Name: Optimización del modelo de ratón de oclusión de venas retinianas para limitar la variabilidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprende a optimizar un modelo de oclusión de venas retinianas en ratones usando rosa de bengala y láser para estudiar lesiones vasculares y edema en tiempo real sin cirugía.

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<div>Este trabajo fue apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (a CCO), el Instituto Nacional del Ojo (NEI) 5T32EY013933 (a AMP) y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA) R21AG063012 (a CMT).</div>

Este protocolo sigue la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Los experimentos con roedores fueron aprobados y monitoreados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Columbia.
NOTA: Todos los experimentos utilizaron ratones machos de dos meses de edad que pesaban aproximadamente 20 g.
1. Preparación y administración de tamoxifeno para la ablación genética inducible de genes floxed
NOTA: El diámetro de los vasos retinianos puede verse afectado por el peso del animal. Asegúrese de que todos los animales utilizados para un experimento tengan pesos similares.
<ol><li>Diluir tamoxifeno en aceite de maíz a una concentración de 20 mg / ml. NOTA: El tamoxifeno es un tóxico y es sensible a la luz. Protéjase de la luz, por ejemplo, con papel de aluminio.</li>
	<li>Vórtice la solución durante un par de segundos.</li>
	<li>Dejar en el horno a 55 °C durante 15 min. NOTA: Asegúrese de que el tamoxifeno se haya disuelto completamente. Puede ser necesario un vórtice adicional.</li>
	<li>Conservar la solución a 4 °C durante un máximo de 1 semana.</li>
	<li>Use una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 26 g para la inyección de tamoxifeno. Limpie el área de inyección con etanol al 70%.  Administrar 2 mg de tamoxifeno (100 μL de 20 mg/ml) por vía intraperitoneal (IP) una vez al día durante el tiempo establecido según la línea Cre inducible específica.</li>
	<li>Permita dos días de descanso para los animales antes de comenzar los experimentos.</li>
</ol>2. Preparación de reactivos para fotocoagulación láser
<ol><li>Rosa de bengala NOTA: La rosa de bengala es sensible a la luz. Almacenar en la oscuridad hasta su uso y preparar fresco para obtener mejores resultados.<ol><li>Prepare la rosa de bengala diluyéndola a 5 mg/ml en solución salina estéril y filtre a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm.</li>
		<li>Prepare una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 26 G con rosa de bengala.</li>
	</ol></li>
	<li>Ketamina/xilazina<ol><li>Diluir ketamina y xilazina en solución salina estéril en consecuencia para las siguientes concentraciones: ketamina (80-100 mg/kg) y xilazina (5-10 mg/kg).</li>
	</ol></li>
	<li>Carprofeno<ol><li>Diluir el carprofeno a 1 mg/ml en solución salina estéril.</li>
		<li>Prepare una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 26 G con carprofeno.</li>
	</ol></li>
	<li>Solución salina estéril<ol><li>Prepare una jeringa de 5 ml equipada con una aguja de 26 g con solución salina estéril.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Configuración del láser
<ol><li>Manipule suavemente el cable de fibra óptica y conéctelo a la caja de control láser y al adaptador láser del microscopio de imágenes de retina.</li>
	<li>Encienda la caja de la lámpara del microscopio de imágenes de retina.</li>
	<li>Encienda el equipo y abra el programa de imágenes.</li>
