Name: DUCT: Fundición de doble resina seguida de tomografía microcomputarizada para análisis hepático 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Aprende el método DUCT para visualizar sistemas vasculares y biliares hepáticos en 3D mediante inyección de resinas radiopacas y microtomografía computarizada. Esta técnica permite estudiar la arquitectura del hígado sin anticuerpos ni fluorescencia.

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Agradecemos a Kari Huppert y Stacey Huppert por su experiencia y ayuda con respecto a la canulación de conductos biliares y su hospitalidad de laboratorio. También agradecemos a Nadja Schultz y Charlotte L. Mattsson por su ayuda con la canulación del conducto biliar común.
Agradecemos a las siguientes Agencias Otorgante por su apoyo:
Para trabajar en ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (Swedish Foundations' Starting Grant), European Association for the Study of the Liver (Premio Daniel Alagille), Swedish Heart-Lung Foundation (20170723) y Vetenskapsrådet (2019-01350).
Por su trabajo en JK Lab: Reconocemos la infraestructura de investigación de CzechNanoLab respaldada por MEYS CR (LM2018110). J.K. gracias al apoyo de la subvención FSI-S-20-6353.

<ol><li>Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+preparation+of+multicolored+corrosion+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">On the preparation of multicolored corrosion specimens.</a> The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).</li>
<li>Ludwig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+human+biliary+system+studied+by+quantitative+computer-aided+three-dimensional+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques.</a> Hepatology. 27, 893-899 (1998).</li>
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<li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+artery+and+portal+vein+remodeling+in+rat+liver%3A+Vascular+response+to+selective+cholangiocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation.</a> American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).</li>
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<li>Cuervo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+notch+signaling+is+essential+to+prevent+hepatic+vascular+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice.</a> Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).</li>
<li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+%28Rumi%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63, 550-565 (2016).</li>
<li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272(2012).</li>
<li>Hankeova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DUCT+reveals+architectural+mechanisms+contributing+to+bile+duct+recovery+in+a+mouse+model+for+Alagille+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome.</a> Elife. 1, 1-29 (2021).</li>
<li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+Alagille+syndrome+and+mechanisms+of+Jagged1+missense+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations.</a> Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).</li>
<li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64, 175-188 (2016).</li>
<li>Ober, E. A., Lemaigre, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+liver%3A+Insights+into+organ+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis.</a> Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).</li>
</ol>

Un proyecto separado en el laboratorio de ERA está financiado por ModeRNA. ModeRNA no tuvo ningún papel en el proyecto/protocolo descrito aquí.

Varios pasos críticos determinan el éxito del CONDUCTO, desde la preparación de la muestra hasta los parámetros del dispositivo de TC. Para lograr los mejores resultados, se debe utilizar resina bien contrastada, bien inyectada y sin burbujas para permitir un procesamiento digital sencillo con umbrales automatizados para obtener datos, imágenes y películas en 3D. Con el entrenamiento y siguiendo este protocolo, el 90% de las inyecciones son exitosas y dan como resultado datos reproducibles. Es importante utilizar resina amarilla fresca para lograr el mejor contraste entre los dos sistemas inyectados. La resina amarilla tiene una radiopacidad muy fuerte, mientras que la resina azul tiene una radiopacidad indetectable. Los mejores resultados se logran dentro de los primeros tres meses después de abrir una nueva botella de resina amarilla. Con el tiempo, la resina precipita, y después de un almacenamiento más largo (>6 meses), las resinas amarilla y verde ya no se distinguirán en las tomografías computarizadas. Las imágenes con un contraste deficiente requieren un rastreo y segmentación manual extenso y lento de los dos sistemas. A continuación, el tubo bien estirado es indispensable para encajar en el conducto biliar común de ratones adultos y el conducto biliar común y la vena porta de ratones postnatales. El punto de entrada para la inyección debe crearse con cuidado. Si el conducto biliar común se corta transversalmente, es probable que se desprenda del tejido circundante, impidiendo la entrada exitosa del tubo. Este paso es especialmente delicado para los ratones postnatales en los que el conducto biliar común se retrae y se "enrosca" si se ha desprendido de su tejido circundante, lo que hace que la inserción del tubo sea extremadamente difícil. La entrada e inyección del conducto biliar común puede requerir algo de práctica. Mientras prepara el tubo con resina y durante toda la inyección, evite la formación de burbujas, ya que las burbujas crearán espacio negativo en las imágenes de TC y requerirán una corrección manual que requiere mucho tiempo. Es importante masajear suavemente el hígado rodando sobre su superficie con un hisopo de algodón humedecido durante y después del procedimiento de inyección, ya que esto facilita incluso la propagación de la resina. Después de completar la inyección y la extracción del tubo, el nudo de sutura de seda debe apretarse rápida y cuidadosamente, para que la resina no fluya fuera del hígado antes de que se polimerice por completo. Para obtener imágenes microCT exitosas, la muestra debe fijarse adecuadamente en su lugar con agarosa y adaptarse térmicamente para eliminar los artefactos de movimiento en los datos de tc. Los ajustes de adquisición también son de importancia clave, que deben optimizarse para alcanzar una resolución espacial adecuada para resolver estructuras finas.
