Name: Detección de la expresión del receptor acoplado a la proteína G en neuronas aferentes vagas de ratón mediante hibridación multiplex in situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprenda a detectar la expresión de receptores acoplados a proteína G en neuronas vagales de ratón mediante hibridación in situ multiplex. Este método permite mapear perfiles transcripcionales con alta sensibilidad.

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Este trabajo fue apoyado por el Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core financiado por la subvención de los NIH #5P01DK119130-02. Los autores desean agradecer la asistencia del UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (encabezado por el Dr. Phelps) y su personal (Abhijit Bugde y Marcel Mettlen), apoyado en parte por la Subvención nih #1S10OD021684-01, un recurso compartido del Centro Oncológico Harold C. Simmons, apoyado en parte por una subvención de apoyo del Centro Oncológico del NCI, P30 CA142543.

NOTA: Los ratones utilizados en este estudio eran machos de tipo salvaje en un fondo puro de C57BL / 6J. Se utilizaron un total de 4 ratones para multiplex ISH. Todos los ratones tenían aproximadamente 8 semanas de edad en el momento del sacrificio. También se utilizó un ratón macho (aproximadamente de un año de edad) para demostrar la fluorescencia endógena asociada con el envejecimiento. Los animales fueron alojados en jaulas ventiladas dentro de una instalación de barrera con acceso ad libitum a alimentos y agua. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UT Southwestern Medical Center revisó y aprobó los procedimientos que se describen a continuación. Los detalles sobre reactivos y herramientas se pueden encontrar en la Tabla de Materiales.
1. Recogida de muestras
<ol><li>El día del sacrificio, administrar una sobredosis de hidrato de cloral (500 mg/kg, i.p.) a los ratones. Perfundir los ratones profundamente anestesiados transcárdicamente utilizando una bomba peristáltica con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) seguida de 50 ml de formalina al 10% a temperatura ambiente. NOTA: Esto se hace en una campana extractora de humos para evitar la inhalación de formalina.</li>
	<li>Como los ganglios nodosos, petrosales y yugulares se fusionan para formar una sola masa ganglionar en elratón 15,recoja cuidadosamente toda la masa ganglionar vagal de cada lado (izquierda y derecha) con la ayuda de un endoscopio de disección y tijeras y fórceps de resorte fino (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Al decapitar al ratón con un par de tijeras grandes (consulte la Tabla de materiales),evite aplastar el tronco encefálico.</li>
	<li>Siguiendo un enfoque de disección descrito anteriormente en larata 40,retire los músculos esternohioideo y omohioideo lateral a la tráquea con pequeñas pinzas(Tabla de Materiales)para exponer el hueso occipital. Limpie toda la región del músculo, el tejido adiposo y el tejido conjuntivo hasta que la arteria carótida, el nervio vago, el nervio hipogloso y el foramen magnum sean visibles. Cortar todo el nervio hipogloso con pequeñas tijeras de resorte(Tabla de Materiales).</li>
	<li>Busque el ganglio de dosis como una masa translúcida cerca del foramen magnum15. Usando tijeras pequeñas(Tabla de Materiales),rompa cuidadosamente el hueso occipital para exponer aún más el ganglio yugular. Busque melanocitos negros en la superficie de la yugular como un hito visual.</li>
	<li>Corte las uniones nerviosas entre la masa ganglionar vagal y extraiga toda la masa ganglionar tirando suavemente del extremo periférico del nervio vago mientras corta simultáneamente el ganglio yugular hacia el tronco encefálico con pequeñas tijeras de resorte(Tabla de materiales).</li>
