Enfoque genético inverso para identificar reguladores de pigmentación usando pez cebra
March 1st, 2022
Los reguladores de las funciones de los melanocitos gobiernan las diferencias visibles en el resultado de la pigmentación. Descifrar la función molecular del gen de pigmentación candidato plantea un desafío. Aquí, demostramos el uso de un sistema modelo de pez cebra para identificar candidatos y clasificarlos en reguladores del contenido de melanina y el número de melanocitos.
Este protocolo es una amalgama de varias técnicas que permitirían a los investigadores delinear el papel del gen candidato en la biología de los melanocitos. Es un enfoque holístico para lograr una inferencia lógica. Al combinar varios métodos, se pueden evitar los factores de confusión y puede ayudar a los investigadores a obtener un resultado sustancial.
Para comenzar el análisis, inmovilizar los 48 embriones HPF con 0,016% de tricaína. Monte los embriones usando unos pocos mililitros de 1.5 a 2% de metilcelulosa en una placa de Petri. Elija los embriones con una pipeta Pasteur y colóquelos en metilcelulosa para restringir el movimiento durante la obtención de imágenes.
Para obtener imágenes laterales o dorsales óptimas, ajuste su posición con un aumento de más de 5X. Coloque la placa de Petri bajo el microscopio. Usando un manipulador, ajuste el pez para que las cinco rayas embrionarias de melanocitos sean visibles al mismo tiempo.
Usando el software de adquisición, capture las imágenes. Si el pez se despierta, colóquelo en agua tricaine hasta que se estabilice. Usando la herramienta abierta en el software ImageJ, abra la imagen que se va a cuantificar.
Seleccione la herramienta de forma a mano alzada para delinear el área para el análisis. Seleccione la opción establecer medidas, haga clic en el valor gris medio y luego en el área. Para calcular el valor gris medio para el área seleccionada, haga clic en M o vaya a analizar y seleccione la medida.
Según la etapa de interés, transfiera los embriones a una placa de Petri que contenga 0,6 miligramos por mililitro de Pronasa. Usando una pipeta Pasteur, transfiera los embriones descorionados a una placa de Petri que contenga agua embrionaria simple después de cinco a 10 minutos. Con una pipeta de vidrio Pasteur, recolecte y transfiera alrededor de 100 embriones a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.
Deseche el medio y agregue 200 microlitros de solución de Ringers desyolking helada. Coloque el tubo sobre hielo y mezcle el contenido unas 20 veces con una pipeta para disolver el yugo. Centrifugar los tubos a 100 G durante un minuto a cuatro grados centígrados dos veces, y desechar el sobrenadante.
Transfiera los embriones desyemas utilizando una pipeta de un mililitro en una placa de Petri que contenga 10 mililitros de solución de tripsina. Mezclar la solución una o dos veces con una pipeta de un mililitro para disminuir la agregación. Pase la suspensión tripsinizada a través de un colador de 70 micrómetros colocado en un tubo cónico de 50 mililitros para recoger una suspensión de una sola celda.
Lave las placas de Petri con la suspensión tripsinizada para eliminar las células adheridas de la superficie. Para contar las células marcadas con fluorescencia usando un citómetro de flujo, después de crear una nueva carpeta de experimentos, dibuje un gráfico de dispersión hacia adelante versus hacia el lado. Haga un histograma para la intensidad del isotiocianato de fluoresceína.
Cargue primero las celdas de tipo comodín para establecer las puertas de dispersión delantera y lateral y el umbral FIFC. Después, cargue las células aisladas de embriones transgénicos de línea FTYRP GFP para contar los melanocitos. Monte los embriones en 1,5 a 2% de metilcelulosa en una placa de Petri.
Colóquelo bajo el microscopio y ajústelo en la orientación deseada con una punta de pipeta. Usando el software de adquisición, adquiera las imágenes. Para embriones de menos de 24 HPF, utilizando un aumento de 10X, captura la imagen completa, mientras que para embriones de más de 24 HPF, adquieren múltiples campos de escaneo y posteriormente los ensamblan.
Después de realizar el ensayo, la imagen de Brightfield después de 48 horas reveló la presencia de las cinco rayas de melanóforos pigmentados. En la etapa 48 HPF, se calculó el número de melanóforos laterales y se encontró que los morfantes h2afv de la variante histona demostraron un número reducido de melanóforos en comparación con el control. El valor gris medio se midió para los morfantes CA14 y h2afv, lo que reveló que los valores fueron más altos para las variantes que para los morfantes control.
Mediante el empleo de un método de absorción espectrofotométrica basado en hidróxido de sodio, se cuantificó el contenido de melanina donde los morfantes CA14 mostraron menos contenido que los morfantes control. Se realizaron imágenes de fluorescencia para evaluar la alteración basada en morfolino para diferentes etapas del desarrollo del melanóforo del pez cebra. El número de melanóforos en los morfantes CA14 y h2afv se analizó mediante FACS.