Se pueden hacer modificaciones técnicas al procedimiento de inyección para lograr la inyección en ratones más jóvenes. Actualmente, la fundición de resina de hígados de ratón más jóvenes está limitada por la disponibilidad de tubos suficientemente delgados, siendo PE10 el tubo más pequeño disponible comercialmente. Tanimizu et al. inyectaron con éxito tinta de carbono en el conducto biliar común embrionario del día 17 (E17) utilizando capilares de vidrio11. Por lo tanto, sería de interés realizar pruebas futuras de si la resina se puede suministrar a través de capilares de vidrio. La DUCT se adaptó aún más para inyectar otros sistemas tubulares como las vías respiratorias y la vasculatura de la arteria pulmonar de los pulmones9. La inyección de doble resina también podría modificarse para ser utilizada con otras resinas disponibles comercialmente, o este protocolo podría usarse para inyecciones con tinta de carbono.
Uno de los principales factores limitantes de la tubería DUCT es la viscosidad de la resina. DUCT solo se puede utilizar para la fundición de resina de estructuras tubulares por encima de un diámetro de 5 μm. En este conjunto de datos, la resina podría penetrar en tubos con el diámetro más pequeño de 5 μm9. Esta limitación de tamaño impide el análisis de conductos finos y capilares pequeños. Para avanzar aún más en la tubería de DUCT a recipientes de calibre más pequeño, se deben probar otras resinas disponibles comercialmente, o el desarrollo de nuevos agentes radiopacos de baja viscosidad puede mejorar la penetración de lúmenes.
En Hankeova et al.9, la DUCT se comparó con otras dos técnicas de uso común, las inyecciones dobles de tinta de carbono seguidas de limpieza de tejidos y fotografía estándar, e iDISCO+ con tinción de los vasos sanguíneos con actina de células musculares alfa-lisas y conductos biliares con citoqueratina 7, seguidas de imágenes 3D9. DUCT superó a los otros dos métodos en términos de análisis dual (que fue un desafío para iDISCO + debido a la alta autofluorescencia hepática), imágenes 3D y cuantificación (no posible con inyección de tinta de carbono) y lumenización (DUCT proporciona datos para la arquitectura interna de lúmenes y la perfusión del sistema). Como se mencionó anteriormente, la principal limitación de DUCT es el tamaño mínimo de lúmenes que se puede inyectar y analizar (límite de 5 μm), un parámetro en el que tanto la inyección de tinta de carbón como iDISCO + funcionaron mejor. DUCT es superior a la fundición de resina de sistema único3,5,6 porque permite el análisis de cada sistema inyectado por separado y también facilita la investigación 3D dual para estudiar la relación arquitectónica entre los dos sistemas.
DUCT se puede aplicar para estudiar dos redes tubulares cualesquiera en 3D. Como prueba de principio, se utilizó DUCT para visualizar los sistemas hepáticos biliar y porta y la vasculatura de la arteria pulmonar y las vías respiratorias en el pulmón9. Los conductos biliares intrahepáticos se desarrollan adyacentes a la vena porta, y la vena porta proporciona una plantilla estructural y un centro de señalización que regula el crecimiento y la diferenciación del árbol biliar12. En Hankeova et al.9, DUCT exploró la regeneración biliar en un modelo de ratón para la enfermedad pediátrica humana síndrome de Alagille. DUCT reveló mecanismos arquitectónicos previamente no reportados que el sistema biliar utilizó para lograr un volumen similar al de tipo salvaje9. Los ratones con síndrome de Alagille utilizaron dos estrategias diferentes: (1) en las regiones hiliar y central del hígado, el sistema biliar aumentó su ramificación, y (2) en la periferia hepática, los conductos biliares generados de novo fueron altamente tortuosos. Estos dos factores se combinaron para producir un volumen del sistema biliar casi normal, a pesar de la arquitectura anormal. Además, DUCT detectó ramificación anormal del conducto biliar que se produjo independientemente de la ramificación de la vena porta y los conductos biliares que forman puentes de conexión entre dos venas porta9. Estos fenotipos serían imposibles de detectar en la fundición de resina única y podrían malinterpretarse en secciones histológicas 2D como proliferación de conductos biliares. Por lo tanto, DUCT proporciona datos que describen la arquitectura 3D de dos redes tubulares a nivel de órgano o lóbulo completo con la posibilidad de un análisis cuantitativo cualitativo y en profundidad. DUCT podría ser un nuevo estándar para el desarrollo hepático postnatal y los análisis de regeneración hepática en diferentes modelos animales.

La fundición de resina de órgano es una técnica que se remonta al siglo 171. Uno de los primeros ejemplos de fundición de resina moderna se realizó en el hígado humano a partir de una autopsia. Los conductos biliares intrahepáticos se rellenaron con un agente de contraste mezclado con gelatina, seguido de imágenes con una tomografía computarizada de rayos X2. El objetivo de la técnica DUCT es visualizar, digitalizar y analizar dos redes tubulares fundidas en resina, en tándem, en 3D.