	<li>Elimine el tejido conjuntivo y la grasa que se adhieren al nervio vago y la masa ganglionar tanto como sea posible.</li>
	<li>Como es fácil perder un ganglio durante la transferencia de un tubo al otro, mantenga ~ 0,5 cm del nervio vago para facilitar el manejo y la localización de las muestras.</li>
	<li>Colocar los ganglios con la ayuda de fórceps finos en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e incubar a 4 °C en foralina durante 24 h y con sacarosa al 30% durante otras 24 h.</li>
	<li>Coloque los ganglios dentro de una pequeña gota (~ 4 mm Ø) de temperatura óptima de corte (OCT) media en una pieza de papel de aluminio. A continuación, congele la muestra en un lecho de hielo seco.</li>
	<li>Cortar las muestras con un criostato a -20 °C en secciones de 14 μm de espesor y recoger en portaobjetos de microscopio de vidrio como 3 series a 42 μm de distancia. NOTA: Evite colocar secciones cerca de los bordes de la diapositiva. Para ahorrar reactivos, mantenga las secciones de tejido lo más apretadas posible, pero sin superponerse.</li>
	<li>Guarde las muestras en un congelador de -80 °C hasta que sea necesario para ISH durante al menos 6 meses. NOTA: Consulte la Figura 1 para solucionar problemas de fluorescencia endógena.</li>
</ol>2. Pretratamiento e ISH
<ol><li>Antes del día de los experimentos, la cristalería de laboratorio en autoclave se utilizará para ISH, incluidos los platos de tinción y el lavado de frascos de tampón. NOTA: Si bien trabajar en condiciones libres de RNasa no es crítico, use guantes en todo momento. Mantenga las botellas de solución de descontaminación RNasa(Tabla de Materiales)al alcance de la mano en caso de sospecha de contaminación.</li>
	<li>El primer día, lleve los toboganes a temperatura ambiente en un banco dedicado específicamente a ISH. Enjuague los portaobjetos en 1x PBS y hornéelos durante 30 minutos a 60 °C en un horno de cocción(Tabla de materiales).</li>
	<li>Post-fijar las diapositivas en formalina al 4% durante 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Llevar los reactivos del kit multiplex(Tabla de Materiales)a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deshidratar los portaobjetos en 50%, 70% y 100% etanol durante 5 min cada uno. Aplique la solución H2O2 a las muestras durante 10 minutos y luego enjuague en agua de doble destilación (ddH2O).</li>
	<li>Tratar las muestras con el reactivo de recuperación objetivo durante 5 min, enjuagar en ddH2O seguido de etanol al 100% y secar al aire. Usando una pluma hidrofóbica, cree una barrera alrededor de las muestras. NOTA: No aplique la barrera hidrofóbica demasiado cerca de las secciones de tejido.</li>
	<li>Aplicar proteasa durante 30 min a 40 °C en un horno de hibridación (Tabla de Materiales).</li>
	<li>Mientras tanto, precalencie las sondas a 40 °C y enfríelas a temperatura ambiente antes de usarlas. Incubar los portaobjetos con la combinación deseada de sondas objetivo (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; o Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) durante 2 h a 40 °C en un horno de hibridación.</li>
	<li>Incubar el tejido de control negativo con la sonda C1 diana de la dihidrodipicolinato reductasa (DapB) durante 2 h a 40 °C en un horno de hibridación.</li>
	<li>Enjuague las diapositivas en tampón de lavado y guárdelas durante la noche en citrato de sodio salino (SSC) 5x a temperatura ambiente. Para mayor comodidad, divida el experimento en dos días. Al día siguiente, enjuague las diapositivas con tampón de lavado e incube con los reactivos de amplificación que se enumeran a continuación (consulte el manual del usuario en tabla de materiales).</li>
