DUCT: Fundición de doble resina seguida de tomografía microcomputarizada para análisis hepático 3D

Este método nos permite analizar, visualizar y cuantificar la arquitectura de los sistemas vascular y biliar hepático en 3D. Ahora podemos comprender mejor los aspectos espaciales de la enfermedad hepática y la regeneración. La principal ventaja de esta técnica es que no se basa en la existencia de anticuerpos ni imágenes de fluorescencia.

También permite la visualización directa de qué redes están correctamente lumenizadas. Este método es adecuado para el análisis de sistemas tubulares, por lo tanto, la investigación de los vasos sanguíneos, los conductos biliares y las vías respiratorias son áreas ideales. Utilizamos DUCT para comprender los cambios estructurales relacionados con la regeneración biliar.

Antes de inyectar resina en el sistema biliar del ratón, comience a mover el intestino y el páncreas hacia el lado izquierdo del ratón, utilizando un hisopo de algodón humedecido con PBS para exponer el conducto biliar común y la vena porta. Luego haga una pequeña incisión transversal en la vena cava inferior. Voltee el lado ventral del hígado hacia el corazón para exponer la superficie visceral y la región hiliar, y localice el conducto biliar común que va desde la región hiliar a través del páncreas y hacia el intestino en el esfínter de Oddi.

Use las pinzas rectas para limpiar el área del tejido circundante de aproximadamente cinco milímetros del conducto biliar común. Luego, colocando un hilo de sutura de seda debajo del conducto biliar común, ate un nudo suelto alrededor del conducto biliar común. Sostenga las tijeras de resorte planas contra el conducto biliar común para hacer una incisión oblicua en el conducto biliar común en el lugar donde el conducto biliar común ingresa al páncreas y al intestino junto al esfínter de Oddi.

A continuación, mezcle un mililitro de resina amarilla con 50 microlitros del agente de curado MV y llene una jeringa luer de un mililitro con la mezcla de agente de curado de resina. Conecte la jeringa llena con el conjunto de tubos uno y presione el émbolo para llenar el tubo hasta que la mezcla de agente de curado de resina gotee desde la punta del tubo. Use los fórceps para enderezar el área alrededor de la incisión del conducto biliar común.

Antes de insertar el tubo en la abertura en el conducto biliar común con el borde más largo de la punta biselada hacia abajo hacia el lado dorsal del conducto biliar. Luego apriete el nudo del hilo de seda para asegurar el tubo dentro del conducto biliar común. Después de inyectar la resina en el conducto biliar común, observe la vesícula biliar y los lóbulos hepáticos individuales.

Masajee el hígado con un hisopo de algodón humedecido con PBS para ayudar a distribuir la resina por igual. Las ramas terminales de los conductos biliares llenos de resina serán débilmente visibles en la superficie del hígado. Deje de inyectar la resina cuando aparezcan puntos de resina en la superficie del hígado o cuando se encuentre resistencia.

Luego retire el tubo sacando del conducto biliar común y apriete rápidamente el nudo de seda con fórceps para evitar que la resina se filtre. Corte los extremos sueltos de la sutura de seda, para que no interfieran con la inyección de la vena porta. Antes de inyectar la resina en la vena porta, limpie la vena porta de su tejido circundante a unos dos centímetros de su entrada al hígado, usando fórceps rectos.

Luego coloque el hilo de sutura de seda debajo del área despejada de la vena porta para atar un nudo suelto por encima. En la vena porta distal al hígado, haga una incisión longitudinal antes de atar el nudo. A continuación, prepare la mezcla de agente de curado de resina verde en la jeringa y llene el tubo con la mezcla como se demostró anteriormente.

Use las pinzas para enderezar la vena porta tirando del tejido circundante hacia el lado de la cola antes de insertar el tubo con el borde más largo de la punta biselada hacia el lado dorsal del vaso. Apriete el hilo de seda para asegurar el tubo en la vena porta. Después de inyectar la resina en la vena porta, observe los vasos sanguíneos que se llenan de resina y masajee el hígado con un hisopo de algodón humedecido con PBS para ayudar a difundir la resina.

Cuando todos los vasos sanguíneos estén llenos, saque el tubo de la vena porta y apriete rápidamente el nudo de seda con fórceps para evitar que la resina se filtre. Para la tomografía microcomputarizada o la microtcografía computarizada del hígado disecado del ratón, coloque el lóbulo hepático medial derecho en un tubo cónico de 15 mililitros y llene el tubo con gel de agarosa al 1% hasta aproximadamente dos tercios del volumen total del tubo para minimizar el movimiento no deseado de la muestra durante la medición de MicroCT. Monte el tubo cónico de 15 mililitros con la muestra en la etapa de rotación de un dispositivo de TC.

