Enfoque genético inverso para identificar reguladores de pigmentación usando pez cebra
1 de marzo de 2022
Los reguladores de las funciones de los melanocitos gobiernan las diferencias visibles en el resultado de la pigmentación. Descifrar la función molecular del gen de pigmentación candidato plantea un desafío. Aquí, demostramos el uso de un sistema modelo de pez cebra para identificar candidatos y clasificarlos en reguladores del contenido de melanina y el número de melanocitos.
Este protocolo es una amalgama de varias técnicas que permitirían a los investigadores delinear el papel del gen candidato en la biología de los melanocitos. Es un enfoque holístico para lograr una inferencia lógica. Al combinar varios métodos, se pueden evitar los factores de confusión y puede ayudar a los investigadores a obtener un resultado sustancial.
Para comenzar el análisis, inmovilizar los 48 embriones HPF con 0,016% de tricaína. Monte los embriones usando unos pocos mililitros de 1.5 a 2% de metilcelulosa en una placa de Petri. Elija los embriones con una pipeta Pasteur y colóquelos en metilcelulosa para restringir el movimiento durante la obtención de imágenes.
Para obtener imágenes laterales o dorsales óptimas, ajuste su posición con un aumento de más de 5X. Coloque la placa de Petri bajo el microscopio. Usando un manipulador, ajuste el pez para que las cinco rayas embrionarias de melanocitos sean visibles al mismo tiempo.
Usando el software de adquisición, capture las imágenes. Si el pez se despierta, colóquelo en agua tricaine hasta que se estabilice. Usando la herramienta abierta en el software ImageJ, abra la imagen que se va a cuantificar.
Seleccione la herramienta de forma a mano alzada para delinear el área para el análisis. Seleccione la opción establecer medidas, haga clic en el valor gris medio y luego en el área. Para calcular el valor gris medio para el área seleccionada, haga clic en M o vaya a analizar y seleccione la medida.
Según la etapa de interés, transfiera los embriones a una placa de Petri que contenga 0,6 miligramos por mililitro de Pronasa. Usando una pipeta Pasteur, transfiera los embriones descorionados a una placa de Petri que contenga agua embrionaria simple después de cinco a 10 minutos. Con una pipeta de vidrio Pasteur, recolecte y transfiera alrededor de 100 embriones a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.
Deseche el medio y agregue 200 microlitros de solución de Ringers desyolking helada. Coloque el tubo sobre hielo y mezcle el contenido unas 20 veces con una pipeta para disolver el yugo. Centrifugar los tubos a 100 G durante un minuto a cuatro grados centígrados dos veces, y desechar el sobrenadante.
Transfiera los embriones desyemas utilizando una pipeta de un mililitro en una placa de Petri que contenga 10 mililitros de solución de tripsina. Mezclar la solución una o dos veces con una pipeta de un mililitro para disminuir la agregación. Pase la suspensión tripsinizada a través de un colador de 70 micrómetros colocado en un tubo cónico de 50 mililitros para recoger una suspensión de una sola celda.
Lave las placas de Petri con la suspensión tripsinizada para eliminar las células adheridas de la superficie. Para contar las células marcadas con fluorescencia usando un citómetro de flujo, después de crear una nueva carpeta de experimentos, dibuje un gráfico de dispersión hacia adelante versus hacia el lado. Haga un histograma para la intensidad del isotiocianato de fluoresceína.
Cargue primero las celdas de tipo comodín para establecer las puertas de dispersión delantera y lateral y el umbral FIFC. Después, cargue las células aisladas de embriones transgénicos de línea FTYRP GFP para contar los melanocitos. Monte los embriones en 1,5 a 2% de metilcelulosa en una placa de Petri.
Colóquelo bajo el microscopio y ajústelo en la orientación deseada con una punta de pipeta. Usando el software de adquisición, adquiera las imágenes. Para embriones de menos de 24 HPF, utilizando un aumento de 10X, captura la imagen completa, mientras que para embriones de más de 24 HPF, adquieren múltiples campos de escaneo y posteriormente los ensamblan.
Después de realizar el ensayo, la imagen de Brightfield después de 48 horas reveló la presencia de las cinco rayas de melanóforos pigmentados. En la etapa 48 HPF, se calculó el número de melanóforos laterales y se encontró que los morfantes h2afv de la variante histona demostraron un número reducido de melanóforos en comparación con el control. El valor gris medio se midió para los morfantes CA14 y h2afv, lo que reveló que los valores fueron más altos para las variantes que para los morfantes control.
Mediante el empleo de un método de absorción espectrofotométrica basado en hidróxido de sodio, se cuantificó el contenido de melanina donde los morfantes CA14 mostraron menos contenido que los morfantes control. Se realizaron imágenes de fluorescencia para evaluar la alteración basada en morfolino para diferentes etapas del desarrollo del melanóforo del pez cebra. El número de melanóforos en los morfantes CA14 y h2afv se analizó mediante FACS.
Se observó que el número de melanóforos en CA14 se mantuvo sin cambios, mientras que se redujeron significativamente en h2afv en comparación con el morfante control. También se calculó la intensidad media de fluorescencia por área, demostrando que los morfantes h2afv muestran una disminución considerable en el valor relativo a los morfantes control. Mientras ajusta el pez antes de la imagen, asegúrese de poder visualizar las cinco rayas de melanóforo.
Necesitas inclinar un poco el pez para distinguir entre las dos rayas laterales. Después de establecer el papel de un gen candidato en el desarrollo de melanocitos, podemos eliminar el gen de una manera específica del tejido utilizando la tecnología CRISPR. Ese será un enfoque más específico.
