Inmunofluorescencia de ovario completo, limpieza y microscopía multifotónica para el análisis cuantitativo en 3D de la reserva ovárica en desarrollo en ratones

Este método puede ayudar a responder una de las preguntas clave en el campo reproductivo, a saber, cómo y cuándo los procesos genéticamente regulados influyen en el tamaño de la reserva ovárica que sabemos que afecta a las mujeres, la longevidad reproductiva Este protocolo se puede adoptar para estudios a gran escala utilizando las mismas técnicas para ovarios intactos de diferentes etapas de desarrollo. Genera datos producibles al proporcionar una cuantificación eficiente de las células germinales. Este método aplicado a animales genéticamente diversos de la misma especie puede proporcionar información sobre los factores genéticos directamente en el desarrollo de células germinales y ovarios y otros órganos de desarrollo.

Demostrando el procedimiento estará Nathaniel Boechat, un pasante de investigación de mi laboratorio Para comenzar con el paso de profusión colocar y asegurar el ratón hembra puberal anestesiado sobre su espalda fijando suavemente todas las piernas a través de las almohadillas de las patas en una posición relajada sobre una tabla. Para abrir la cavidad torácica del ratón, corte cuidadosamente las costillas a ambos lados del esternón justo debajo de la escápula, evitando perforar los pulmones, agarre la piel o las solapas de las costillas con las pinzas y fije los colgajos para exponer los órganos internos use tijeras de disección para cortar la aurícula derecha del corazón y liberar sangre del sistema. Luego, sosteniendo el corazón con fórceps, inserte una aguja de perfusión en el ventrículo izquierdo y bombee 10 mililitros de PBS con una presión suave y constante.

Cuando los tejidos, como el hígado, los riñones y el tracto reproductivo cambiaron de rosa a blanco, reemplace el PBS con paraformaldehído o PFA al 1% recién hecho y continúe la perfusión con aproximadamente 10 mililitros de PFA. A continuación, localice la almohadilla de grasa con los ovarios debajo del riñón y diseccione suavemente todo el tracto reproductivo, incluidos los ovarios de la almohadilla de grasa y los cuernos uterinos para colocarla en un vial con 4% de PFA. Fije los ovarios a temperatura ambiente durante 16 a 24 horas antes de reemplazar el 4% de PFA con 70% de etanol.

El día de la tinción recortar los ovarios antes de proceder con la inmunomantación. El primer día del protocolo de inmunomanchado, pipetee un mililitro de PBS por pozo en el número deseado de pozos en una placa limpia de 24 pocillos. Corte la punta de una punta de pipeta de 1000 microlitros para hacer una abertura ancha y use la punta ancha para transferir suavemente los ovarios puberales de los viales con etanol al 70% a los pozos, luego reemplace PBS en el pozo con 0.8 mililitros frescos de PBS Al día siguiente aspire PBS de los pozos para reemplazarlo con 0.8 mililitros del tampón de permeación por pozo.

Después de incubar las placas en el agitador a temperatura ambiente durante cuatro horas, reemplace el tampón de permeación con el tampón de bloqueo En el tercer día, prepare los anticuerpos primarios por dilución en el tampón de bloqueo. Para visualizar los ovocitos incubar los ovarios prenatales y prepúberes con los marcadores de ovocitos. El octavo día, lave las muestras con un tampón de lavado fresco durante dos horas y luego reemplace el tampón de lavado con 0,5 mililitros de las mezclas secundarias de anticuerpos diluidas en un tampón de bloqueo.

Selle la placa con una parapelícula para evitar la evaporación e incube las muestras a temperatura ambiente en la oscuridad durante tres días. El día 11 después del lavado de inmunomanchas, aspire el tampón de lavado e incube las muestras con 0,8 mililitros de la solución cúbica de la escala a 37 grados centígrados durante tres días en la oscuridad. Cambiar la báscula cúbica una solución diaria.

El día 15, lave las muestras tres veces durante 10 minutos y 0,8 mililitros de PBS a temperatura ambiente con un suave agitación. Luego reemplace el PBS con 0.8 mililitros de la sacarosa 20% desgasificada recién preparada con PBS, seguido de un suave agitación a temperatura ambiente. Después de una hora, reemplace la solución de sacarosa al 20% para tratar las muestras con 0,8 mililitros de la solución cúbica de dos a escala durante cuatro a cinco días, como se explicó anteriormente.

Para preparar una configuración de muestra, use una punta de pipeta de 200 microlitros con la punta cortada para transferir los ovarios puberales con 15 a 20 microlitros de solución cúbica de dos escalas en el medio del pozo adhesivo. Una vez que los ovarios se transfieren al pozo individual con una gota de solución de limpieza, coloque suavemente un vidrio de cubierta en el pozo adhesivo y presione para crear un sello que intercale las muestras y la solución de limpieza entre dos deslizamientos de cubierta. Para el lugar de la imagen, el sándwich deslizante de la cubierta en una diapositiva de adaptador de microscopio impresa en 3D.

Configure los parámetros para la adquisición de imágenes de acuerdo con los núcleos de microscopía o las especificaciones del fabricante. Si está disponible, utilice la adquisición bidireccional de imágenes para reducir el tiempo de escaneo y mejorar la eficiencia. Ajuste el promedio de línea, el promedio de fotogramas y la acumulación de fotogramas en el software.

Configure la pila Z identificando la posición inicial y final, luego seleccione un tamaño de paso Z de dos micrómetros para los ovarios prepúberes y cinco micrómetros para los ovarios puberales. A continuación, active la función de compensación Z y la ganancia de excitación. Establezca la compensación Z para la parte inferior y superior de la muestra seleccionando una intensidad de láser para ambos.

