Name: Inmunofluorescencia de ovario completo, limpieza y microscopía multifotónica para el análisis cuantitativo en 3D de la reserva ovárica en desarrollo en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Aprende inmunofluorescencia de ovario completo y microscopía multifotónica para analizar la reserva ovárica en ratones. Este protocolo permite cuantificación 3D eficiente de células germinales en estudios de biología reproductiva.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01 HD093778 a E.B-F y T32 HD007065 a R.B). Agradecemos a Zachary Boucher por su ayuda con el experimento de radiación. Agradecemos a Mary Ann Handel por la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos la contribución de Sonia Erattupuzha y el Servicio Básico de Microscopía en el Laboratorio Jackson por la asistencia experta con el trabajo de microscopía descrito en esta publicación y Jarek Trapszo de los Servicios de Instrumentos Científicos en el Laboratorio Jackson por diseñar la diapositiva del adaptador impresa en 3D.

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<li>Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+checkpoint+eliminates+mouse+oocytes+with+chromosome+synapsis+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage checkpoint eliminates mouse oocytes with chromosome synapsis failure.</a> Molecular Cell. 67 (6), 1026-1036 (2017).</li>
<li>Bolcun-Filas, E., Rinaldi, V. D., White, M. E., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+female+infertility+by+Chk2+ablation+reveals+the+oocyte+DNA+damage+checkpoint+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reversal of female infertility by Chk2 ablation reveals the oocyte DNA damage checkpoint pathway.</a> Science. 343 (6170), 533-536 (2014).</li>
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<li>McKey, J., Anbarci, D. N., Bunce, C., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+mouse+ovary+morphogenesis+with+developmental+dynamics+of+the+oviduct%2C+ovarian+ligaments%2C+and+rete+ovarii%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Integration of mouse ovary morphogenesis with developmental dynamics of the oviduct, ovarian ligaments, and rete ovarii.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. -W., Hadjantonakis, A. -K., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).</li>
<li>Di Giovanna, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+sample+mounting+for+light-sheet+fluorescence+Microscopy+of+clarified+specimens+by+polydimethylsiloxane+casting%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Tailored sample mounting for light-sheet fluorescence Microscopy of clarified specimens by polydimethylsiloxane casting.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 35(2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Este artículo presenta un protocolo detallado de inmunotinción e imágenes 3D para ovarios prenatales y postnatales para estudios comparativos y de alto rendimiento para la cuantificación de células germinales y la localización de proteínas. Desarrollamos este protocolo para analizar el número de ovocitos en ovarios (N = 6-12) en seis puntos de tiempo de desarrollo en 10-16 cepas diferentes, donde 2-4 placas de 24 pocillos se procesan típicamente a la vez. Este método se puede adaptar para otros órganos o marcadores celul...