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Resumen
Este estudio investiga el papel de los genes candidatos de pigmentación en la biología de los melanocitos utilizando un sistema modelo de pez cebra. Mediante el uso de diversas técnicas de imagen y ensayos, la investigación identifica reguladores clave del contenido de melanina y del número de melanocitos.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Desarrollo del melanocito
- Genética de la pigmentación
- El pez cebra como organismo modelo
Antecedentes
- Comprender la función molecular de los genes de la pigmentación es esencial para descifrar las variaciones del color de la piel.
- Los factores de confusión en la investigación pueden dificultar la evaluación precisa de las funciones génicas.
- Los embriones de pez cebra constituyen un modelo eficaz para estudiar los procesos de desarrollo temprano en la pigmentación.
Métodos Utilizados
- Inmovilización de embriones y técnicas de obtención de imágenes
- Pececillo cebra como modelo biológico
- Citometría de flujo para contar melanocitos y ensayos espectrofotométricos para el contenido de melanina
Resultados principales
- Se observó una reducción en el número de melanóforos en los morfantes de h2afv en comparación con los controles.
- Los morfantes de CA14 mostraron un contenido menor de melanina que los morfantes controles.
- La imagen de fluorescencia confirmó diferencias en el desarrollo de los melanóforos.
Conclusiones
- Los hallazgos ilustran la importancia de genes específicos de pigmentación en el desarrollo de los melanocitos.
- Esta investigación tiene implicaciones más amplias para comprender las influencias genéticas sobre la pigmentación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la interrogación sistemática de reguladores genéticos en el desarrollo de los melanocitos, apoyando la validación de dianas en trastornos relacionados con el pigmento. Al combinar imágenes fenotípicas, citometría de flujo y ensayos bioquímicos, proporciona lecturas cuantitativas para reducir riesgos en hipótesis mecanicistas desde las primeras etapas del descubrimiento. El enfoque mejora la confianza predictiva al distinguir genes que afectan el número de melanocitos frente al contenido de melanina por célula, orientando la priorización de carteras para moduladores tópicos o sistémicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la disección funcional de genes candidatos en especificadores y diferenciadores de melanocitos según sus efectos en el número celular frente a la síntesis de pigmento.
- Valor operativo: Utiliza la inhibición con morfolinos en larvas de pez cebra para evaluar rápidamente las consecuencias fenotípicas sobre las vías de pigmentación.
- Valor científico: Facilita la comprobación de hipótesis al vincular la perturbación génica con cambios medibles en el recuento de melanóforos y el contenido de melanina.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera resultados cuantitativos estandarizados, incluyendo el valor medio de gris a partir de imágenes de campo claro y la concentración de melanina mediante espectrofotometría.
- Valor operativo: Integra el recuento de melanocitos basado en FACS con imágenes para permitir un cribado fenotípico de alto contenido de moduladores genéticos.
- Valor científico: Facilita la reproducibilidad del ensayo mediante etapas definidas (48 HPF), inmovilización y parámetros de imagen para comparaciones longitudinales.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Utiliza receptores GFP transgénicos (mitfa, tyrp1) para rastrear las etapas de especificación y diferenciación de melanocitos relevantes para la biología de la pigmentación humana.
- Valor operativo: Permite la segregación de resultados en clases mecanicistas (especificadores frente a diferenciadores) para orientar la validación posterior en modelos mamíferos.
- Valor científico: Proporciona un sistema relevante para enfermedades, que permite evaluar genes implicados en las vías de la piebaldismo, albinismo o vitíligo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se encaja en la fase inicial del descubrimiento hasta la identificación del candidato, donde se validan los impactos genéticos sobre la biología de los melanocitos antes del cribado de compuestos o del seguimiento mecanicista.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la validación de dianas mediante el aislamiento de efectos específicos de genes en el desarrollo de melanocitos mediante fenocopia con morfolinos e imágenes cuantitativas.
- Selección: Permite modelos de pez cebra listos para ensayos con reporteros fluorescentes para la evaluación escalable de moduladores genéticos o de moléculas pequeñas.
- Análisis: Proporciona lecturas multiparamétricas—número de melanóforos (FACS), contenido de melanina (espectrofotometría) y distribución espacial (imágenes)—para apoyar la selección de resultados basada en datos.
- Investigación Traducional: Utiliza marcadores conservados de melanocitos (mitfa, tyrp1) para vincular los hallazgos en pez cebra con los mecanismos de pigmentación humana.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la selección de genética del pigmento aplicable a través de familias de dianas y áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al distinguir los genes que alteran la especificación de melanocitos de aquellos que afectan la producción de pigmento por célula.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de manipulación, obtención de imágenes y disociación de embriones para garantizar la reproducibilidad entre laboratorios y campañas de cribado.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar o descartar al proporcionar confianza fenotípica temprana en el mecanismo diana antes de invertir en química medicinal.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas basándose en la validación genética de fenotipos específicos de melanocitos.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en embriología de pez cebra, microinyección y diseño de morfolinos para una evaluación fenotípica precisa.
- Los instrumentos incluyen microscopios de fluorescencia, citómetros de flujo y espectrofotómetros para lecturas multiparamétricas.
- La estandarización entre equipos requiere sincronización en el estadio (HPF), protocolos de inmovilización y configuraciones de imagen para minimizar la variabilidad.
- La adaptación a otros modelos puede requerir la validación de reporteros controlados por promotores conservados y de los puntos finales fenotípicos.
- Las limitaciones incluyen efectos fuera del blanco de los morfolinos y la inhibición transitoria, lo que requiere seguimiento con CRISPR o líneas mutantes para confirmar el blanco.