DUCT se basa en el amplio conocimiento existente de la fundición de resina hepática monosistémica3,4,5,6,7,8 y se extiende a la visualización y análisis 3D simultáneos de dos sistemas9. DUCT avanzó la fundición de resina simple a la fundición de resina doble mezclando dos resinas radiopacas de diferente contraste e inyectando estas resinas en dos redes diferentes, específicamente el conducto biliar común y la vena porta. DUCT se puede aplicar a ratones postnatales jóvenes con resultados reproducibles ya en el día postnatal 15 (P15). En comparación con las técnicas de imagen basadas en microscopía, la principal ventaja es que la DUCT es más rápida, libre de anticuerpos y la autofluorescencia del tejido hepático no interfiere con las imágenes. Además, DUCT proporciona datos cuantitativos que describen el estado de lumenización, el diámetro interno, la conectividad de red y la perfusión. Diferenciar entre la presencia de células formadoras de luz y su morfogénesis de facto en tubos es esencial para analizar órganos en los que las células ductulares están presentes pero no forman tubos, como puede ser el caso del síndrome de Alagille10. La principal desventaja de DUCT es la penetración limitada de la resina, que es viscosa y no entra en tubos con un calibre pequeño (<5 μm). El CONDUCTO se puede aplicar para cualquier estructura tubular después de determinar el punto de entrada de la inyección, como los sistemas circulatorios arterial y venoso, las vías respiratorias, el conducto biliar extrahepático o los vasos linfáticos. Por lo tanto, podría facilitar el análisis de la arquitectura de órganos completos de otros tejidos como los pulmones y el páncreas.
Las imágenes segmentadas de MicroCT se pueden procesar utilizando software de imágenes disponible comercialmente, como ImageJ, o canalizaciones escritas a medida (por ejemplo, MATLAB). El hígado inyectado con resina se puede analizar cualitativamente para la expansión y conectividad de la red o cuantitativamente para el volumen, la longitud, la ramificación, la tortuosidad de un solo sistema y la interacción entre dos sistemas, como la distancia entre dos sistemas, o la dependencia del punto de ramificación (¿el sistema 1 se ramifica en proximidad al sistema 2?). La tubería DUCT que abarca la inyección de resina, el escaneo microCT y la segmentación de datos CT, combinada con un análisis cuantitativo detallado de los mecanismos arquitectónicos de dos sistemas tubulares, podría proporcionar un estándar para el análisis de hígado completo en modelos animales.

<table><tbody><tr><td>Microtubos SafeSeal de 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de mariposa de 23 G con tubo</td><td>BD bioscience</td><td>367283</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 23 G</td><td>BD bioscience</td><td>305892</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 30 g</td><td>BD bioscience</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Top-Bio</td><td>P045</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol bencílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>108006</tr><tr><td>Benzoato de bencilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>Corning Tubos de 50 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430829-500EA</td><td>Polipropileno</td></tr><tr><td>Hisopos de algodón</td><td>Medicarier</td><td>60406</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Leica Camera AG</td><td></td><td>Leica M60</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>14190144</tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>VWR</td><td>83801.41</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Falcon 15 mL</td><td>Verkon</td><td>331.850.084.006</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas curvadas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>Fine Graefe 10 cm curvadas</td></tr><tr><td>Pinzas rectas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Fine Graefe 10 cm rectas</td></tr><tr><td>Solución de formaldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>GE Phoenix v|tome|x L 240</td><td>Waygate Technologoies</td><td></td><td>escáner de micro tomografía computarizada</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Leo Pharma Leo Pharma</td><td>B01AB01</td><td>5000 IE/mL</td></tr><tr><td>Isolfurano</td><td>Baxter</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11413413</td><td></td></tr><tr><td>MICROFIL</td><td>Flowtech</td><td>MV-122</td><td>resina sintética amarilla</td></tr><tr><td>MICROFIL</td><td>Flowtech</td><td>MV-120</td><td>resina sintética</td></tr><tr><td>azul MICROFIL</td><td>Flowtech</td><td>MV-diluyente diluyente</td> de <td>resina clara</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>Verkon</td><td>130.690.424.503</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>AgnThos</td><td>010.6131.M20</td><td></td></tr><tr><td>phoenix datos|x 2.0 software</td><td>Baker Hughes</td><td></td><td>CT software de reconstrucción de datos</td></tr><tr><td>Balancín</td><td>VWR</td><td>444-0142</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de seda</td><td>AgnThos</td><td>14757</td><td>Seda negra, 4-0, estéril, 100 m</td></tr><tr><td>Tijera para piel</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Iris punta recta 9 cm</td></tr><tr><td>Tijera de muelle</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td>Vannas micro, punta recta 2 mm</td></tr><tr><td>Jeringa 1 mL Luer</td><td></td><td>BD bioscience</td> 303172 <td></td></tr><tr><td>Tubo PE10</td><td>BD bioscience</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Tubo PE50</td><td>BD bioscience</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>VG Software Studio MAX 3.3</td><td>Volume Graphics GmbH</td><td></td><td>CT software de procesamiento y análisis de datos</td></tr></tbody></table>

duct: fundición de doble resina seguida de tomografía microcomputarizada para análisis hepático 3d

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