La mayoría de las hembras de mamíferos nacen con un número finito de ovocitos detenidos meóicamente almacenados dentro de los folículos primordiales, constituyendo la reserva ovárica (OR)1,2. El quirófano determina la esperanza de vida reproductiva y la salud reproductiva femenina en general3. El quirófano normalmente disminuye de tamaño con el envejecimiento y puede agotarse prematuramente tras la exposición a ciertos agentes genotóxicos (radiación/quimioterapia) y estrés ambiental (desnutrición), lo que lleva a la infertilidad 4,5,6. La infertilidad femenina idiopática a menudo se puede atribuir a la calidad genética y fisiológica de los óvulos que se desarrollan a partir del quirófano y sigue siendo poco conocida 7,8. Debido a que la dotación del folículo femenino está en gran medida predeterminada por el nacimiento, es esencial comprender los mecanismos reguladores involucrados en el establecimiento y mantenimiento del quirófano.
En ratones, la formación de QUIR comienza con la especificación de células germinales primordiales (PGC) alrededor del día embrionario (E) 7.52. Los PGC migran a las crestas genitales, donde residirán aproximadamente en E10.59. La siguiente proliferación extensa ocurre con citocinesis incompleta que resulta en la formación de quistes que se descompondrán más adelante en el desarrollo10,11. Aproximadamente en E12.5, se determina el sexo gonadal y la proliferación de PGC se detiene en los ovarios. En las mujeres, los PGC, ahora ovocitos, entran en la profase I meiótica (IPM) en aproximadamente E13,5 12,13. Los ovocitos progresan a través de un IPM extendido y se detienen en la etapa de dictyate alrededor del momento del nacimiento. Durante la primera semana después del nacimiento, cada ovocito detenido está rodeado de células de granulosa, formando así un folículo primordial.
El número de folículos primordiales en el quirófano de una hembra depende de cuántos ovocitos sobrevivieron a las ondas de eliminación de ovocitos que ocurren antes y durante la detención de MPI a través de apoptosis, autofagia o necrosis14,15. La primera ola ocurre durante el desarrollo fetal y se conoce como FOA. La FOA es un proceso conservado evolutivamente en hembras (mamíferos y no mamíferos), por el cual se estima que el 50-80% de los ovocitos se eliminan dependiendo de la especie femenina 16,17,18,19. En ratones, la FOA ocurre durante E15.5 a E18.5 y se ha atribuido a la reactivación y expresión de secuencias de retrotransposones LINE-1 causando la muerte de ovocitos20,21. La segunda ola de eliminación de ovocitos se produce a través de un punto de control meiótico que elimina ovocitos con defectos meióticos como roturas de doble cadena de ADN no reparadas (DSB)22,23. La siguiente ola de eliminación de ovocitos ocurre durante la descomposición del quiste, culminando durante la formación de folículos primordiales, cada uno de los cuales contiene un solo ovocito 10,11,24,25.
En ratones, la reserva del folículo primordial se establece en gran medida por la pubertad, después de lo cual disminuye a medida que los folículos primordiales se activan para el crecimiento durante los ciclos reproductivos regulares. El tamaño del quirófano varía entre las mujeres individuales y entre las diferentes cepas genéticas de ratones; sin embargo, la regulación genética del tamaño del quirófano no se entiende bien 26,27,28,29. Los estudios genéticos de la regulación del quirófano se ven obstaculizados por la falta de protocolos estandarizados para estudiar las ondas de eliminación de ovocitos durante el desarrollo prenatal y postnatal. Se han desarrollado varias metodologías de cuantificación de ovocitos en ratones, siendo la más común y ampliamente utilizada la evaluación histomorfométrica de las secciones histológicas30,31. En esta técnica, los ovocitos se identifican en secciones seriadas con tinciones histológicas, como hematoxilina y eosina (H&E) y ácido-Schiff periódico (PAS) o marcadores fluorescentes. Esta técnica es confiable si todas las condiciones permanecen constantes, incluido el grosor de la sección, la recuperación eficiente de todas las secciones en todo el ovario y los esquemas de conteo de laboratorios individuales. Sin embargo, los números reportados por diferentes laboratorios a menudo difieren significativamente y, por lo tanto, no son fácilmente comparables.
Además, dadas las diferencias genéticas, el uso de diferentes cepas de ratón también puede influir en los recuentos de ovocitos. Se han desarrollado enfoques computacionales adicionales para la evaluación histomorfométrica e incluyen la detección automatizada de ovocitos utilizando el enfoque fraccionador, el conteo automático utilizando algoritmos computacionales y la reconstrucción 3D de imágenes histológicas para evitar recuentos múltiples del mismo ovocito 31,32,33,34,35,36 . Incluso con estas mejoras añadidas a la evaluación histomorfométrica, la técnica es relativamente laboriosa, particularmente para estudios a gran escala y de alto rendimiento. Los datos recopilados pueden no ser reproducibles y comparables entre los estudios debido a las diferencias en los esquemas de conteo, los algoritmos informáticos y el software utilizado.
Recientemente, acelerado por el desarrollo de nuevos métodos de microscopía multifotónica y de hoja de luz de resolución media y de limpieza óptica de tejidos, las técnicas de modelado y análisis 3D para ovarios intactos se están convirtiendo en el método de elección para cuantificar eficientemente el número de ovocitos y estudiar la localización y dinámica de proteínas37,38. Estos métodos 3D suelen ser ventajosos en comparación con los métodos histológicos, ya que los tejidos y órganos se conservan mejor y se mantienen intactos. Además, el análisis y el modelado 3D proporcionan información adicional sobre la función y las interacciones dentro y entre los nichos celulares o subestructuras dentro del órgano que pueden perderse en el análisis 2D.
El análisis 3D de órganos completos requiere la optimización de los protocolos de fijación, inmunotinción y limpieza óptica para órganos individuales, como los ovarios, sin distorsión o daño tisular. Se requiere una optimización adicional del montaje de muestras para imágenes para microscopía de alta resolución y puede depender de la plataforma de imágenes disponible. Finalmente, la imagen de todo el ovario intacto genera una gran cantidad de datos para análisis computacionales posteriores. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar métodos 3D estandarizados para contar ovocitos para estudios comparativos y en todas las etapas de desarrollo.
Este protocolo utiliza inmunotinción estándar y protocolos de limpieza previamente informados, centrándose en un enfoque simple, fácil de usar y de alto rendimiento 38,39,40,41. El protocolo está optimizado para analizar un gran número de ovarios prenatales y postnatales hasta el día 28 postnatal (P28) y diferentes tamaños de ovarios de diferentes antecedentes genéticos de ratón. Los pasos de inmunotinción son similares para todas las etapas; sin embargo, los protocolos de aclaramiento difieren para los ovarios puberales debido a su mayor tamaño, ScaleS4(0) y CUBIC para ovarios pequeños y grandes, respectivamente40,41. Además, la perfusión de todo el cuerpo se realiza en ratones P28 antes de la fijación para prevenir la autofluorescencia de las células sanguíneas. Se construyó un microscopio multifotónico en la plataforma Leica DIVE/4Tune como alternativa a la microscopía de hojas de luz para adquirir imágenes, y se eligió el software de Visualización y Análisis 3D IMARIS con diversas herramientas analíticas para este protocolo. Este protocolo es fácil de seguir y menos práctico, por lo tanto, ahorra tiempo. Además, la cuantificación de ovocitos es relativamente rápida, dependiendo del tamaño del ovario y la disposición de los ovocitos.