Utilice el modo de mosaico para muestras más grandes que no se pueden capturar en un solo campo de visión. Active el navegador de imágenes e indique el número de mosaicos necesarios para capturar toda la muestra con la herramienta de marcado rectangular. Una vez que se realiza la configuración, comience con la adquisición de imágenes para las imágenes con múltiples mosaicos, comience la adquisición de imágenes con el navegador para capturar todos los mosaicos.

Después de la adquisición de la imagen, guarde todas las imágenes. Y si se adquirieron varios mosaicos, ejecute la herramienta de combinación de mosaicos para combinar los mosaicos en una sola imagen. Para determinar el tamaño de los ovocitos, abra la imagen y seleccione la opción slice para abrir la imagen de la pila Zs.

Seleccione la opción de línea y el panel de medida y mida la distancia dibujando una línea desde un borde de un ovocitos o marcador hasta el otro borde en el punto más ancho para determinar el diámetro X Y del ovocito. Muévete por la pila y obtén el rango de diámetros para múltiples ovocitos del mismo tipo. Utilice la longitud más corta como criterio de selección de tamaño para los recuentos de ovocitos.

A continuación, en la opción de vista 3D, seleccione la función de puntos. En el panel de escena, active la función Agregar nuevos puntos para abrir el panel del algoritmo. A continuación, anule la selección de todos los ajustes del algoritmo como el filtro de selección de tamaño con el tamaño de los ovocitos obtenido anteriormente.

Haga clic en la flecha hacia adelante del canal para desplazarse al canal de origen. Luego seleccione el canal con el marcador preferido y escriba el diámetro adquirido en el diámetro estimado X, Y. Después de la selección de tamaño, active el alargamiento PSF del modelo y la resta de fondo que se determinan automáticamente.

Luego, elija la flecha hacia adelante para moverse al panel de puntos de filtro y agregue el filtro de calidad para determinar un umbral. Para garantizar la estimación precisa de los números de ovocitos, amplíe la imagen. Más tarde, haga clic en la flecha doble para finalizar los recuentos automatizados.

Utilice la pestaña de edición para seleccionar manualmente los ovocitos perdidos o anular la selección de las partículas de noocitos seleccionadas por el umbral automático. Cuando haya terminado, registre los datos en la pestaña de estadísticas debajo de la pestaña general para un análisis más detallado. Para estimar el número total de ovocitos y los ovarios dañados, abra imágenes de los ovarios intactos con MRS y seleccione la función de marco.

En la configuración del marco, seleccione las marcas de verificación de la cuadrícula de la casilla y las etiquetas de acceso. En la pestaña de posición XYZ, seleccione 200 micromas para generar marcas de verificación con espacios de 200 micrómetros en todas las posiciones XYZ. Usando las marcas de garrapatas de 200 micrómetros, seleccione ovocitos que caigan dentro del 50% del volumen de cada ovario.

Haga clic en la función de manchas y seleccione las etiquetas de edición para clasificar los ovocitos que se encuentran dentro de la región del 50% por color. En la escala de grises representativa, se pudieron ver imágenes multifotónicas de los ovarios no perfundidos y perfundidos, los pequeños ovocitos en folículos primordiales con la fina capa de tinción citoplasmática DDX4. Además, se detectaron los ovocitos más grandes dentro de los folículos en crecimiento.

Se estudiaron las representaciones 3D de las imágenes multifotónicas de los ovarios prenatal y postnatal. En el día postnatal 28, el ovario de la hembra de control no irradiada contenía una gran población de ovocitos pequeños en los folículos primordiales. En contraste, los ovarios de la hembra irradiada con 0,5 grises de la radiación gamma estaban completamente desprovistos de ovocitos pequeños en los folículos primarios.

Pero los ovocitos más grandes todavía estaban presentes. Para la cuantificación de los ovocitos, las imágenes 3D de múltiples fotones se procesaron en el software MRS utilizando el filtro gouciano y los ovocitos de tamaños pequeños y grandes se identificaron y cuantificaron utilizando la función spot. A continuación, se calculó el porcentaje promedio de ovocitos en cada etapa en comparación con el número promedio presente en la etapa más temprana E 15.5 El número de ovocitos disminuyó bruscamente entre E 15.5 y E 18.5 los ovocitos fetales E 15.5 y E 18.5 expresaron la línea uno o un P como se ve en las imágenes de múltiples fotones.

El análisis de intensidad mostró expresiones más altas de la línea uno orf un P por ovocitos en E 18.5 que en E 15.5. Los ovarios con daño pequeño se pueden utilizar para el análisis. El número total de ovocitos se determina mediante corrección computacional.

El modelo representativo muestra ovocitos G CNA positivos en el ovario E 15.5 con cinco regiones del 10% resaltadas en un ovario intacto. Del mismo modo, se generó un ovario simulado con un 10% de regiones incrementales que faltaban hasta el 50% del ovario. El número total de ovocitos y los ovarios simulados se compararon con los ovarios intactos originales.

Y la diferencia se presentó como el porcentaje de desviación Buena perfusión da como resultado una buena calidad de imagen. Por lo tanto, asegúrese de que todos los tejidos se limpien con PBS antes de cambiar a PFA. Asegúrese de que los ovarios estén completamente expuestos recortando el tejido adicional.

El protocolo permite el análisis eficiente de un gran número de muestras, los datos cuantitativos obtenidos de poblaciones de referencia genética como la producción colaborativa cruzada o de diversidad ayudarán a identificar modificadores genéticos del desarrollo de ovocitos y números de ovocitos.