Permita que el tubo se adapte térmicamente a la cámara de medición durante al menos una hora. Cuando la muestra esté adaptada térmicamente, céntrela en el campo de visión o FOV, luego optimice la muestra de origen y las distancias del detector de muestra, o SSD y SDD para alcanzar una resolución de vóxel suficiente. Una vez que se hayan establecido los parámetros, inicie una medición de TC.

Utilice un software de reconstrucción tomográfica dedicado para reconstruir los datos de la TC. Para analizar los datos de CT, cargue los archivos seleccionando archivo, importar y comando. Utilice la función de determinación de superficie en el panel superior para segmentar la resina en los datos utilizando el umbral global.

En la ventana de diálogo, determine el valor umbral con la evaluación del histograma estableciendo la posición de la línea de isovalor rojo para segmentar solo los recipientes llenos de resina. En el panel izquierdo, seleccione el módulo crear ROI a partir de volumen o CAD o malla para crear una región de interés o ROI de los recipientes llenos de resina. En la ventana de diálogo, utilice la opción crear ROI a partir de sólido para seleccionar y confirmar el nombre del volumen procesado.

Elimine la segmentación errónea de los clústeres de ruido en la región de fondo de este ROI. Marque el ROI en el panel derecho haciendo clic con el botón derecho y seleccionando el ROI dividido del módulo. En la ventana de diálogo, establezca el parámetro de vóxel de volumen mínimo para excluir todas las partículas de ruido.

El valor del parámetro es experimental y dependiente de los datos, y está optimizado para cada muestra que se va a analizar. En el panel izquierdo, use el módulo de suavizado para crear máscaras de canal lisas, continuas y sólidas sin artefactos, como la presencia de burbujas de aire o fugas de resina en el ROI del costo de la resina. Cree un ROI separado como se describió anteriormente para el sistema lleno de la resina más absorbente como la resina amarilla utilizada para la inyección del conducto biliar común con valores de intensidad más altos en los datos de TC.

Marque y enmascare el nuevo ROI haciendo clic con el botón derecho antes de seleccionar restar ROI y, a continuación, restando el nuevo ROI del ROI de la máscara de resina para crear un nuevo ROI para el sistema tubular restante. Exporte los ROI resultantes para ambos sistemas tubulares en varios formatos basados en referencias de operadores para su posterior procesamiento en diferentes softwares. Procese aún más los ROI resultantes en un software de gráficos de volumen para exportar la visualización final en forma de imagen o video.

En este estudio, se logró una inyección doble de resina exitosa con conductos biliares intrahepáticos bien llenos y vasculatura de la vena porta. El análisis representativo ilustra el resultado de los datos segmentados de un hígado bien inyectado para un ratón P15 y un ratón adulto donde la resina es visible en las ramas laterales. En el ejemplo típico de inyección fallida, el daño físico al hígado durante el procedimiento quirúrgico resultó en la fuga de resina.

También el endurecimiento prematuro de la resina en la aguja o la punta del tubo antes de la inyección, y la perfusión transcárdica insuficiente causaron un subllenado del sistema. La fuga menor de resina podría corregirse manualmente durante la segmentación de datos MicroCT. La alta presión de inyección podría romper vasos o conductos, y dañar irreversiblemente el vaso o la arquitectura del conducto.

Además, las burbujas eran otro artefacto de inyección muy común que conducía al escaso llenado de las redes tubulares. Cuando se utilizó resina recién abierta, se observó una clara diferencia en el contraste entre los conductos biliares inyectados con resina amarilla y las venas porta inyectadas con resina verde. Después de tres meses de almacenamiento, el contraste fue suficiente para distinguir la vena porta del conducto biliar.

Sin embargo, la precipitación afectó a la mezcla de las dos resinas, que fue visible como una opacidad heterogénea en la vena porta llena. Cuando la resina tenía más de seis meses, el contraste se degradaba hasta un punto en el que era inviable distinguir el conducto biliar inyectado de amarillo de la vena porta inyectada en verde, basándose solo en su contraste. Es crucial hacer una incisión oblicua en el conducto biliar común.

De lo contrario, será muy difícil insertar el tubo. La técnica DUCT ilumina nuevos mecanismos arquitectónicos de regeneración biliar en un modelo clínicamente relevante con características distintivas en las regiones del lóbulo hiliar y periférico.