<table><tbody><tr><td>incubadora de sobremesa</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H2200-H</td><td>37 &deg; Incubadora C</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>cepa endogámica</td></tr><tr><td>de ratón Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1435</td><td>Material peligroso</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6021</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Barreras de reactivos FastWells</td><td>GraceBio</td><td>664113</td><td>Junta de silicona pegajosa y flexible (pozo adhesivo)</td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo IgG (H+L) Anticuerpo secundario de adsorción cruzada, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21246</td><td>Dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H+L) anti-rata anti-rata, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21434</td><td>Dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Software IMARIS Oxford</td><td>Instruments</td><td>versión 9.7.0</td><td>Software de visualización y análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Insight X3</td><td>Spectra-Physics</td><td>InSight&nbsp; Láser ultrarrápido sintonizable X3</td><td>Láser para imágenes multifotónicas</td></tr><tr><td>Software LASX</td><td>Leica</td><td>versión 3.5.6</td><td>Software de adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td><td>Leica Leica</td><td>Dmi8, preparado para 2P-M: # Microscopio</td><td>multifotónico</td></tr><tr><td>158005406 MaiTai HP</td><td>Spectra-Physics</td><td>Mai Tai DeepSee One Box Láser láser ultrarrápido</td><td>para imágenes multifotónicas</td></tr><tr><td>Controlador de bomba Masterflex</td><td>SPW</td><td>Industrial Modelo: 7553-50</td><td>Bomba peristáltica para perfusión</td></tr><tr><td>Tijeras Mayo</td><td>FST</td><td>14010-17</td><td>5" &ndash; 7" tijeras romas/romas para la decapitación</td></tr><tr><td>Micro Cubreobjetos, Cuadrados, Nº 1.5 25x25mm</td><td>VWR</td><td>48366-249</td><td></td></tr><tr><td>Mini BioMixer</td><td>Benchmark Scientific B3D1020</td><td></td><td>agitador/nutator para 37 &deg; Incubadora</td></tr><tr><td>C Nikon Ergonomic SMZ1270</td><td>Leica</td><td>&nbsp; Microscopio</td><td>estereoscópico</td></tr><tr><td>SMZ1270 Paraformaldehído 16% (solución acuosa de formaldehído)</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15710</td><td>Materiales</td></tr><tr><td>peligrosos PBS Tabletas, solución salina tamponada con fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2944100</td><td>Disolver en agua Milli-Q</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, 200x, Solución antibiótica doble</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ICN1670249</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol polivinílico (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Quadrol (N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrakis(2-Hidroxipropiletilendiamina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-DDX4/MVH</td><td>Abcam</td><td>ab27591</td><td>Dilución 1:500</td></tr><tr><td>Conejo anti-LINE-1 ORF1p</td><td>Abcam</td><td>ab216324</td><td>Dilución 1:500</td></tr><tr><td>Rata anti-TRA98/GCNA</td><td>Abcam</td><td>ab82527</td><td>Dilución 1:500</td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Material peligroso</td></tr><tr><td>Borohidruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>Material peligroso</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tekmar Agitador orbital</td><td>Bimedis</td><td>VXR-S10</td><td>para temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Trietanolamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>UNOLOK Set de infusión</td><td>MYCO Medical</td><td>7001-23</td><td>agujas para perfusión</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Amresco</td><td>97061-920</td><td></td></tr><tr><td>X-CITE 120LED</td><td>Excelitas</td><td>S/N XT640-W-0147</td><td>lámpara de fluorescencia LED de baja potencia</td></tr></tbody></table>