	<li>Aplique AMP1 (30 min a 40 °C), AMP2 (30 min a 40 °C) y AMP 3 (15 min a 40 °C). Enjuague en tampón de lavado entre cada paso.</li>
	<li>Disuelva cada colorante opal(Tabla de materiales)en dimetilsulfóxido y almacene las soluciones a 4 °C hasta que sea necesario.</li>
	<li>Para el canal 1, incubar los portaobjetos con HRP-C1 (15 min a 40 °C) y Opal 520 (color verde; dilución 1/1.500; 30 min a 40 °C). Enjuague en tampón de lavado entre cada paso.</li>
	<li>Para el canal 2, incubar los portaobjetos con HRP-C2 (15 min a 40 °C) y Opal 570 (color amarillo; dilución 1/1.500; durante 30 min a 40 °C). Enjuague en tampón de lavado entre cada paso.</li>
	<li>Para el canal 3, incubar los portaobjetos con HRP-C3 (15 min a 40 °C) y Opal 690 (color rojo lejano; dilución 1/1.500; durante 30 min a 40 °C). Enjuague en tampón de lavado entre cada paso.</li>
	<li>Lave las diapositivas y expóngalas a 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 30 s.</li>
	<li>Aplique inmediatamente el medio de montaje en cada diapositiva y coloque una cubierta sobre la sección de tejido.</li>
	<li>Mantenga los tejidos horizontales en un soporte deslizante a 4 °C hasta la toma de imágenes.</li>
</ol>3. Microscopía y análisis de datos
NOTA: Los datos multiplex ISH se pueden obtener imágenes con una amplia gama de instrumentos con los filtros apropiados. Sin embargo, un método de imagen preferido es la microscopía confocal con objetivos de 20x y 63x (aceite); consulte la discusión para conocer las razones. Consulte la Figura 2 para determinar la relación señal-ruido óptima.
<ol><li>Utilice un microscopio confocal equipado con líneas láser de 488, 561 y 633 nm. Utilice los siguientes parámetros de adquisición (consulte la Tabla 1):Opal 690 (HeNe 633 nm, rango de detección 668-696 nm, potencia 2.0, ganancia 724); Opal 570 (láser DPSS 561 nm, rango de detección 579-627 nm, <potencia 15.0, <gain 450); Opal 520 (láser de argón 488 nm, rango de detección 499-535 nm, <potencia 6.0, <gain 830); DAPI (láser de diodo 405, rango de detección 415-502 nm, <potencia 12.0, <gain 532).</li>
	<li>Para mejorar la calidad de las imágenes, adquiera con una línea promedio de 4 y un tamaño de píxel de al menos 1024 x 1024. NOTA: Los parámetros anteriores solo se proporcionan como ejemplo, y se recomiendan modificaciones dependiendo de un instrumento, aumento (20x o 63x), niveles de expresión y niveles endógenos de fluorescencia para cualquier tejido dado.</li>
	<li>Una vez satisfecho con los parámetros de adquisición, recopile imágenes utilizando la misma configuración. Atribuye colores falsos a cada canal para facilitar la visualización. NOTA: Por ejemplo, rojo (Phox2b o Prdm12), cian (Cck1r), amarillo (Ghsr) y gris (DAPI).</li>
	<li>Realice el conteo de células utilizando las imágenes digitales identificando el contorno de los perfiles positivos de RNAscope con un núcleo ligeramente teñido con DAPI. Calcular el porcentaje de perfiles RNAscope-positivos expresando cada transcripción [Figura 3A-C].</li>
	<li>Para mejorar el rigor y la precisión de las estimaciones, cuente al menos 2.000 perfiles neuronales de al menos 4 animales diferentes. Realice el conteo de los ganglios izquierdo y derecho por separado.</li>
	<li>Introduzca los datos en un gráfico circular con el número total de perfiles contados.</li>
	<li>Utilice un software de imágenes para adquirir imágenes y unir imágenes 20x. Utilice ImageJ-Fiji y otro software de fotografía y diseño para generar las placas finales. Aplique ajustes de contraste y ligereza de manera uniforme a todas las imágenes.</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.

