los marcadores CD3, CD56, CD68 y CD20.
- Valor operativo: Reduce la necesidad de seccionado y tinción seriados, conservando muestras clínicas valiosas al tiempo que aumenta la densidad de datos por sección de tejido.
- Confianza predictiva: Proporciona métricas cuantitativas y resueltas espacialmente de células inmunitarias que apoyan la reducción del riesgo biológico de dianas implicadas en la comunicación entre el endometrio y el sistema inmunitario durante la implantación.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Genera lecturas fluorescentes estandarizadas y reproducibles adecuadas para plataformas de imagen de alto contenido y flujos de trabajo de análisis automatizado de imágenes.
- Escalabilidad: Compatible con biobancos de tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE), lo que permite el análisis retrospectivo de grandes cohortes para el descubrimiento de biomarcadores.
- Optimización de multiplexación: Aborda la interferencia entre fluoróforos mediante ciclos secuenciales de tinción y eliminación, asegurando la especificidad de la señal para cada marcador de células inmunitarias.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Sistema Clínicamente Relevante: Aplicable directamente a biopsias endometriales humanas, proporcionando un modelo clínicamente relevante para estudiar la disregulación inmunitaria en abortos recurrentes.
- Continuidad Translacional: Conecta el perfilado inmunitario en fase de descubrimiento con la validación preclínica al permitir un fenotipado inmunitario consistente entre diferentes tipos de muestras.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Facilita la investigación de interacciones entre células inmunitarias mediadas por citocinas tras la identificación inicial de los tipos celulares, promoviendo la validación de dianas a nivel de vías moleculares.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se encaja dentro de la fase de biología del descubrimiento, apoyando específicamente los esfuerzos de validación de dianas inmunitarias y cribado fenotípico en programas de inmunología reproductiva.
- Biología del Descubrimiento: Permite probar hipótesis sobre la composición de células inmunitarias y su organización espacial en el endometrio durante la ventana de implantación.
- Detección: Genera resultados cuantitativos de inmunofluorescencia que permiten comparar las densidades de células inmunitarias y los patrones de agrupamiento entre diferentes condiciones experimentales.
- Análisis: Proporciona datos multiplexados de intensidad de fluorescencia y co-localización que permiten la fenotipificación de células inmunitarias y la inferencia de su estado funcional.
- Investigación Traducional: Facilita la continuidad desde el análisis de muestras humanas hasta estudios mecanicistas posteriores, al ofrecer marcadores validados de células inmunitarias para ensayos funcionales posteriores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de inmunomarcado reutilizable, aplicable a múltiples estudios de perfilado inmunitario en el endometrio y otros tejidos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al permitir una comparación directa y multiplexada de poblaciones de células inmunitarias en tejidos enfermos frente a tejidos control.
- Valor operativo: Mejora la eficiencia de los reactivos y reduce la variabilidad mediante protocolos optimizados de tinción y eliminación secuencial en portaobjetos individuales.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o no en terapias reproductivas al aclarar las contribuciones del microentorno inmunitario al éxito o fracaso del implante.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en la densidad de células inmunitarias, la agrupación y la correlación espacial con compartimentos epiteliales o estromales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en inmunohistoquímica, microscopía de fluorescencia y análisis de imágenes multiespectrales para la detección y cuantificación precisas de las señales.
- Depende del acceso a sistemas de recuperación de antígenos por microondas, escáneres de portaobjetos con capacidad de fluorescencia y kits validados de fluorocromos Opal para ciclado multiplex.
- Exige la estandarización de las condiciones de bloqueo, incubación con anticuerpos y eliminación entre laboratorios para garantizar la reproducibilidad de los resultados multiplex.
- Requiere la adaptación de paneles de anticuerpos y pasos de validación al aplicar el método a diferentes tipos de tejidos o marcadores de células inmunitarias distintos de CD3, CD56, CD68 y CD20.
- Las limitaciones prácticas incluyen el posible traslape de fluorocromos y la necesidad de una cuidadosa separación espectral durante la adquisición de imágenes, lo cual se aborda mediante la eliminación secuencial y configuraciones de filtros validadas.