inmunofluorescencia de ovario completo, limpieza y microscopía multifotónica para el análisis cuantitativo en 3d de la reserva ovárica en desarrollo en ratones

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

La fertilidad femenina y la esperanza reproductiva dependen de la calidad y cantidad de la reserva ovárica de ovocitos. Se estima que el 80% de las células germinales femeninas que entran en la profase I meiótica se eliminan durante el desgaste fetal de ovocitos (FOA) y la primera semana de vida postnatal. Tres mecanismos principales regulan el número de ovocitos que sobreviven durante el desarrollo y establecen la reserva ovárica en las mujeres que entran en la pubertad. En la primera ola de pérdida de ovocitos, el 30-50% de los ovocitos se eliminan durante la FOA temprana, un fenómeno que se atribuye a la alta expresión del elemento nuclear largo intercalado-1 (LINE-1). La segunda ola de pérdida de ovocitos es la eliminación de ovocitos con defectos meióticos mediante un punto de control de calidad meiótica. La tercera ola de pérdida de ovocitos ocurre perinatalmente durante la formación del folículo primordial cuando algunos ovocitos no logran formar folículos. No está claro qué regula cada una de estas tres ondas de pérdida de ovocitos y cómo dan forma a la reserva ovárica en ratones o humanos.
La inmunofluorescencia y la visualización 3D han abierto una nueva vía para obtener imágenes y analizar el desarrollo de ovocitos en el contexto de todo el ovario en lugar de en secciones 2D menos informativas. Este artículo proporciona un protocolo completo para la inmunotinción de ovario completo y la limpieza óptica, lo que produce preparaciones para la obtención de imágenes utilizando microscopía multifotónica y modelado 3D utilizando software disponible comercialmente. Muestra cómo este método se puede utilizar para mostrar la dinámica del desgaste de los ovocitos durante el desarrollo ovárico en ratones C57BL / 6J y cuantificar la pérdida de ovocitos durante las tres ondas de eliminación de ovocitos. Este protocolo se puede aplicar a los ovarios prenatales y postnatales tempranos para la visualización y cuantificación de ovocitos, así como a otros enfoques cuantitativos. Es importante destacar que el protocolo se desarrolló estratégicamente para acomodar el procesamiento de alto rendimiento, confiable y repetible que puede satisfacer las necesidades en toxicología, diagnóstico clínico y ensayos genómicos de la función ovárica.