La técnica de ISH fue inventada a finales de la década de 196042. Sin embargo, no es hasta mediados de la década de 1980 que se aplicó para la detección de ARNm en los sistemas nerviosos central y periférico43,44. Teniendo en cuenta la heterogeneidad del sistema nervioso y los problemas recurrentes con los anticuerpos, la localización de una transcripción particular a nivel celular sigue siendo una herramienta invaluable. No obstante, los ...

Los cuerpos celulares de los aferentes vagales están contenidos en los ganglios yugular, petrosal y nodosis1,2,3. Sus axones viajan juntos a través de varias ramas del nervio vago a los territorios craneocervicical, torácico y abdominal4,5,6,7. Desde sus terminaciones viscerales, las aferencias vagales pueden responder a una amplia gama de estímulos fisiológicos y nocivos8,9,10. Sin embargo, la distribución de las moléculas de señalización y los receptores involucrados en la detección vagagal sigue estando mal caracterizada. Esto se debe en parte a que los ganglios vagales, a pesar de su pequeño tamaño, expresan un amplio espectro de receptores, incluyendo un gran número de GPCR8,11,12,13. Además, las neuronas aferentes vagales son inherentemente heterogéneas y muestran perfiles moleculares distintos14. Para complicar el asunto, los ganglios yugular, petrosal y nodoso se unen en el ratón, formando así una sola masa ganglionar. Por último, en un subconjunto de animales, el ganglio de la nodosa está unido al ganglio cervical superior simpático15.
En el pasado, los investigadores han recurrido a la inmunohistoquímica para estudiar la composición neuroquímica de las neuronas aferentes vagales16,17,18. Si bien la inmunohistoquímica que utiliza anticuerpos validados es útil, los resultados de los estudios inmunohistoquímicos deben interpretarse con precaución. Por ejemplo, numerosos esfuerzos para identificar anticuerpos específicos contra los GPCR han fallado19,20,21,22,23,24,25,lo que lleva a los investigadores a concluir que la mayoría de los anticuerpos contra los GPCR no son confiables. Para eludir estos problemas, la PCR cuantitativa (qPCR) se ha utilizado ampliamente para evaluar la expresión génica en la masa ganglionar vagal de roedores26,27,28,29. Sin embargo, el examen de la expresión génica utilizando qPCR ocurre a costa de una pérdida de información espacial. En particular, no se puede predecir cuántas células o qué tipo de célula expresan un gen particular de interés (por ejemplo, nodosa vs. células yugulares). Los problemas recurrentes también incluyen la contaminación con tejidos adyacentes y la inclusión de longitudes variables del nervio vago, los ganglios cervicales superiores y yugulares durante la disección15. Como resultado de las dificultades anteriores, la controversia rodea la expresión y distribución de varios GPCR en neuronas aferentes vagales. Un ejemplo particularmente desconcertante se relaciona con el receptor de grelina (Ghsr). Mientras que algunos estudios han encontrado una expresión generalizada de este receptor en las neuronas aferentes vagales30,31,32,otros han encontrado que el ARNm de Ghsr es casi indetectable en el ganglio de la nodosis11,14. Por lo tanto, se justifica un mapeo detallado del ARNm de Ghsr en la masa ganglionar vagal.
La hibridación in situ (ISH) también se ha utilizado para evaluar patrones de expresión génica en la masa ganglionar vagal7,11,12,33,34,35. Debido a que las técnicas basadas en ARN siguen siendo más confiables y específicas que las técnicas basadas en anticuerpos en la mayoría de las circunstancias36,37, los estudios de ISH han demostrado ser valiosos para una mejor comprensión de la codificación neuroquímica de las neuronas aferentes vagales. Sin embargo, las técnicas tradicionales de ISH en sí mismas no están exentas de advertencias. La ISH radiactiva es sensible pero genera fondo y sigue siendo engorrosa38. La ISH no radiactiva es menos complicada pero también menos sensible38. En contraste, el método RNAscope ISH recientemente desarrollado es altamente sensible y genera un fondo mínimo39. El estudio actual aplicó RNAscope fluorescente multiplex a la detección de GPCR en neuronas aferentes vagales del ratón. Nos centramos en mapear la distribución de Ghsr y comparamos su distribución con la del receptor de colecistoquinina (Cck1r), otro GPCR bien conocido por expresarse en el ganglio de la nodosis34. Por último, los dos factores de transcripción, homeobox 2b (Phox2b) y proteína 12 del dedo de zinc del dominio PR (Prdm12), se utilizaron como marcadores selectivos para las neuronas aferentes de nodosa y yugular, respectivamente14. Sin visualizar Phox2b o Prdm12, sería difícil identificar las aferencias yugulares frente a las nodosas con certeza. Las posibles trampas técnicas también se discuten a lo largo del artículo.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>AM9763-80</td><td></td></tr><tr><td>&deg; Congelador C</td><td>: PHCBI</td><td>, MDF-DU901VHA-PA</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 2021</td><td></td><td></td>, <td>Adobe software de fotografía y diseño</td></tr><tr>,<td>horno de horneado</td><td>, Thermo Scientific</td><td>Modelo:658</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM880 Airyscan</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio</td><td>Laboratorios de Investigación del Cerebro</td><td>2460-1.5D</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM 3050 S</td> Dumont #5 Pinzas <td></td></tr><tr><td></td><td>F.S.T.</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecomount</td><td>Biocare Medical</td><td>EM 897L medio</td> de <td>montaje</td></tr><tr><td>Horno</td><td></td><td></td> HybEZ horno <td>de hibridación</td></tr><tr><td>Bolígrafo hidrofóbico</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ-Fiji</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras grandes</td><td>Henry Schein</td><td>100-7561</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos de centrífuga</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td></td></tr><tr><td>Minibomba de caudal variable</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>Opal 520</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1487001KT</td><td>Biomarcador fluorescente</td></tr><tr><td>Opal 570</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1488001KT</td><td>Biomarcador fluorescente</td></tr><tr><td>Opal 690</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1497001KT</td><td>Biomarcador fluorescente</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antidecoloración Medio de montaje de montaje</td><td></td><td></td><td>para células marcadas con fluorescencia</td></tr><tr><td>Kit de reactivos fluorescentes RNAscope Multiplex v2</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>323100</td><td>kit multiplex</td></tr><tr><td>Sonda de ARNscope Ratón Cck1r-C3</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>313751-C3</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de ARNscope Mouse DapB</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>310043</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de ARNscope Mouse Ghsr</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td></td><td></td>426141</tr><tr><td>Sonda de ARNscope de ratón Phox2b-C2</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>407861-C2</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de ARNscope de ratón Prdm12-C2</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>524371-C2</td><td></td></tr><tr><td>RnaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Rnase solución descontaminante</td></tr><tr><td>Tijeras de disección pequeñas</td> portaobjetos <td></td><td></td> Millipore Sigma Z265977 <td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek OCT medio</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Manual de instrucciones</td><td>ACD</td><td>323100 USM</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas</td><td>Roboz</td><td>RS 5620</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Software de imagen</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detección de la expresión del receptor acoplado a la proteína g en neuronas aferentes vagas de ratón mediante hibridación multiplex in situ

