Modelo de sangrado por transyección de la vena de la cola en ratones con hemofilia A totalmente anestesiada

Los modelos de sangrado de cola pueden ser herramientas importantes para evaluar los efectos farmacológicos de los compuestos hemostáticos in vivo para garantizar la reproducibilidad entre experimentos. En comparación con otros modelos de sangrado sensible, nuestro modelo utiliza la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado como puntos finales en lugar de supervivencia. Además, el modelo se realiza bajo anestesia, reduciendo así el dolor y la angustia de los animales.

Esta técnica es especialmente útil para el estudio preclínico de la hemofilia y otros trastornos de la coagulación, ya que mide la capacidad de la sangre para coagularse y detener una hemorragia después de una lesión. Hemos utilizado este modelo ampliamente, probando compuestos procoagulantes en nuestro trabajo para desarrollar nuevas terapias de hemofilia utilizando ratones con hemofilia A. Sin embargo, también se pueden usar otras cepas hemofílicas de ratón, o ratones en los que se induce hemofilia con un anticuerpo antifactor VIII.

Demostrando el experimento estarán Sarah y Dennis, que son técnicos expertos en mi laboratorio. Después de anestesiar al ratón, colóquelo en una placa de calentamiento y asegúrese de que la nariz esté en el cono de la nariz. Aplique un ungüento adecuado para los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.

Marque la cola a un diámetro de 2,5 milímetros utilizando el bloque de marca de la cola, teniendo cuidado de no forzar la cola en la hendidura y asegurándose de que se ajuste perfectamente. Luego, coloque la cola en el tubo salino durante al menos cinco minutos para asegurar una vena de la cola caliente que sea óptima para la dosificación intravenosa. Si es necesario, la dosificación intravenosa se puede realizar después de cinco minutos.

Luego, coloque una cubierta de plástico sobre el mouse para reducir la pérdida de calor. Deje las colas sumergidas durante cinco minutos después de la dosificación de la solución de prueba, y luego realice la transección de la vena de la cola colocando la cola en el bloque de corte y girándola 90 grados para exponer la vena. Haga el corte en el lado opuesto de donde se dosificó la solución de prueba.

Dibuje la hoja de bisturí número 11 a través de la hendidura del bloque de corte, sosteniendo la cola, para crear sangrado. Luego, devuelva inmediatamente la cola a la solución salina y restablezca el cronómetro. El sangrado debe ser visible de inmediato.

Sumergir la cola en solución salina es importante para el sangrado constante, ya que se detendría rápidamente en el aire libre. Observe el sangrado y anote el inicio y la detención del sangrado durante 40 minutos en el papel de notación del flujo sanguíneo. Descalificar y reemplazar al ratón si el sangrado primario no se detiene dentro de los tres minutos posteriores a la realización del corte, lo que puede indicar que el corte es demasiado profundo o que el ratón es deficiente en hemostasia primaria.

Desafíe el corte de la cola si no hay sangrado, 10, 20 y 30 minutos después de la lesión. Usando un hisopo de gasa empapado y solución salina tibia, levante la cola de la solución salina y límpiela suave pero firmemente dos veces con la gasa húmeda en una dirección distal sobre el corte de la cola. Inmediatamente vuelva a sumergir la cola en el tubo salino después de cada desafío.

Cuando termine el experimento, retire la cola de la solución salina, recolecte muestras de sangre si lo desea y eutanasia a los ratones mientras aún está bajo anestesia completa. Centrifugar los tubos de recolección de sangre de 15 mililitros con solución salina a 4.000 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante de los tubos.

Resuspend el pellet en dos mililitros de solución de lisado eritrocitario. Luego, diluirlo con hasta 12 mililitros adicionales de solución de lisado hasta que alcance un color de café claro. Observe el volumen total y transfiera dos mililitros de la dilución a un tubo de hemoglobina.

Refrigerarlo hasta el análisis de hemoglobina. Se observó una reducción significativa en la pérdida de sangre para los grupos de tratamiento con factor VIII de coagulación recombinante utilizando el protocolo optimizado. Una dosis de 20 unidades internacionales por kilogramo normalizó completamente el sangrado, y 10 UI por kilogramo causaron un efecto significativo, reduciendo la pérdida de sangre casi al límite superior del rango de tipo salvaje.

Se observaron resultados similares para el tiempo de sangrado. Se observó una reducción en los grupos de 5, 10 y 20 UI por kilogramo, estando completamente normalizada en el grupo de 20 UI por kilogramo. En ratones de tipo salvaje, la pérdida total de sangre varió de 200 a 840 nanomoles de hemoglobina, y en ratones vehículos, de 5, 300 a 7, 100 nanomoles de hemoglobina.

El sangrado medio fue de 5.200 nanomoles en ratones tratados con vehículos, y de 720 nanomoles en el grupo de 20 UI por kilogramo. El tiempo de sangrado de los ratones de tipo salvaje varió de uno a nueve minutos y los niveles de dosis de 10 y 20 UI por kilogramo redujeron el tiempo de sangrado dentro de este rango. Se observó una fuerte correlación entre la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado en los datos combinados.

Todos los episodios de sangrado registrados se trazaron para proporcionar una visualización de la longitud y el número de hemorragias experimentadas para cada ratón individual. Tenga en cuenta que en el grupo de vehículos, después del segundo desafío, la mayoría de los animales continúan sangrando hasta el final del experimento. La medición de la concentración plasmática de factor VIII confirmó que el efecto observado en la reducción de la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado fue dependiente de la concentración recombinante de factor VIII.

Los recuentos de plaquetas no se vieron notablemente afectados y los niveles de hematocrito estuvieron dentro del rango normal en animales que recibieron dosis moderadas y más altas de factor VIII recombinante, pero significativamente más bajos en animales que sangraron extensamente, como en el vehículo y una UI por kilogramo. En animales que experimentan sangrado abundante, puede ocurrir un impacto menor en los recuentos sanguíneos, particularmente hemoglobina total o hematocrito. Para evaluar el efecto del género en este modelo optimizado, tanto los resultados de pérdida de sangre como los de tiempo de sangrado se sometieron a un análisis ANOVA bidireccional, con el género y la dosis como factores.

Estos resultados indicaron que la respuesta al tratamiento no difirió entre los géneros. El marcado correcto de la cola y la creación del corte son pasos esenciales para garantizar la fiabilidad y la reproducibilidad en la técnica, como lo es el desafío si no hay sangrado. Además, una buena inducción de la anestesia y el mantenimiento de la temperatura corporal animal es particularmente relevante.

También hemos utilizado este modelo para investigar la interrupción de las hemorragias establecidas en un entorno más parecido a la demanda mediante el tratamiento con factor VIIA 10 minutos después de inducir el sangrado.