La inmunotinción e imagen de todo el ovario permite la visualización y cuantificación de ovocitos o expresión de proteínas en ovarios en diferentes etapas de desarrollo utilizando la misma técnica y marcadores (Figura 3). Este protocolo fue desarrollado para un proyecto a gran escala en el que se requirió el análisis de ovarios en múltiples etapas y a partir de múltiples cepas de ratón. Aquí, presentamos los datos recopilados para la cepa C57BL6 / J, una cepa estándar para el análisis genéti...

Aquí, presentamos un protocolo optimizado para obtener imágenes de ovarios enteros para análisis cuantitativos y cualitativos utilizando inmunotinción de montaje completo, microscopía multifotónica y visualización y análisis 3D. Este protocolo se adapta al procesamiento de alto rendimiento, confiable y repetible que es aplicable para toxicología, diagnóstico clínico y ensayos genómicos de la función ovárica.

Inmunofluorescencia de ovario completo, limpieza y microscopía multifotónica para el análisis cuantitativo en 3D de la reserva ovárica en desarrollo en ratones

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Este método puede ayudar a responder una de las preguntas clave en el campo reproductivo, a saber, cómo y cuándo los procesos genéticamente regulados influyen en el tamaño de la reserva ovárica que sabemos que afecta a las mujeres, la longevidad reproductiva Este protocolo se puede adoptar para estudios a gran escala utilizando las mismas técnicas para ovarios intactos de diferentes etapas de desarrollo. Genera datos producibles al proporcionar una cuantificación eficiente de las células germinales. Este método aplicado a animales genéticamente diversos de la misma especie puede proporcionar información sobre los factores genéticos directamente en el desarrollo de células germinales y ovarios y otros órganos de desarrollo.Demostrando el procedimiento estará Nathaniel Boechat, un pasante de investigación de mi laboratorio Para comenzar con el paso de profusión colocar y asegurar el ratón hembra puberal anestesiado sobre su espalda fijando suavemente todas las piernas a través de las almohadillas de las patas en una posición relajada sobre una tabla. Para abrir la cavidad torácica del ratón, corte cuidadosamente las costillas a ambos lados del esternón justo debajo de la escápula, evitando perforar los pulmones, agarre la piel o las solapas de las costillas con las pinzas y fije los colgajos para exponer los órganos internos use tijeras de disección para cortar la aurícula derecha del corazón y liberar sangre del sistema. Luego, sosteniendo el corazón con fórceps, inserte una aguja de perfusión en el ventrículo izquierdo y bombee 10 mililitros de PBS con una presión suave y constante.Cuando los tejidos, como el hígado, los riñones y el tracto reproductivo cambiaron de rosa a blanco, reemplace el PBS con paraformaldehído o PFA al 1% recién hecho y continúe la perfusión con aproximadamente 10 mililitros de PFA. A continuación, localice la almohadilla de grasa con los ovarios debajo del riñón y diseccione suavemente todo el tracto reproductivo, incluidos los ovarios de la almohadilla de grasa y los cuernos uterinos para colocarla en un vial con 4% de PFA. Fije los ovarios a temperatura ambiente durante 16 a 24 horas antes de reemplazar el 4% de PFA con 70% de etanol.El día de la tinción recortar los ovarios antes de proceder con la inmunomantación. El primer día del protocolo de inmunomanchado, pipetee un mililitro de PBS por pozo en el número deseado de pozos en una placa limpia de 24 pocillos. Corte la punta de una punta de pipeta de 1000 microlitros para hacer una abertura ancha y use la punta ancha para transferir suavemente los ovarios puberales de los viales con etanol al 70% a los pozos, luego reemplace PBS en el pozo con 0.8 mililitros frescos de PBS Al día siguiente aspire PBS de los pozos para reemplazarlo con 0.8 mililitros del tampón de permeación por pozo.Después de incubar las placas en el agitador a temperatura ambiente durante cuatro horas, reemplace el tampón de permeación con el tampón de bloqueo En el tercer día, prepare los anticuerpos primarios por dilución en el tampón de bloqueo. Para visualizar los ovocitos incubar los ovarios prenatales y prepúberes con los marcadores