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Este estudio describe un protocolo para la hibridación multiplex in situ (ISH) de los ganglios yugulares-nodosis de ratón, con un énfasis particular en la detección de la expresión de receptores acoplados a proteínas G (GPCR). Los ganglios de yugular-nodosa fijados con formalina se procesaron con la tecnología RNAscope para detectar simultáneamente la expresión de dos GPCR representativos (receptores de colecistoquinina y grelina) en combinación con un gen marcador de nodosa (homeobox 2b, Phox2b) o neuronas aferentes yugulares (proteína de dedo de zinc de dominio PR 12, Prdm12). Los ganglios marcados fueron fotografiados utilizando microscopía confocal para determinar la distribución y los patrones de expresión de las transcripciones antes mencionadas. Brevemente, se encontró que las neuronas aferentes Phox2b expresan abundantemente el receptor de colecistoquinina (Cck1r) pero no el receptor de grelina (Ghsr). También se encontró que un pequeño subconjunto de neuronas aferentes Prdm12 expresan Ghsr y / o Cck1r. Se discuten posibles advertencias técnicas en el diseño, procesamiento e interpretación de multiplex ISH. El enfoque descrito en este artículo puede ayudar a los científicos a generar mapas precisos de los perfiles transcripcionales de las neuronas aferentes vagales.