El hígado es el órgano interno más grande en humanos y ratones, y la alta autofluorescencia presenta un desafío significativo para evaluar la arquitectura tridimensional (3D) del órgano a nivel de todo el órgano. La arquitectura hepática se caracteriza por múltiples estructuras lumenizadas ramificadas, que pueden llenarse con resina, incluidos árboles vasculares y biliares, estableciendo un patrón altamente estereotipado en el parénquima rico en hepatocitos. Este protocolo describe la tubería para realizar tomografía microcomputarizada de doble fundición de resina, o "DUCT". DUCT implica inyectar la vena porta y el conducto biliar común con dos resinas sintéticas radiopacas diferentes, seguidas de la fijación del tejido. El control de calidad mediante la limpieza de un lóbulo, o todo el hígado, con un agente de limpieza óptica, permite la preselección de muestras inyectadas adecuadamente. En la segunda parte de la tubería DUCT, se puede utilizar un lóbulo o todo el hígado para la tomografía microcomputarizada (microCT), la segmentación (semi)automatizada y la representación 3D de las redes venosas y biliares portales. MicroCT da como resultado datos de coordenadas 3D para las dos resinas, lo que permite un análisis cualitativo y cuantitativo de los dos sistemas y su relación espacial. DUCT se puede aplicar al hígado de ratón postnatal y adulto y se puede extender aún más a otras redes tubulares, por ejemplo, redes vasculares y vías respiratorias en los pulmones.

Qué hacer La inyección exitosa de doble resina se logra cuando tanto los conductos biliares intrahepáticos como la vasculatura de la vena porta están bien llenos. Como paso de control de calidad, la limpieza de un lóbulo (por ejemplo, el lóbulo lateral izquierdo) permite la verificación de una inyección exitosa, seguida de imágenes de lóbulos de interés. El lóbulo ópticamente despejado se puede escanear más tarde utilizando microCT; por lo tanto, es posible limpiar ópticamente todo el hígado. En el hígado de ratón bien inyectado, la vasculatura de la vena porta debe llenarse con resina hasta que la periferia del hígado y la resina deben ser visibles en las ramas laterales (Figura 4), y esta arquitectura se recapitula fielmente en datos escaneados y segmentados por microCT. Además, los conductos biliares intrahepáticos bien inyectados deben ser visibles junto a las ramas principales de la vena porta que se extienden casi hasta la periferia, y la resina debe ser visible en las ramas laterales principales. Si el lóbulo de control pasa el paso de control de calidad, los lóbulos de interés (incluido el ópticamente despejado) se pueden escanear con microCT. El resultado de los datos segmentados de un hígado bien inyectado se muestra para un ratón P15 (Figura 4A, B) y un ratón adulto (Figura 4C, D).
Qué no hacer El tejido hepático intacto es un requisito previo para una inyección exitosa. Tenga especial cuidado al cortar la cavidad abdominal y el diafragma para no cortar accidentalmente el tejido hepático. Si hay daño físico al hígado durante este procedimiento, es muy probable que la resina se escape durante la inyección de la vena porta (Figura 5A). No es posible lograr una buena inyección del sistema vascular si el hígado está físicamente dañado.
Uno de los errores comunes es rellenar el hígado con resina que puede conducir a desafíos para la visualización o el análisis. Una de las causas del relleno insuficiente del sistema es el endurecimiento prematuro de la resina en la aguja o la punta del tubo antes de que se complete la inyección (Figura 5B, puntas de flecha azules, los soportes representan burbujas grandes). Una buena práctica es usar un juego de inyección por animal y trabajar rápido después de que el agente de curado se agrega a la resina. Si la resina se endurece durante la inyección (lo que se puede observar mediante un sistema medio lleno, aquí ejemplificado con una vasculatura de vena porta medio llena) retire el tubo, corte la punta del tubo (siempre en diagonal para crear una punta biselada) y empuje el émbolo. Si la resina comienza a gotear de nuevo, vuelva a insertar cuidadosamente el tubo y asegúrelo con la sutura. Si la resina se ha endurecido en la aguja, reemplace el tubo por completo, llénelo con resina (evitando burbujas), vuelva a insertar cuidadosamente el tubo y asegúrelo con la sutura. Puede ser difícil reemplazar el tubo, especialmente en ratones postnatales jóvenes <p30 ya que el tejido es m fr otra causa de un mal llenado resina la vasculatura vena porta puede ser perfusi transc insuficiente class="xfig">Figura 5C, las puntas de flecha azules denotan sangre visible en las ramas terminales). Esto se puede observar cuando las puntas de los vasos están llenas de sangre en lugar de resina. Para evitar esto, asegúrese de que la vena porta (fuera del hígado) no contenga sangre antes de la inyección. La tercera causa de hígado poco lleno es cuando el tubo se inserta demasiado profundo en el hígado y entra en una rama hacia uno de los lóbulos. Para evitar esto, inserte el tubo a un mínimo de 0,5 cm desde la entrada al hígado.</p30>
Por el contrario, uno o ambos sistemas se llenan en exceso de resina (Figura 5D). Es necesario controlar visualmente el hígado durante toda la inyección. La fundición del sistema biliar con resina es más desafiante que la fundición de resina de vena porta, ya que los conductos llenos de resina solo son débilmente visibles en la superficie del hígado, y es difícil evaluar cuándo el sistema está casi lleno y cuándo detenerse. Cuando aparecen pequeños puntos de resina amarilla en la superficie del hígado (Figura 2Ci, punta de flecha azul), esto es una señal de que el sistema biliar está completamente lleno y la resina está comenzando a filtrarse fuera de los conductos. Las fugas menores de resina se pueden corregir manualmente durante la segmentación de datos microCT (Figura 5D, paneles derechos).