	<li>Ajuste el balance de blancos utilizando un trozo de papel blanco y colocándolo delante del ocular del ratón y haciendo clic en Ajustar en el programa de imágenes.</li>
	<li>Encienda la caja de control láser girando la llave y siguiendo las instrucciones en la pantalla de la caja de control láser. NOTA: El láser utilizado en este experimento es de clase 3B y puede causar daño ocular. Use gafas protectoras cuando opere el láser.</li>
	<li>Verifique la potencia láser de referencia.<ol><li>Utilice un medidor de potencia láser.</li>
		<li>Ajuste la pantalla de la caja de control láser a los siguientes parámetros: 50 mW y 2.000 ms.</li>
		<li>Encienda el láser y coloque el medidor de potencia delante del ocular. NOTA: Asegúrese de que la luz del microscopio esté apagada mientras prueba la potencia láser de referencia.</li>
		<li>Presione el pedal del pedal para activar el láser.</li>
		<li>Apunte a que la lectura de potencia del láser sea de 13-15 mW. NOTA: La lectura de potencia del láser determinará la tasa de éxito de las oclusiones de las venas retinianas. Si la lectura de potencia del láser es demasiado baja, se pueden realizar ajustes en la potencia y el tiempo de exposición al láser. Véanse las recomendaciones en el cuadro 1 .</li>
	</ol></li>
	<li>Ajuste la potencia del láser experimental configurando la pantalla de la caja de control láser para los siguientes parámetros: 100 mW, 1.000 ms.</li>
	<li>Apague el láser. NOTA: Por seguridad y para evitar el sobrecalentamiento, es mejor mantener el láser apagado entre ratones.</li>
</ol>4. Inyección de rosa bengala en la vena de la cola del ratón
<ol><li>Vierta 300 ml de agua en un vaso de precipitados de 500 ml.</li>
	<li>Caliente el vaso de precipitados en un horno de microondas durante 1 min.</li>
	<li>Ponga una gasa en el agua tibia en el vaso de precipitados.</li>
	<li>Coloque el ratón en un retenedor.</li>
	<li>Presione la gasa en la cola del ratón suavemente y busque las venas dilatadas. Desinfecte el lugar de la inyección con una toallita con alcohol después de la dilatación con agua tibia.</li>
	<li>Inserte la aguja en el lugar de la inyección y tire de la jeringa para asegurarse de que está en la vena. Luego, inyecte la vena de la cola del ratón, administrando la cantidad correcta de acuerdo con el peso del animal (37.5 mg / kg). Aplique presión en el lugar de la inyección para evitar hematomas o sangrado. Limpie el sitio.</li>
	<li>Suelte el ratón del sistema de sujeción y devuélvalo a la jaula.</li>
	<li>Deje que circulen 8 minutos para que la rosa de bengala circule antes de la inyección de anestésicos. NOTA: Esto proporcionará un total de 10 minutos entre la inyección de rosa de bengala y la irradiación láser.</li>
</ol>5. Oclusión de las venas principales
<ol><li>Encienda la plataforma del ratón con calefacción.</li>
	<li>Agregue una gota de fenilefrina y tropicamida en cada ojo.</li>
	<li>Inyectar 150 μL de los anestésicos, ketamina (80-100 mg/kg) y xilazina (5-10 mg/kg) IP. NOTA: Durante este procedimiento, el ratón recibió dos inyecciones IP. Por lo tanto, los lados se alternaron. La inyección IP para la anestesia se administró en el cuadrante abdominal inferior derecho, y la solución salina se inyectó en el cuadrante abdominal inferior izquierdo. Se recomienda tirar de la jeringa antes de inyectarla para asegurarse de que la aguja esté en el abdomen y no en ningún órgano.</li>
	<li>Pellizque el dedo del pie al animal para determinar la profundidad de la anestesia y espere hasta que no responda.</li>