Si bien RNAScope se puede aplicar a animales de cualquier edad, sexo o antecedentes genéticos, es recomendable trabajar con adultos jóvenes (&lt;3 meses de edad). Esto se debe a que los artefactos fluorescentes (por ejemplo, lipofuscina) son hallazgos comunes en las neuronas de animales mayores41. Los ganglios fijados con formalina de ratones más viejos a menudo contienen una fluorescencia endógena sorprendentemente intensa que puede confundirse fácilmente con una tinción genuina<strong class="xfi...

Se empleó la hibridación multiplex in situ (ISH) para visualizar simultáneamente las transcripciones de dos receptores acoplados a la proteína G y un factor de transcripción en todo el complejo ganglionar vago del ratón adulto. Este protocolo podría utilizarse para generar mapas precisos de los perfiles transcripcionales de las neuronas aferentes vagales.

Detección de la expresión del receptor acoplado a la proteína G en neuronas aferentes vagas de ratón mediante hibridación multiplex in situ

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

Este procedimiento es altamente sensible y permite una visualización de varias transcripciones con un fondo mínimo. Este método puede generar mapas precisos del perfil transcripcional de tipos de células altamente heterogéneas. Demostrando el procedimiento estaremos Johnson Bob-manuel y yo, un técnico de investigación en el laboratorio.Comience recolectando toda la masa ganglionar vagal del ratón de ocho semanas de edad de cada lado, con la ayuda de un endoscopio de disección e instrumentos quirúrgicos. Después de la decapitación del ratón, use pinzas pequeñas para eliminar el esternohioideo y los músculos omohioides laterales a la tráquea para exponer el hueso occipital. Limpie toda la región de músculos y tejidos hasta que la arteria carótida, el nervio vago e hipogloso y el foramen magnum sean visibles.Luego corte todo el nervio hipogloso con pequeñas tijeras de resorte. Localice el ganglio de la dosis como una masa translúcida cerca del foramen magnum. Usando tijeras pequeñas, rompa cuidadosamente el hueso occipital.Para exponer aún más el ganglio yugular, ubique los melanocitos negros en la superficie de la yugular como un hito visual. Cuando se encuentren los ganglios, corte las uniones nerviosas entre la masa ganglionar vagal y tire suavemente del extremo periférico del nervio vago mientras corta simultáneamente el ganglio yugular hacia el tronco encefálico con pequeñas tijeras de resorte para la extracción de toda la masa ganglionar. Retire el tejido conjuntivo, la masa ganglionar y la grasa que se adhieren al nervio vago.Manteniendo aproximadamente medio centímetro del nervio vago para facilitar el manejo y localización de las muestras. Coloque el removedor a los ganglios con la ayuda de fórceps finos en tubos de micro centrífuga de 1,5 milímetros. E incubar a cuatro grados centígrados en formalina durante 24 horas.Y luego con 30% de sacarosa durante 24 horas. Después de la incubación, coloque los ganglios dentro de una gota de un diámetro de cuatro milímetros de medio de temperatura de corte óptima en una pieza de papel de aluminio. Y frasee la muestra en un lecho de hielo seco.Corte las muestras congeladas con un criostato en secciones de 14 micrómetros de espesor a menos 20 grados centígrados y recoja las secciones cortadas en los portaobjetos de microscopio de vidrio como tres series separadas por 42 micrómetros. Enjuague los portaobjetos con secciones de tejido en PBS. Y hornea durante 30 minutos a 60 grados centígrados en un horno de hornear.Luego, coloque las diapositivas en 4% de formalina durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Deshidratar en serie los portaobjetos en 50%70% y 100% etanol durante cinco minutos cada uno. Y aplique la solución de peróxido de hidrógeno a las muestras durante 10 minutos antes de enjuagar en agua destilada doble.Para la hibridación in situ, o ISH, trate las muestras con el reactivo de recuperación objetivo durante cinco minutos. Luego enjuague secuencialmente las muestras en agua destilada doble y etanol 100%, seguido de secado al aire. Usando una pluma hidrofóbica, cree una barrera alrededor de las muestras.Mientras las muestras se tratan con proteasa durante 30 minutos a 40 grados centígrados y un horno de hibridación, precalentar las