Se observó que el número de melanóforos en CA14 se mantuvo sin cambios, mientras que se redujeron significativamente en h2afv en comparación con el morfante control. También se calculó la intensidad media de fluorescencia por área, demostrando que los morfantes h2afv muestran una disminución considerable en el valor relativo a los morfantes control. Mientras ajusta el pez antes de la imagen, asegúrese de poder visualizar las cinco rayas de melanóforo.
Necesitas inclinar un poco el pez para distinguir entre las dos rayas laterales. Después de establecer el papel de un gen candidato en el desarrollo de melanocitos, podemos eliminar el gen de una manera específica del tejido utilizando la tecnología CRISPR. Ese será un enfoque más específico.
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Visión general
Este estudio investiga el papel de los genes candidatos de pigmentación en la biología de los melanocitos utilizando un sistema modelo de pez cebra. Mediante la empleo de varias técnicas de imagen y ensayos, la investigación identifica reguladores clave del contenido de melanina y el número de melanocitos.
Componentes clave del estudio
Área de investigación
- Desarrollo de melanocitos
- Genética de la pigmentación
- Pez cebra como organismo modelo
Antecedentes
- Entender la función molecular de los genes de pigmentación es esencial para descifrar las variaciones del color de la piel.
- Los factores de confusión en la investigación pueden obstaculizar la evaluación precisa de las funciones de los genes.
- Los embriones de pez cebra proporcionan un modelo efectivo para estudiar procesos de desarrollo tempranos en la pigmentación.
Métodos utilizados
- Inmovilización de embriones y técnicas de imagen
- Pez cebra como modelo biológico
- Citometría de flujo para contar melanocitos y ensayos espectrofotométricos para el contenido de melanina
Resultados principales
- Se observaron números reducidos de melanoforos en los morfolinos h2afv comparados con los controles.
- Los morfolinos CA14 mostraron menos contenido de melanina que los morfolinos de control.
- Las imágenes de fluorescencia confirmaron diferencias de desarrollo en los melanoforos.
Conclusiones
- Los hallazgos ilustran la importancia de genes específicos de pigmentación en el desarrollo de los melanocitos.
- Esta investigación tiene implicaciones más amplias para entender las influencias genéticas en la pigmentación.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables systematic interrogation of genetic regulators in melanocyte development, supporting target validation in pigment-related disorders. By combining phenotypic imaging, flow cytometry, and biochemical assays, it provides quantitative readouts for de-risking mechanistic hypotheses early in discovery. The approach enhances predictive confidence in distinguishing genes affecting melanocyte number versus melanin content per cell, informing portfolio prioritization for topical or systemic modulators.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional dissection of candidate genes into melanocyte specifiers and differentiators based on effects on cell number versus pigment synthesis.
- Operational Value: Uses morpholino knockdown in zebrafish larvae to rapidly assess phenotypic consequences on pigmentation pathways.
- Scientific Value: Supports hypothesis testing by linking gene perturbation to measurable changes in melanophore count and melanin content.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs including mean gray value from brightfield imaging and melanin concentration via spectrophotometry.
- Operational Value: Integrates FACS-based melanocyte counting with imaging to enable high-content phenotypic screening of genetic modulators.
- Scientific Value: Facilitates assay reproducibility through defined staging (48 HPF), immobilization, and imaging parameters for longitudinal comparison.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses transgenic GFP reporters (mitfa, tyrp1) to track melanocyte specification and differentiation stages relevant to human pigmentation biology.
- Operational Value: Enables segregation of hits into mechanistic classes (specifiers vs. differentiators) to guide downstream validation in mammalian models.
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for evaluating genes implicated in piebaldism, albinism, or vitiligo pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are validated for effects on melanocyte biology before compound screening or mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports target validation by isolating gene-specific effects on melanocyte development through morpholino phenocopy and quantitative imaging.
- Screening: Enables assay-ready zebrafish models with fluorescent reporters for scalable evaluation of genetic or small-molecule modulators.
- Analytics: Delivers multiparametric readouts—melanophore number (FACS), melanin content (spectrophotometry), and spatial distribution (imaging)—to support data-driven hit triage.
- Translational Research: Uses conserved melanocyte markers (mitfa, tyrp1) to bridge zebrafish findings to human pigmentation mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for pigment genetics screening applicable across target families and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing genes that alter melanocyte specification from those affecting pigment production per cell.
- Operational Value: Standardizes embryo handling, imaging, and dissociation protocols to ensure reproducibility across laboratories and screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic confidence in target mechanism before investing in medicinal chemistry.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on genetic validation of melanocyte-specific phenotypes.
Implementation Considerations
- Expertise in zebrafish embryology, microinjection, and morpholino design is required for accurate phenotypic assessment.
- Instrumentation includes fluorescence microscopes, flow cytometers, and spectrophotometers for multiparametric readout.
- Standardization across teams requires synchronized staging (HPF), immobilization protocols, and imaging settings to minimize variability.
- Adaptation to other models may require validation of conserved promoter-driven reporters and phenotypic endpoints.
- Limitations include morpholino off-target effects and transient knockdown, necessitating follow-up with CRISPR or mutant lines for target confirmation.