	<li>Agregue una gota de clorhidrato de proparacaína por ojo (analgésico).</li>
	<li>Agregue ungüento de gel a ambos ojos.</li>
	<li>Inyecte 150 μL de carprofeno por vía subcutánea entre las orejas.</li>
	<li>Coloque el ratón en la plataforma.</li>
	<li>Ajuste la plataforma hasta que la vista del fondo de la retina sea clara y enfocada.</li>
	<li>Cuente las venas de la retina y tome una imagen del fondo de ojo. NOTA: Las venas retinianas son más oscuras y anchas que las arterias. Las venas y las arterias se alternan; Sin embargo, a veces puede haber una arteria ramificada cerca del nervio óptico y, por lo tanto, dos arterias adyacentes.</li>
	<li>Encienda el láser y apunte hacia una vena retiniana a aproximadamente 375 μm del disco óptico.</li>
	<li>Irradiar el recipiente presionando el interruptor de pedal y moviendo ligeramente el rayo láser hasta 100 μm. Repita este paso tres veces y mueva el rayo láser después de cada pulso para que la irradiación no se enfoque en un punto.</li>
	<li>Repita la irradiación en otros vasos principales para lograr 2-3 oclusiones.</li>
</ol>6. Establecer el número de venas ocluidas en el día 0
<ol><li>Apague la lámpara después de irradiar los recipientes y espere 10 minutos. NOTA: La exposición a la luz puede causar daño e inflamación en la retina; Apague la lámpara durante el tiempo de espera para minimizar la exposición7.</li>
	<li>Vuelva a encender la lámpara y cuente el número de venas ocluidas.</li>
	<li>Tome una imagen del fondo de ojo.</li>
</ol>7. Cuidados posteriores
<ol><li>Inyecte 1 ml de solución salina IP estéril. NOTA: Consulte los detalles de la inyección IP en la sección 5, paso 3.</li>
	<li>Agregue gotas oftálmicas lubricantes en ambos ojos.</li>
	<li>Agregue ungüento de gel a ambos ojos.</li>
	<li>Observe al ratón mientras se recupera de la anestesia y no lo devuelva a la jaula con los otros animales hasta que esté completamente recuperado. El carprofeno (5 mg/kg) se puede administrar diariamente hasta 2 días después del procedimiento. Si se aplica a los seres humanos, el dolor no es un síntoma de RVO. NOTA: No deje a los animales desatendidos hasta que se recuperen completamente de la anestesia.</li>
</ol>8. Evaluación del edema retiniano mediante tomografía de coherencia óptica (OCT)
NOTA: Este paso se puede realizar en el momento de interés del investigador. El pico de edema retiniano para un ratón C57BL / 6J es 1 día después del procedimiento RVO. Este punto de tiempo puede variar dependiendo del fondo del mouse.
<ol><li>Encienda la caja de luz del microscopio de imágenes de retina, la máquina OCT y la plataforma de ratón calentado.</li>
	<li>El día después de la oclusión, siga los pasos 5.2 a 5.7 para preparar al animal.</li>
	<li>Abra los programas de software de creación de imágenes y OCT.</li>
	<li>En el programa OCT, ajuste el empujón a 5.</li>
	<li>Tome OCT a 75 μm distal de la quemadura o 4 clics.</li>
	<li>Tome imágenes de OCT en cuatro cuadrantes de la retina.</li>
	<li>Analice las imágenes de OCT con el software de rastreo.</li>
	<li>Compare el grosor retiniano de las medidas preirradiadas con 1 día después de la OVR o en el momento de interés. NOTA: Al analizar los datos, tenga en cuenta el número de venas irradiadas, ya que esto puede influir en el desarrollo de edema retiniano. Luego, los animales son sacrificados mediante la administración de anestesia seguida de cirugía de no supervivencia por perfusión.</li>
</ol>