de ovocitos. El octavo día, lave las muestras con un tampón de lavado fresco durante dos horas y luego reemplace el tampón de lavado con 0,5 mililitros de las mezclas secundarias de anticuerpos diluidas en un tampón de bloqueo.Selle la placa con una parapelícula para evitar la evaporación e incube las muestras a temperatura ambiente en la oscuridad durante tres días. El día 11 después del lavado de inmunomanchas, aspire el tampón de lavado e incube las muestras con 0,8 mililitros de la solución cúbica de la escala a 37 grados centígrados durante tres días en la oscuridad. Cambiar la báscula cúbica una solución diaria.El día 15, lave las muestras tres veces durante 10 minutos y 0,8 mililitros de PBS a temperatura ambiente con un suave agitación. Luego reemplace el PBS con 0.8 mililitros de la sacarosa 20% desgasificada recién preparada con PBS, seguido de un suave agitación a temperatura ambiente. Después de una hora, reemplace la solución de sacarosa al 20% para tratar las muestras con 0,8 mililitros de la solución cúbica de dos a escala durante cuatro a cinco días, como se explicó anteriormente.Para preparar una configuración de muestra, use una punta de pipeta de 200 microlitros con la punta cortada para transferir los ovarios puberales con 15 a 20 microlitros de solución cúbica de dos escalas en el medio del pozo adhesivo. Una vez que los ovarios se transfieren al pozo individual con una gota de solución de limpieza, coloque suavemente un vidrio de cubierta en el pozo adhesivo y presione para crear un sello que intercale las muestras y la solución de limpieza entre dos deslizamientos de cubierta. Para el lugar de la imagen, el sándwich deslizante de la cubierta en una diapositiva de adaptador de microscopio impresa en 3D.Configure los parámetros para la adquisición de imágenes de acuerdo con los núcleos de microscopía o las especificaciones del fabricante. Si está disponible, utilice la adquisición bidireccional de imágenes para reducir el tiempo de escaneo y mejorar la eficiencia. Ajuste el promedio de línea, el promedio de fotogramas y la acumulación de fotogramas en el software.Configure la pila Z identificando la posición inicial y final, luego seleccione un tamaño de paso Z de dos micrómetros para los ovarios prepúberes y cinco micrómetros para los ovarios puberales. A continuación, active la función de compensación Z y la ganancia de excitación. Establezca la compensación Z para la parte inferior y superior de la muestra seleccionando una intensidad de láser para ambos.Utilice el modo de mosaico para muestras más grandes que no se pueden capturar en un solo campo de visión. Active el navegador de imágenes e indique el número de mosaicos necesarios para capturar toda la muestra con la herramienta de marcado rectangular. Una vez que se realiza la configuración, comience con la adquisición de imágenes para las imágenes con múltiples mosaicos, comience la adquisición de imágenes con el navegador para capturar todos los mosaicos.Después de la adquisición de la imagen, guarde todas las imágenes. Y si se adquirieron varios mosaicos, ejecute la herramienta de combinación de mosaicos para combinar los mosaicos en una sola imagen. Para determinar el tamaño de los ovocitos, abra la imagen y seleccione la opción slice para abrir la imagen de la pila Zs.Seleccione la opción de línea y el panel de medida y mida la distancia dibujando una línea desde un borde de un ovocitos o marcador hasta el otro borde en el punto más ancho para determinar el diámetro X Y del ovocito. Muévete por la pila y obtén el rango de diámetros para múltiples ovocitos del mismo tipo. Utilice la longitud más corta como criterio de selección de tamaño para los recuentos de ovocitos.A continuación, en la opción de vista 3D, seleccione la función de puntos. En el panel de escena, active la función Agregar nuevos puntos para abrir el panel del algoritmo. A continuación, anule la selección de todos los ajustes del algoritmo como el filtro de selección de tamaño con el tamaño de los ovocitos obtenido anteriormente.Haga clic en la flecha hacia adelante del canal para desplazarse al canal de origen. Luego seleccione el canal con el marcador preferido y escriba el diámetro adquirido en el diámetro estimado X, Y. Después de la