Si la presión de inyección es demasiado alta, esto puede causar la ruptura de vasos o conductos (Figura 5E), dañando irreversiblemente la arquitectura del recipiente o conducto. El hígado no será adecuado para la exploración o análisis microCT. Para evitar el sobrellenado de resina, optimice el volumen y la presión correctos utilizados para la inyección en cada modelo de ratón. Cuando se trabaja con ratones que han sido desafiados con una dieta tóxica, modificación genética o lesión hepática que afecta los sistemas biliar o venoso, o rigidez hepática, la presión y el volumen de la inyección pueden necesitar ser ajustados ya que el volumen y la presión tolerados pueden ser diferentes de los ratones de tipo salvaje. Este protocolo describe la inyección manual de los dos sistemas, pero es posible conectar la jeringa a una bomba para estandarizar la presión de inyección. Las burbujas son otro artefacto de inyección muy común que conduce a un llenado escaso de las redes tubulares (Figura 5F-H, puntas de flecha azules). Para evitar la formación de burbujas, asegúrese de que la jeringa y el tubo no contengan burbujas, estén completamente llenos de resina y que la resina gotee de la punta del tubo antes de la inyección. Las pequeñas burbujas que aparecen como áreas negativas en los datos de microCT se pueden corregir manualmente durante los pasos posteriores al procesamiento, aunque esto es laborioso.
Fresco es lo mejor El uso de resina amarilla fresca es un factor crucial, que afecta significativamente el contraste de las dos resinas y la segmentación de datos microCT. Cuando se utiliza la resina recién abierta (Figura 6A) hay una clara diferencia en el contraste entre los conductos biliares inyectados con resina amarilla (blanco brillante) y las venas porta inyectadas con resina verde (gris brillante). El hígado que se inyecta con resina fresca se procesa fácilmente utilizando umbrales globales automatizados. Con el almacenamiento prolongado, la resina precipita y el contraste disminuye. Después de 3 meses de almacenamiento, el contraste aún puede ser suficiente para distinguir la vena porta del conducto biliar (Figura 6B), pero la precipitación afecta la mezcla de las dos resinas, que es visible como una opacidad heterogénea en la vena porta llena (Fig. 6B, puntas de flecha azules). El contraste heterogéneo afecta negativamente al umbral automatizado y requiere correcciones manuales, lo que aumenta el tiempo de procesamiento. Si la resina tiene más de seis meses, el contraste se ha degradado hasta un punto en el que no es posible distinguir el conducto biliar inyectado de amarillo de la vena porta inyectada de color verde basándose solo en su contraste (Figura 6C). En este caso, el conducto biliar y la vena porta deben segmentarse manualmente en función de su diámetro y posición en la región hiliar y seguirse manualmente a lo largo de todos los datos de microCT. Este procedimiento es extremadamente lento y es mejor evitarlo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig01.jpg"> Figura 1: Juego de inyección para fundición de resina. (A) El juego de inyección # 1 comprende una aguja de 30 G y un tubo de PE10 que mide ~ 30 cm de largo. El juego de inyección # 2 se compone de una aguja de 23 G y un tubo de PE50 de ~ 30 cm de largo. (B) La punta del tubo se estira y se corta en ángulo para crear una punta biselada. La regla en A y B es una regla de centímetros, con incrementos mayores de 1 cm, incrementos intermedios de 5 mm e incrementos menores de 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig02.jpg"> Figura 2: Diagrama de flujo de fundición de resina doble. (A) Esquema que muestra el sistema circulatorio venoso murino y el corazón con la aurícula derecha resaltada, que debe cortarse antes de la perfusión, y el ventrículo izquierdo en el que se debe insertar la aguja para la perfusión para lavar la sangre del sistema circulatorio. La vena cava inferior debe cortarse debajo de los riñones para aliviar la presión vascular. (B) Diagrama de flujo de inyección de resina de conducto biliar. (i) Imagen de zoom de (A) que representa dónde cortar el IVC. (ii) Imagen que representa el conducto biliar común (línea punteada amarilla) desde la región hiliar del hígado hasta el esfínter de Oddi (puntas de flecha negras), con hilo de sutura debajo del conducto biliar común despejado. (iii) Posición adecuada para el nudo suelto alrededor del conducto biliar común. (iv) La línea punteada amarilla y las puntas de flecha negras etiquetan el esfínter de Oddi, demostrando el ángulo oblicuo para la incisión y cómo debe aparecer la abertura después de la incisión del ángulo oblicuo. (v) Esquema que demuestre la orientación de la abertura cónico del tubo PE10 (hacia arriba) al insertarse. vi) Aspecto de la resina amarilla que se inyecta; la resina debe pasar fácilmente el nudo suelto. IVC: vena cava inferior; CBD, conducto biliar común. (C) Diagrama de flujo de inyección de resina de vena porta. (i) La línea punteada verde marca la vena porta de la región hiliar. Las puntas de flecha azules etiquetan el sistema biliar sobrecargado. (ii) Ubicación adecuada para nudos sueltos alrededor de la vena porta. (iii) Esquema que demuestra la