<ol><li>Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epidemiology+of+retinal+vein+occlusion%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+prevalence%2C+incidence%2C+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors.</a> Journal of Global Health. 9 (1), 010427(2019).</li>
<li>Ehlers, J. P., Fekrat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vein+occlusion%3A+beyond+the+acute+event%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Retinal vein occlusion: beyond the acute event.</a> Survey of Ophthalmology. 56 (4), 281-299 (2011).</li>
<li>Iftikhar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+peak+vision+in+retinal+vein+occlusion+patients+treated+for+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Loss of peak vision in retinal vein occlusion patients treated for macular edema.</a> American Journal of Ophthalmology. 205, 17-26 (2019).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+mouse+model+of+branch+retinal+vein+occlusion+and+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).</li>
<li>Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+retinal+morphology+alterations+using+spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+a+mouse+model+of+retinal+branch+and+central+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion.</a> PLoS One. 10 (3), 0119046(2015).</li>
<li>Fuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pharmacological+approach+in+newly+established+retinal+vein+occlusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model.</a> Scientific Reports. 7, 43509(2017).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+microglia+and+chemokines+in+light-induced+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Activation of microglia and chemokines in light-induced retinal degeneration.</a> Molecular Vision. 11, 887-895 (2005).</li>
<li>Avrutsky, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+activation+of+caspase-9+promotes+neurovascular+injury+in+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion.</a> Nature Communications. 11 (1), 3173(2020).</li>
<li>Nicholson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+accuracy+of+disorganization+of+the+retinal+inner+layers+in+detecting+macular+capillary+non-perfusion+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).</li>
<li>Moein, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+angiography+to+detect+macular+capillary+ischemia+in+patients+with+inner+retinal+changes+after+resolved+diabetic+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography angiography to detect macular capillary ischemia in patients with inner retinal changes after resolved diabetic macular edema.</a> Retina. 38 (12), 2277-2284 (2018).</li>
<li>Hirabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+model+of+central+retinal+vascular+occlusion+and+the+therapeutic+potential+of+the+adrenomedullin-receptor+activity-modifying+protein+2+system%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Development of a novel model of central retinal vascular occlusion and the therapeutic potential of the adrenomedullin-receptor activity-modifying protein 2 system.</a> American Journal of Pathology. 189 (2), 449-466 (2019).</li>
<li>Martin, G., Conrad, D., Cakir, B., Schlunck, G., Agostini, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+in+a+mouse+model+of+retinal+vein+occlusion+induced+by+laser+treatment+reveals+a+predominant+inflammatory+and+tissue+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling in a mouse model of retinal vein occlusion induced by laser treatment reveals a predominant inflammatory and tissue damage response.</a> PLoS One. 13 (3), 0191338(2018).</li>
<li>Drechsler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+intravitreal+anti-vascular+endothelial+growth+factor+treatment+on+the+retinal+gene+expression+in+acute+experimental+central+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of intravitreal anti-vascular endothelial growth factor treatment on the retinal gene expression in acute experimental central retinal vein occlusion.</a> Ophthalmic Research. 47 (3), 157-162 (2012).</li>
<li>Genevois, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+remodeling+after+occlusion-recanalization+of+a+branch+retinal+vein+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Microvascular remodeling after occlusion-recanalization of a branch retinal vein in rats.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (2), 594-600 (2004).</li>
<li>Khayat, M., Lois, N., Williams, M., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Animal models of retinal vein occlusion.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (14), 6175-6192 (2017).</li>
<li>Nguyen, V. P., Li, Y., Zhang, W., Wang, X., Paulus, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+multimodal+photoacoustic+microscopy+and+optical+coherence+tomography+image-guided+laser+induced+branch+retinal+vein+occlusion+in+living+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-resolution multimodal photoacoustic microscopy and optical coherence tomography image-guided laser induced branch retinal vein occlusion in living rabbits.</a> Scientific Reports. 9 (1), 10560(2019).</li>
<li>Sayyed, S. A. A. R., Beedri, N. I., Kadam, V. S., Pathan, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rose+Bengal+sensitized+bilayered+photoanode+of+nano-crystalline+TiO2-CeO2+for+dye-sensitized+solar+cell+application%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Nanoscience%22%5BJournal%5D)">Rose Bengal sensitized bilayered photoanode of nano-crystalline TiO2-CeO2 for dye-sensitized solar cell application.</a> Applied Nanoscience. 6 (6), 875-881 (2015).</li>
<li>Emmart, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+absorption+spectra+of+fluorescein%2C+fluorescein+derivatives+and+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Observations on the absorption spectra of fluorescein, fluorescein derivatives and conjugates.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 73 (1), 1-8 (1958).</li>
<li>Yu, L., Liu, Z., Liu, S., Hu, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fading+spectrophotometric+method+for+the+determination+of+polyvinylpyrrolidone+with+eosin+Y%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fading spectrophotometric method for the determination of polyvinylpyrrolidone with eosin Y.</a> Chinese Journal of Chemistry. 27 (8), 1505-1509 (2009).</li>
<li>MacDonald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABCs+of+RVO%3A+a+review+of+retinal+venous+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Optometry%22%5BJournal%5D)">The ABCs of RVO: a review of retinal venous occlusion.</a> Clinical & Experimental Optometry. 97 (4), 311-323 (2014).</li>
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<li>LaVail, M. M., Gorrin, G. M., Repaci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+in+sensitivity+to+light-induced+photoreceptor+degeneration+in+albino+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Strain differences in sensitivity to light-induced photoreceptor degeneration in albino mice.</a> Current Eye Research. 6 (6), 825-834 (1987).</li>
<li>Jeffery, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+albino+retina%3A+an+abnormality+that+provides+insight+into+normal+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The albino retina: an abnormality that provides insight into normal retinal development.</a> Trends in Neurosciences. 20 (4), 165-169 (1997).</li>
<li>Kinnear, P. E., Jay, B., Witkop, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albinism%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Albinism.</a> Survey of Ophthalmology. 30 (2), 75-101 (1985).</li>
<li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+weight+gain+modifies+severity+and+functional+outcome+of+oxygen-induced+proliferative+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy.</a> American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El modelo RVO de ratón proporciona una vía para comprender mejor la patología de RVO y probar posibles terapias. Si bien el modelo RVO del ratón se usa ampliamente en el campo, existe la necesidad de un protocolo detallado actual del modelo que aborde su variabilidad y describa la optimización del modelo. Aquí, proporcionamos una guía con ejemplos de la experiencia sobre lo que se puede alterar para obtener los resultados más consistentes en una cohorte de animales experimentales y proporcionar datos confiables.
<p c...