selección de tamaño, active el alargamiento PSF del modelo y la resta de fondo que se determinan automáticamente.Luego, elija la flecha hacia adelante para moverse al panel de puntos de filtro y agregue el filtro de calidad para determinar un umbral. Para garantizar la estimación precisa de los números de ovocitos, amplíe la imagen. Más tarde, haga clic en la flecha doble para finalizar los recuentos automatizados.Utilice la pestaña de edición para seleccionar manualmente los ovocitos perdidos o anular la selección de las partículas de noocitos seleccionadas por el umbral automático. Cuando haya terminado, registre los datos en la pestaña de estadísticas debajo de la pestaña general para un análisis más detallado. Para estimar el número total de ovocitos y los ovarios dañados, abra imágenes de los ovarios intactos con MRS y seleccione la función de marco.En la configuración del marco, seleccione las marcas de verificación de la cuadrícula de la casilla y las etiquetas de acceso. En la pestaña de posición XYZ, seleccione 200 micromas para generar marcas de verificación con espacios de 200 micrómetros en todas las posiciones XYZ. Usando las marcas de garrapatas de 200 micrómetros, seleccione ovocitos que caigan dentro del 50% del volumen de cada ovario.Haga clic en la función de manchas y seleccione las etiquetas de edición para clasificar los ovocitos que se encuentran dentro de la región del 50% por color. En la escala de grises representativa, se pudieron ver imágenes multifotónicas de los ovarios no perfundidos y perfundidos, los pequeños ovocitos en folículos primordiales con la fina capa de tinción citoplasmática DDX4. Además, se detectaron los ovocitos más grandes dentro de los folículos en crecimiento.Se estudiaron las representaciones 3D de las imágenes multifotónicas de los ovarios prenatal y postnatal. En el día postnatal 28, el ovario de la hembra de control no irradiada contenía una gran población de ovocitos pequeños en los folículos primordiales. En contraste, los ovarios de la hembra irradiada con 0,5 grises de la radiación gamma estaban completamente desprovistos de ovocitos pequeños en los folículos primarios.Pero los ovocitos más grandes todavía estaban presentes. Para la cuantificación de los ovocitos, las imágenes 3D de múltiples fotones se procesaron en el software MRS utilizando el filtro gouciano y los ovocitos de tamaños pequeños y grandes se identificaron y cuantificaron utilizando la función spot. A continuación, se calculó el porcentaje promedio de ovocitos en cada etapa en comparación con el número promedio presente en la etapa más temprana E 15.5 El número de ovocitos disminuyó bruscamente entre E 15.5 y E 18.5 los ovocitos fetales E 15.5 y E 18.5 expresaron la línea uno o un P como se ve en las imágenes de múltiples fotones.El análisis de intensidad mostró expresiones más altas de la línea uno orf un P por ovocitos en E 18.5 que en E 15.5. Los ovarios con daño pequeño se pueden utilizar para el análisis. El número total de ovocitos se determina mediante corrección computacional.El modelo representativo muestra ovocitos G CNA positivos en el ovario E 15.5 con cinco regiones del 10% resaltadas en un ovario intacto. Del mismo modo, se generó un ovario simulado con un 10% de regiones incrementales que faltaban hasta el 50% del ovario. El número total de ovocitos y los ovarios simulados se compararon con los ovarios intactos originales.Y la diferencia se presentó como el porcentaje de desviación Buena perfusión da como resultado una buena calidad de imagen. Por lo tanto, asegúrese de que todos los tejidos se limpien con PBS antes de cambiar a PFA. Asegúrese de que los ovarios estén completamente expuestos recortando el tejido adicional.El protocolo permite el análisis eficiente de un gran número de muestras, los datos cuantitativos obtenidos de poblaciones de referencia genética como la producción colaborativa cruzada o de diversidad ayudarán a identificar modificadores genéticos del desarrollo de ovocitos y números de ovocitos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Aquí presentamos una adaptación de la pasivo claridad y método de la reconstrucción 3D para la visualización de la vasculatura ovárica y foliculares capilares en ovarios de ratón intacto.