abertura cónica (hacia arriba) en el momento de la inserción. iv) Aparición del hígado tras la inyección de resina verde y resina amarilla; observe el vaso sanguíneo lleno de resina en la periferia del hígado. PV, vena porta. La figura 2A se creó con Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig03.jpg"> Figura 3: Procesamiento de datos micro CT en software de gráficos de volumen. (A) Determinación de la superficie, (i) isovalor sobreestimado (la vista previa actual de la selección se muestra en color amarillo), (ii) isovalor subestimado, (iii) selección óptima del isovalor para la determinación adecuada de la superficie de la vena porta y los conductos biliares. (B) Dividir la región de interés (ROI) creada por la determinación de la superficie, (i) establecer el valor en la ventana de diálogo lo suficientemente alto como para que solo quede un segmento (el más grande), (ii) en marcos amarillos se muestran las partículas más pequeñas (excluidas). (C) Suavizado superficial de los datos, (i) la función de suavizado está en el panel izquierdo, (ii) establecer la resistencia de suavizado en 1 (máx. 2) y crear un nuevo ROI suavizado, (iii) datos suavizados. (D) Separación de sistemas tubulares individuales, (i) en la función de determinación de superficie establecer el isovalor de modo que solo se incluya el sistema biliar en la selección (la vista previa actual de la selección se muestra en color amarillo), (ii) marcar el ROI de ambos sistemas y el ROI de solo el sistema biliar y restar el ROI del sistema biliar del ROI de ambos sistemas, (iii) Vena porta mostrada en gris, el sistema biliar mostrado en verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig04.jpg"> Figura 4: Sistemas de conducto biliar (BD) y vena porta (PV) bien inyectados. (A) Lóbulo medial derecho (RML) limpiado ópticamente del hígado postnatal día 15 (P15) inyectado con dos resinas en los dos sistemas. Barra de escala 1 mm. (B) Representación 3D de P15 RML que se muestra en (A) que representa la vasculatura de la vena porta en blanco y el sistema biliar en verde. Barra de escala 1 mm. (C) RML ópticamente despejado de hígado adulto inyectado con dos resinas en los dos sistemas. Barra de escala 1 mm. (D) Representación 3D de RML adulto que se muestra en (C) que representa la vasculatura de la vena porta en blanco y el sistema biliar en verde. H = hiliar, P = periférico. Barra de escala 1 mm. Los paneles A, B, D se adaptan con permiso de Hankeova et al.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig05.jpg"> Figura 5: Desafíos comunes de las inyecciones hepáticas de doble resina. (A) La imagen muestra un hígado que fue cortado accidentalmente durante la apertura inicial de la cavidad abdominal, y la resina se filtra a través del corte (punta de flecha azul). (B) Sistema de vena porta mal inyectado debido al endurecimiento de la resina. Las puntas de flecha azules etiquetan las ramas terminales vacías y los corchetes rojos etiquetan burbujas grandes. Barra de escala 1 mm. (C) Sistema de vena porta mal inyectado debido a una perfusión transcárdica deficiente. Las puntas de flecha azules etiquetan la sangre visible en las ramas terminales. Barra de escala 1 mm. (D) Sistema biliar sobrecargado que se manifiesta por bolas aisladas de resina. Los paneles izquierdos muestran el hígado ópticamente despejado, y los paneles derechos muestran la imagen renderizada en microCT 3D. Los contornos punteados azules representan regiones de zoom. Las puntas de flecha negras etiquetan una parte del hígado que se dañó durante el aclaramiento óptico después de la exploración microCT. Barra de escala 1 mm. (E) La alta presión durante la inyección de resina puede causar la ruptura de la vena porta (el animal en este panel lleva una mutación Jag1H268Q), marcada por puntas de flecha azules. Barra de escala 1 mm. (F) Burbujas en la resina durante la inyección de la vena porta (puntas de flecha azules) y (G) inyección del sistema biliar (punta de flecha azul), barra de escala 1 mm. (H) Escaneo microCT de burbujas (punta de flecha azul), ramas terminales mal llenas (corchetes rojos) y fuga de resina (punta de flecha amarilla), barra de escala 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig06.jpg"> Figura 6: Contraste diferencial de resina. (A) La resina amarilla recién abierta genera suficiente contraste para distinguir la vena porta inyectada de resina (gris) y los conductos biliares (blanco). (B) Tres meses de almacenamiento de resina amarilla conducen a la precipitación de la resina, lo que resulta en una opacidad heterogénea (vena porta gris-blanca, punta de flecha azul). (C) El almacenamiento prolongado (&gt;6 meses) de resina amarilla disminuye el contraste entre la vena porta (gris) y los conductos biliares (gris). Barra de escala 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La tomografía microcomputarizada de doble fundición de resina, o DUCT, permite la visualización, digitalización y segmentación de dos sistemas tubulares simultáneamente para facilitar el análisis 3D de la arquitectura de órganos. DUCT combina la inyección ex vivo de dos resinas radiopacas seguida de la tomografía microcomputarizada y la segmentación de los datos tomográficos.