sondas a 40 grados centígrados y enfriarlas a temperatura ambiente antes de su uso. Después de salir del horno, incube las diapositivas con la combinación deseada de sondas objetivo durante dos horas a 40 grados centígrados en un horno de hibridación. Incubar tejido de control negativo con la dihidrodipicolinato reductasa o DapB, sonda C1 objetivo durante dos horas a 40 grados centígrados.Enjuague los portaobjetos en tampón de lavado y guárdelo cinco veces citrato de sodio salino a temperatura ambiente durante la noche. Al día siguiente, enjuague las diapositivas con tampón de lavado antes de la incubación con reactivos de amplificación. Y tratar con reactivos específicos del canal como se describe en el manuscrito.Lave los portaobjetos seguido de un tratamiento con DapB durante 30 segundos. Luego aplique inmediatamente el medio de montaje en cada diapositiva y coloque un deslizamiento de cubierta sobre la sección de tejido. Mantenga los tejidos horizontales en un portaobjetos a cuatro grados centígrados hasta la toma de imágenes.Prepare un microscopio confocal para la obtención de imágenes estableciendo los parámetros requeridos. Adquiera las imágenes con un promedio de cuatro líneas y un tamaño de píxeles de al menos 1024 para 1024 para mejorar la calidad de las imágenes. Una vez satisfecho con los parámetros de adquisición, comience a adquirir las imágenes utilizando la misma configuración.Atribuye colores falsos a cada canal para facilitar la visualización. Utilizando las imágenes digitales, realice el conteo celular identificando el contorno de los perfiles positivos del alcance del ARN con un núcleo ligeramente teñido con DapB. Calcule el porcentaje de perfiles positivos de ARN que expresan cada transcripción.Se eligieron los parámetros óptimos de adquisición para cada láser en función de la fluorescencia inespecífica obtenida en el tejido de control negativo. La fluorescencia endógena en el ganglio de nodosis de un ratón adulto joven es mínima. Y la incubación con una sonda DapB, no dio lugar a señales.A mayor potencia láser y ganancia con el láser de 488 nanómetros, aparecen fondos no deseados y puntos fluorescentes aleatorios. Se aplicó la técnica de alcance de ARN para detectar tres genes en secciones tisulares de la masa ganglionar vagal. El perfil tisular fue positivo para GHSR y CCK1R.El perfil incluyó transcripciones de Phox2b y CCK1R en la parte rostral del ganglio de la nodosis. Como resultado del ISH multiplex en las neuronas aferentes nodosas, las señales Phox2b se acumularon específicamente en las neuronas aferentes, ubicadas en el ganglio de la nodosis. Las señales CCK1R marcaron intensamente muchas neuronas en el ganglio de la nodosis.A bajo aumento, las células que expresaban señales bajas de CCK1R o GSHR no se podían observar fácilmente. DapB ayudó a visualizar el tejido e identificar neuronas aferentes vagales con un núcleo grande y ligeramente teñido. A gran aumento, los perfiles positivos de Phox2b son evidentes.Los perfiles dos y tres son células Phox2b con señales CCK1R altas y moderadas. El perfil cuatro expresó tanto GHSR como CCK1R. Como resultado del ISH múltiplex de las neuronas aferentes yugulares, la transcripción PRDM12 se pudo ver específicamente acumulada en neuronas aferentes ubicadas en el ganglio yugular.A gran aumento, se detectaron señales moderadas para CCK1R en los perfiles uno y dos. El perfil tres es un representante de las células PRDM12 negativas para CCK1R o GHSR. La consistencia de la disección es un factor importante.Es igualmente importante verificar que los parámetros de adquisición de imágenes no generen señales de fondo no deseadas. La hibridación multiplex in situ se ha convertido en el estándar de oro en el establecimiento molecular, especialmente en el campo de la neuroanatomía. Este método se puede combinar fácilmente con inmunohistoquímica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En ratones, la capacidad de detectar las feromonas está mediado por el órgano vomeronasal (OVN). Aquí, una rebanada de preparación de tejidos aguda de VNO para la realización de imágenes de calcio se describe. Este enfoque permite a las observaciones fisiológicas de las subpoblaciones y / o las neuronas individuales en un tejido vivo y es conveniente para la identificación del receptor-ligando.