La oclusión de la vena retiniana (OVR) es una enfermedad vascular retiniana común que afectó a aproximadamente 28 millones de personas en todo el mundo en 20151. La OVR conduce a la disminución y pérdida de la visión en adultos en edad laboral y ancianos, lo que representa una enfermedad continua que amenaza la vista y que se estima que aumentará durante la próxima década. Algunas de las distintas patologías de la OVR incluyen lesión hipóxico-isquémica, edema retiniano, inflamación y pérdida neuronal2. Actualmente, la primera línea de tratamiento para este trastorno es a través de la administración de inhibidores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Si bien el tratamiento anti-VEGF ha ayudado a mejorar el edema retiniano, muchos pacientes aún enfrentan una disminución de la visión3. Para comprender mejor la fisiopatología de esta enfermedad y probar posibles nuevas líneas de tratamiento, es necesario constituir un protocolo funcional y detallado de modelo de ratón RVO para diferentes cepas de ratones.
Se han desarrollado modelos de ratón implementando el mismo dispositivo láser utilizado en pacientes humanos, junto con un sistema de imágenes escalado al tamaño correcto para un ratón. Este modelo de ratón de RVO fue reportado por primera vez en 20074 y establecido por Ebneter y otros 4,5. Finalmente, el modelo fue optimizado por Fuma et al. para replicar manifestaciones clínicas clave de la OVR, como el edema retiniano6. Desde que se informó por primera vez del modelo, muchos estudios lo han empleado utilizando la administración de un tinte fotosensibilizador seguido de fotocoagulación de las principales venas de la retina con un láser. Sin embargo, la cantidad y el tipo de tinte que se administra, la potencia del láser y el tiempo de exposición varían significativamente entre los estudios que han utilizado este método. Estas diferencias a menudo pueden conducir a una mayor variabilidad en el modelo, lo que dificulta su replicación. Hasta la fecha, no hay estudios publicados con detalles específicos sobre posibles vías para su optimización.
Este informe presenta una metodología detallada del modelo de ratón RVO en la cepa C57BL / 6J y una cepa knockout endotelial 9 inducible por tamoxifeno (iEC Casp9KO) con un fondo C57BL / 6J y de relevancia para la patología RVO como cepa de referencia para un ratón modificado genéticamente. Un estudio previo había demostrado que la activación no apoptótica de la caspasa-9 endotelial instiga el edema retiniano y promueve la muerte neuronal8. La experiencia con esta cepa ayudó a determinar y proporcionar información sobre posibles modificaciones para adaptar el modelo de ratón RVO, que puede ser aplicable a otras cepas modificadas genéticamente.