DUCT: Fundición de doble resina seguida de tomografía microcomputarizada para análisis hepático 3D

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

Este método nos permite analizar, visualizar y cuantificar la arquitectura de los sistemas vascular y biliar hepático en 3D. Ahora podemos comprender mejor los aspectos espaciales de la enfermedad hepática y la regeneración. La principal ventaja de esta técnica es que no se basa en la existencia de anticuerpos ni imágenes de fluorescencia.También permite la visualización directa de qué redes están correctamente lumenizadas. Este método es adecuado para el análisis de sistemas tubulares, por lo tanto, la investigación de los vasos sanguíneos, los conductos biliares y las vías respiratorias son áreas ideales. Utilizamos DUCT para comprender los cambios estructurales relacionados con la regeneración biliar.Antes de inyectar resina en el sistema biliar del ratón, comience a mover el intestino y el páncreas hacia el lado izquierdo del ratón, utilizando un hisopo de algodón humedecido con PBS para exponer el conducto biliar común y la vena porta. Luego haga una pequeña incisión transversal en la vena cava inferior. Voltee el lado ventral del hígado hacia el corazón para exponer la superficie visceral y la región hiliar, y localice el conducto biliar común que va desde la región hiliar a través del páncreas y hacia el intestino en el esfínter de Oddi.Use las pinzas rectas para limpiar el área del tejido circundante de aproximadamente cinco milímetros del conducto biliar común. Luego, colocando un hilo de sutura de seda debajo del conducto biliar común, ate un nudo suelto alrededor del conducto biliar común. Sostenga las tijeras de resorte planas contra el conducto biliar común para hacer una incisión oblicua en el conducto biliar común en el lugar donde el conducto biliar común ingresa al páncreas y al intestino junto al esfínter de Oddi.A continuación, mezcle un mililitro de resina amarilla con 50 microlitros del agente de curado MV y llene una jeringa luer de un mililitro con la mezcla de agente de curado de resina. Conecte la jeringa llena con el conjunto de tubos uno y presione el émbolo para llenar el tubo hasta que la mezcla de agente de curado de resina gotee desde la punta del tubo. Use los fórceps para enderezar el área alrededor de la incisión del conducto biliar común.Antes de insertar el tubo en la abertura en el conducto biliar común con el borde más largo de la punta biselada hacia abajo hacia el lado dorsal del conducto biliar. Luego apriete el nudo del hilo de seda para asegurar el tubo dentro del conducto biliar común. Después de inyectar la resina en el conducto biliar común, observe la vesícula biliar y los lóbulos hepáticos individuales.Masajee el hígado con un hisopo de algodón humedecido con PBS para ayudar a distribuir la resina por igual. Las ramas terminales de los conductos biliares llenos de resina serán débilmente visibles en la superficie del hígado. Deje de inyectar la resina cuando aparezcan puntos de resina en la superficie del hígado o cuando se encuentre resistencia.Luego retire el tubo sacando del conducto biliar común y apriete rápidamente el nudo de seda con fórceps para evitar que la resina se filtre. Corte los extremos sueltos de la sutura de seda, para que no interfieran con la inyección de la vena porta. Antes de inyectar la resina en la vena porta, limpie la vena porta de su tejido circundante a unos dos centímetros de su entrada al hígado, usando fórceps rectos.Luego coloque el hilo de sutura de seda debajo del área despejada de la vena porta para atar un nudo suelto por encima. En la vena porta distal al hígado, haga una incisión longitudinal antes de atar el nudo. A continuación, prepare la mezcla de agente de curado de resina verde en la jeringa y llene el tubo con la mezcla como se demostró anteriormente.Use las pinzas para enderezar la vena porta tirando del tejido circundante hacia el lado de la cola antes de insertar el tubo con el borde más largo de la punta biselada hacia el lado dorsal del vaso. Apriete el hilo de seda para asegurar el tubo en la vena porta. Después de inyectar la resina en la vena porta, observe los vasos sanguíneos que se llenan de resina y masajee el hígado con un hisopo de algodón humedecido con PBS para ayudar a difundir la resina.Cuando todos los vasos sanguíneos estén llenos, saque el tubo de la vena porta y apriete rápidamente el nudo de seda con fórceps para evitar que la resina se filtre. Para la tomografía microcomputarizada o la microtcografía computarizada del hígado disecado del ratón, coloque el lóbulo hepático medial derecho en un tubo cónico de 15 mililitros y llene el tubo con gel de agarosa al 1% hasta aproximadamente dos tercios del volumen total del tubo para minimizar el movimiento no deseado de la