Imágenes de detección de feromonas en una preparación de ratón Vomeronasal aguda lámina de tejido

El órgano vomeronasal (VNO) detecta señales químicas intraspecíficas que transmiten información social y reproductiva. Hemos realizado experimentos de imagen de Ca2+ utilizando ratones transgénicos que expresan G-CaMP2 en el tejido del VNO. Este enfoque nos permite analizar los complejos patrones de respuesta de las neuronas vomeronasales frente a un gran número de estímulos de feromonas.

Las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal Expresando un sensor de calcio genéticamente codificados

Fuente: Baleriola, J., et. al., Detección de ARNm localizados axonalmente en secciones cerebrales mediante hibridación in situ de alta resolución.  J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra la detección de ARNm dentro de axones colinérgicos en cortes fijos de hipocampo de ratón utilizando hibridación fluorescente in situ y tinción de anticuerpos. La microscopía de fluorescencia revela la localización espacial de los ARNm marcados con sonda y la colina acetiltransferasa en las neuronas...

Inmunotinción de neuronas en cortes de cerebro de ratón después de la hibridación fluorescente in situ

La localización de la expresión génica a tipos específicos de células puede ser un desafío debido a la falta de anticuerpos específicos. En este trabajo describimos un protocolo para la detección simultánea de la triple expresión génica mediante la combinación de hibridación in situ de ARN de doble fluorescencia con inmunotinción.

La combinación de doble fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Aquí, describimos un enfoque fisiológico que permite la identificación y el análisis en profundidad de una población definida de neuronas sensoriales en cortes agudos de tejido coronal del órgano vomeronasal de ratón utilizando registros de patch-clamp de células completas.

Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal

Este protocolo describe la detección de microscopía confocal de receptor acoplado a proteína G internalización (GPCR) en células de mamífero. Incluye la cultura básica celular, transfección, y el procedimiento de microscopía confocal y proporciona un método eficiente y fácilmente interpretable para detectar la localización subcelular y la internalización de GPCR de fusión expresada.

La detección de activados por ligando G receptor acoplado a proteína internalización por microscopía confocal

Este protocolo describe los pasos críticos y precauciones necesarias para realizar la célula multiplex transcripción reversa reacción en cadena polimerasa después de patch-clamp. Esta técnica es un método simple y eficaz para analizar el perfil de expresión de un conjunto predeterminado de genes de una sola célula caracterizada por grabaciones de patch-clamp.

Sola célula Multiplex transcripción reversa reacción en cadena polimerasa después de Patch-clamp

Este protocolo describe un método para combinar la hibridación fluorescente in situ (FISH) y la inmunohistoquímica de fluorescencia (IHC) en secciones de cerebro de ratón frescas congeladas y fijas, con el objetivo de lograr una señal de FISH y IHC de fluorescencia multimarca. IHQ se dirigió a proteínas citoplasmáticas y unidas a la membrana.

Combinación de hibridación in situ de fluorescencia múltiple con inmunohistoquímica fluorescente en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas

La hibridación in situ iterativa de fluorescencia asistida por expansión (EASI-FISH) es una técnica robusta que combina la microscopía de expansión con la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) para detectar la expresión de múltiples genes en tejido grueso. Este protocolo describe los avances recientes en el método y su adaptación para etiquetar el sistema nervioso central intacto de Drosophila.

Detección múltiple de la expresión génica en el cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ de fluorescencia iterativa asistida por expansión

Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

Aprenda a detectar la expresión de receptores acoplados a proteína G en neuronas vagales de ratón mediante hibridación in situ multiplex. Este método permite mapear perfiles transcripcionales con alta sensibilidad.

Detección de la expresión del receptor acoplado a la proteína G en neuronas aferentes vagas de ratón mediante hibridación multiplex in situ (Video) | JoVE Journal

Detección de la expresión del receptor acoplado a la proteína G en neuronas aferentes vagas de ratón mediante hibridación multiplex in situ

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