<table><tbody><tr><td>Carprofeno</td><td>Rimadyl</td><td>NADA #141-199</td><td>mantener a 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Aceite</td><td>de maíz Sigma-Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>Cable de conexión de fibra</td><td>Thor Labs</td><td>M14L02</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal</td><td>Alcon</td><td>00658 06401</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de ketamina</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-0702-1</td><td></td></tr><tr><td>Lasercheck</td><td>Coherente</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>Fenilefrina</td><td>Akorn</td><td>NDCL174478-201-15</td><td></td></tr><tr><td>Phoneix Micron IV con Meridian,&nbsp; StreamPix, y módulos OCT</td><td>Phoenix Technology Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de proparacaína</td><td>Akorn</td><td>NDC: 17478-263-12</td><td>mantener en 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Refresh</td><td>Allergan</td><td>94170</td><td></td></tr><tr><td>Rosa Bengala</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330000-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamida</td> sensible a la luz <td>Akorn</td><td>NDC: 174478-102-12</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Akorn</td><td>NDCL 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

optimización del modelo de ratón de oclusión de venas retinianas para limitar la variabilidad

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Los modelos de ratón de oclusión de la vena retiniana (OVR) se utilizan a menudo en oftalmología para estudiar la lesión hipóxico-isquémica en la retina neural. En este informe, se proporciona un método detallado que señala los pasos críticos con recomendaciones de optimización para lograr tasas de oclusión consistentemente exitosas en diferentes cepas de ratones modificados genéticamente. El modelo de ratón RVO consiste principalmente en la administración intravenosa de un colorante fotosensibilizador seguido de fotocoagulación con láser utilizando un microscopio de imágenes de retina conectado a un láser guiado oftálmico. Se identificaron tres variables como determinantes de la consistencia de la oclusión. Al ajustar el tiempo de espera después de la administración de rosa de bengala y equilibrar la línea de base y la salida experimental del láser, la variabilidad entre los experimentos puede ser limitada y se puede lograr una mayor tasa de éxito de oclusiones. Este método se puede utilizar para estudiar enfermedades de la retina que se caracterizan por edema retiniano y lesión hipóxico-isquémica. Además, como este modelo induce lesión vascular, también se puede aplicar para estudiar la neurovasculatura, la muerte neuronal y la inflamación.

El modelo de ratón RVO tiene como objetivo lograr con éxito oclusiones en las venas retinianas, lo que lleva a la lesión hipóxico-isquémica, ruptura de la barrera retiniana sanguínea, muerte neuronal y edema retiniano8. La Figura 1 muestra una línea de tiempo de pasos para garantizar la reproducibilidad, un esquema del diseño experimental y describe los pasos que se pueden optimizar aún más dependiendo de las preguntas experimentales. Los tres pasos principales que se...

Aquí, describimos un protocolo optimizado para la oclusión de la vena retiniana utilizando rosa de bengala y un sistema de microscopio de imágenes de retina guiado por láser con recomendaciones para maximizar su reproducibilidad en cepas modificadas genéticamente.