Reconstrucción tridimensional de la arquitectura Vascular del ovario de ratón pasivo claridad-despejado

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar los folículos en los ovarios cultivados de ratones jóvenes sin seccionamiento serial. Con inmunofluorescencia de todo órgano y tejido claro, seccionar físico se sustituye por seccionamiento óptico. Este método de preparación de la muestra y visualización mantiene la integridad de órganos y facilita la cuantificación automática de células específicas.

Todo Monte inmunofluorescencia y cuantificación del folículo de los ovarios de ratón cultivadas

Cultivos de tejido ováricos se puede utilizar como modelos de la atresia de desarrollo, la ovulación y el folículo folículo e indicar mecanismos reguladores de procesos dinámicos de ovarianos.

Cultivo de tejido ovárico para visualizar fenómenos en ovario de ratón

Aquí, describimos, comparamos, y ponemos en contraste dos diversas técnicas para la cuenta exacta del folículo de tejidos ováricos fijos del ratón.

Enumeración exacta del folículo en ovarios adultos del ratón

Este protocolo describe el cultivo primario / co-cultivo de tejido ovárico ratón, utilizando los ovarios de ratones recién nacidos y los folículos ováricos individuales de ratones prepúberes. Las técnicas de cultivo de apoyar el desarrollo de una manera altamente fisiológica, lo que permite la investigación del efecto de los agentes extrínsecos en el ovario, y de las interacciones entre los folículos ováricos.

Cultura y Co-cultura de ratón ovarios y los folículos ováricos

Las mutaciones que conducen a defectos cardíacos congénitos se benefician de la investigación in vivo de la estructura cardíaca durante el desarrollo, pero los estudios estructurales de alta resolución en el corazón embrionario de ratón son técnicamente desafiantes. Aquí presentamos un método robusto de inmunofluorescencia y análisis de imágenes para evaluar las estructuras específicas de los cardiomiocitos en el corazón de ratón en desarrollo.

Análisis para el Desarrollo de los cardiomiocitos mediante inmunofluorescencia en el corazón de embriones de ratón

Se presenta un método para el aislamiento y cultivo de conducto de Wolff ratón (WD). También demostramos un procedimiento detallado para toda la inmunotinción monte de WDS cultivadas / recién aisladas con anticuerpos marcados con fluorescencia. En conjunto, estas técnicas permiten el estudio del desarrollo de WD, bobinado, y la diferenciación.

Cultura de órganos y todo el montaje Inmunofluorescencia La tinción de mouse de Wolff Conductos

Este protocolo demuestra un método basado en la fluorescencia para visualizar la vasculatura y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden visualizarse minutos después de la inyección de un colorante fluorescente en el corazón de un embrión después de manipulaciones genéticas y / o farmacológicas para estudiar el desarrollo cardiovascular in vivo .

Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Este protocolo describe los pasos necesarios para obtener resultados de localización subcelular de la proteína en la retina de pez cebra por microscopía de superresolución la correlación y análisis de imágenes de microscopia electrónica.

Resolución súper correlativo y la microscopia electrónica para resolver la localización de la proteína en la Retina del pez cebra

En este protocolo, describimos las técnicas para la adecuada disección de flores de Arabidopsis y silicuas, algunas técnicas de compensación básica y seleccionado procedimientos de observaciones del conjunto de montaje de estructuras reproductivas de tinción.

Whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de Arabidopsis

Aprende inmunofluorescencia de ovario completo y microscopía multifotónica para analizar la reserva ovárica en ratones. Este protocolo permite cuantificación 3D eficiente de células germinales en estudios de biología reproductiva.

Inmunofluorescencia de ovario completo, limpieza y microscopía multifotónica para el análisis cuantitativo en 3D de la reserva ovárica en desarrollo en ratones (Video) | JoVE Journal

Inmunofluorescencia de ovario completo, limpieza y microscopía multifotónica para el análisis cuantitativo en 3D de la reserva ovárica en desarrollo en ratones

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