muestra durante la medición de MicroCT. Monte el tubo cónico de 15 mililitros con la muestra en la etapa de rotación de un dispositivo de TC.Permita que el tubo se adapte térmicamente a la cámara de medición durante al menos una hora. Cuando la muestra esté adaptada térmicamente, céntrela en el campo de visión o FOV, luego optimice la muestra de origen y las distancias del detector de muestra, o SSD y SDD para alcanzar una resolución de vóxel suficiente. Una vez que se hayan establecido los parámetros, inicie una medición de TC.Utilice un software de reconstrucción tomográfica dedicado para reconstruir los datos de la TC. Para analizar los datos de CT, cargue los archivos seleccionando archivo, importar y comando. Utilice la función de determinación de superficie en el panel superior para segmentar la resina en los datos utilizando el umbral global.En la ventana de diálogo, determine el valor umbral con la evaluación del histograma estableciendo la posición de la línea de isovalor rojo para segmentar solo los recipientes llenos de resina. En el panel izquierdo, seleccione el módulo crear ROI a partir de volumen o CAD o malla para crear una región de interés o ROI de los recipientes llenos de resina. En la ventana de diálogo, utilice la opción crear ROI a partir de sólido para seleccionar y confirmar el nombre del volumen procesado.Elimine la segmentación errónea de los clústeres de ruido en la región de fondo de este ROI. Marque el ROI en el panel derecho haciendo clic con el botón derecho y seleccionando el ROI dividido del módulo. En la ventana de diálogo, establezca el parámetro de vóxel de volumen mínimo para excluir todas las partículas de ruido.El valor del parámetro es experimental y dependiente de los datos, y está optimizado para cada muestra que se va a analizar. En el panel izquierdo, use el módulo de suavizado para crear máscaras de canal lisas, continuas y sólidas sin artefactos, como la presencia de burbujas de aire o fugas de resina en el ROI del costo de la resina. Cree un ROI separado como se describió anteriormente para el sistema lleno de la resina más absorbente como la resina amarilla utilizada para la inyección del conducto biliar común con valores de intensidad más altos en los datos de TC.Marque y enmascare el nuevo ROI haciendo clic con el botón derecho antes de seleccionar restar ROI y, a continuación, restando el nuevo ROI del ROI de la máscara de resina para crear un nuevo ROI para el sistema tubular restante. Exporte los ROI resultantes para ambos sistemas tubulares en varios formatos basados en referencias de operadores para su posterior procesamiento en diferentes softwares. Procese aún más los ROI resultantes en un software de gráficos de volumen para exportar la visualización final en forma de imagen o video.En este estudio, se logró una inyección doble de resina exitosa con conductos biliares intrahepáticos bien llenos y vasculatura de la vena porta. El análisis representativo ilustra el resultado de los datos segmentados de un hígado bien inyectado para un ratón P15 y un ratón adulto donde la resina es visible en las ramas laterales. En el ejemplo típico de inyección fallida, el daño físico al hígado durante el procedimiento quirúrgico resultó en la fuga de resina.También el endurecimiento prematuro de la resina en la aguja o la punta del tubo antes de la inyección, y la perfusión transcárdica insuficiente causaron un subllenado del sistema. La fuga menor de resina podría corregirse manualmente durante la segmentación de datos MicroCT. La alta presión de inyección podría romper vasos o conductos, y dañar irreversiblemente el vaso o la arquitectura del conducto.Además, las burbujas eran otro artefacto de inyección muy común que conducía al escaso llenado de las redes tubulares. Cuando se utilizó resina recién abierta, se observó una clara diferencia en el contraste entre los conductos biliares inyectados con resina amarilla y las venas porta inyectadas con resina verde. Después de tres meses de almacenamiento, el contraste fue suficiente para distinguir la vena porta del conducto biliar.Sin embargo, la precipitación afectó a la mezcla de las dos resinas, que fue visible como una opacidad heterogénea en la vena porta llena. Cuando la resina tenía más de seis meses, el contraste se degradaba hasta un punto en el que era inviable distinguir el conducto biliar inyectado de amarillo de la vena porta inyectada en verde, basándose solo en su contraste. Es crucial hacer una incisión oblicua en el conducto biliar común.De lo contrario, será muy difícil insertar el tubo. La técnica DUCT ilumina nuevos mecanismos arquitectónicos de regeneración biliar en un modelo clínicamente relevante con características distintivas en las regiones del lóbulo hiliar y periférico.

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