Optimización del modelo de ratón de oclusión de venas retinianas para limitar la variabilidad

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

El protocolo proporciona un modelo para investigar los mecanismos de lesión vascular y el posterior desarrollo de edema de una manera no invasiva. La principal ventaja de esta técnica es que se puede seguir la lesión en vivo a lo largo del tiempo sin intervención quirúrgica. Esto proporciona vías para probar tratamientos de manera más eficiente.Puede ser difícil aprender a realizar el veneado adecuado de la cola y acomodar al animal en la plataforma correctamente. Para ambas técnicas recomiendo ser paciente y tomar las cosas con calma. Para comenzar, maneje suavemente el cable de fibra óptica y conéctelo a la caja de control láser y al adaptador láser del microscopio de imágenes de retina, luego encienda la caja de la lámpara del microscopio de imágenes de retina.Encienda la computadora y abra el programa de imágenes. Coloque un pedazo de papel blanco frente al ocular del microscopio y ajuste el balance de blancos haciendo clic en Ajustar en el programa de imágenes. Encienda la caja de control láser girando la llave y siguiendo las instrucciones en la pantalla de la caja de control láser.Para verificar la potencia láser de referencia, ajuste la caja de control láser a 50 milivatios y 2.000 milisegundos. Luego encienda el láser y coloque el medidor de potencia frente al ocular. Presione el pedal del interruptor para activar el láser, con el objetivo de que la lectura de potencia del láser sea de 13 a 15 milivatios.Luego, usando la pantalla de la caja de control láser, ajuste la potencia del láser experimental a 100 milivatios y 1, 000 milisegundos, y apague el láser. Vierta 300 mililitros de agua en un vaso de precipitados de 500 mililitros y caliente el vaso de precipitados en un horno de microondas durante un minuto. Luego coloque una gasa en el agua tibia.A continuación, coloque un ratón macho de dos meses en un retenedor. Presione suavemente la gasa tibia en la cola del ratón y busque las venas dilatadas. Con una aguja de calibre 26, inyecte la cantidad adecuada de rosa de bengala de acuerdo con el peso del animal y aplique presión en el lugar de la inyección para evitar hematomas o sangrado antes de limpiar el sitio.Luego suelte el mouse del restringido y devuélvalo a la jaula. Espere ocho minutos para que la rosa de bengala circule antes de la inyección de anestésicos. Encienda la plataforma del ratón con calefacción.Luego agregue una gota de fenilefrina y tropicamida en cada ojo del ratón. Después de confirmar la anestesia, agregue una gota de clorhidrato de proparacaína por ojo, luego agregue ungüento para los ojos en ambos ojos. A continuación, inyecte 150 microlitros de carprofeno por vía subcutánea entre las orejas.Luego acomode el mouse en la plataforma y ajuste la plataforma hasta que la vista del fondo de ojo de la retina sea clara y enfocada. Cuente las venas de la retina y tome una imagen del fondo de ojo. A continuación, encienda el láser y apunte hacia una vena retiniana aproximadamente a 375 micrómetros del disco óptico.Irradiar el recipiente presionando el interruptor del pie y moviendo ligeramente el rayo láser hasta 100 micrómetros. Repita este paso tres veces y mueva el rayo láser después de cada pulso para que la irradiación no se enfoque en un punto. Repita la irradiación en otros vasos principales para lograr de dos a tres oclusiones.Después de irradiar los vasos, apague la lámpara y espere 10 minutos. Luego vuelva a encender la lámpara, cuente el número de venas ocluidas y tome una imagen del fondo de ojo. Después de la adquisición de imágenes y la inyección de solución salina, agregue gotas oftálmicas lubricantes y ungüento de gel en ambos ojos.Observe al ratón mientras se recupera de la anestesia y devuélvalo a la jaula con otros animales solo cuando esté completamente recuperado. El número de oclusiones logradas inmediatamente después de la irradiación láser no fue diferente entre los animales que fueron sometidos con láser 10 y 20 minutos después de la administración de rosa de bengala. El número de oclusiones sostenidas hasta un día después de la oclusión de la vena retiniana disminuyó significativamente en animales con láser 20 minutos después de la administración de rosa de bengala, independientemente del genotipo.Sin modificar la potencia experimental de 100 milivatios, una potencia láser de referencia baja de 11,5 milivatios no dio lugar a oclusiones. En contraste, una salida láser de referencia de 13.5 milivatios resultó en oclusiones exitosas. Cuatro tipos principales de oclusiones ocurren después de la fotocoagulación con láser: vasos completamente ocluidos, vasos parcialmente ocluidos, vasos parcialmente reperfundidos y vasos completamente reperfundidos.La vasculatura irradiada de ratones knockout Casp9 de células endoteliales inducibles por tamoxifeno pasó más tiempo en estados parcialmente reperfundidos y parcialmente ocluidos que la de los ratones C57 Black 6, que pasaron más tiempo en estados completamente ocluidos. El estado de oclusión de los vasos cambia rápidamente dentro de los primeros 10 minutos después de la fotocoagulación con láser y se observan hemorragias en forma de llama 24 horas después de la lesión. Diferentes patologías oftálmicas ocurrieron después de la oclusión de la vena retiniana.El nivel de edema retiniano después de la oclusión de la vena retiniana se puede cuantificar en los ojos lesionados utilizando imágenes de tomografía de coherencia óptica. El estado de las capas neuronales también se puede determinar evaluando la desorganización de las capas internas de la retina. Aquí se muestra un ejemplo de una imagen de tomografía de coherencia óptica con las etiquetas correspondientes para cada capa.Medir la potencia láser de referencia es importante. Esta lectura tendrá un gran impacto en el éxito de las oclusiones y se puede optimizar. Se pueden realizar métodos adicionales como OCT, ERG y Optiger.Esto ayudará a abordar los efectos de la lesión neurovascular en la integridad neuronal de la retina y la función de la vía visual. Esta técnica allana el camino para interrogar las vías moleculares que impulsan la enfermedad neurovascular y, al seguir a los animales individuales a lo largo del tiempo, proporciona datos que pueden traducirse más fácilmente a la enfermedad humana.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

La retina de roedores ha sido reconocida como una ventana de acceso al cerebro. En este documento técnico se proporciona un protocolo que emplea el modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno para estudiar los mecanismos que conducen al fracaso de la regeneración vascular en el sistema nervioso central después de la lesión isquémica. El sistema descrito también se puede aprovechar para explorar estrategias para promover el nuevo crecimiento de vasos sanguíneos funcionales dentro de la...

Evaluación de la Vascular regeneración en el SNC Utilizando la retina del ratón

Aquí, presentamos el protocolo de neovascularización coroidea (CNV) inducida por láser en ratones, un modelo experimental que recrea las características vasculares de la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) neovascular. Una vez dominado, puede inducir de forma fiable y eficaz la CNV como sistema modelo para probar diversas medidas experimentales.

Un modelo de ratón para inducida por láser neovascularización coroidea

Aquí nos muestran un nuevo enfoque al uso de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral de alta resolución (HR-SD-OCT) para facilitar la presentación de los agentes de terapia génica en el espacio subretinal, evaluar su cobertura areal y caracterizan la vitalidad del fotorreceptor.

Tomografía de coherencia óptica ultraalta resolución ratón para facilitar la inyección Intraocular en investigación de retina la terapia génica

Presentamos la utilidad de la proyección de imagen longitudinal en vivo en el seguimiento de los cambios morfológicos del neovascularization coroides laser-inducida en ratones.

En Vivo La proyección de imagen multimodal y análisis del modelo de neovascularización coroidea inducida por láser Mouse

La retinopatía inducida por oxígeno (OIR) se puede utilizar para modelar enfermedades retinianas isquémicas como la retinopatía de la prematuridad y la retinopatía diabética proliferativa y para servir como modelo para estudios de prueba de concepto en la evaluación de fármacos antiangiogénicos para enfermedades neovasculares. OIR induce neovascularización robusta y reproducible en la retina que se puede cuantificar.

Modelo de retinopatía inducida por oxígeno para enfermedades retinianas isquémicas en roedores

Este protocolo describe un método detallado para la preparación y tinción de inmunofluorescencia de ratones montados planos de retina y análisis. El uso de la angiografía con fondo de ojo de fluoresceína (FFA) para crías de ratones y el procesamiento de imágenes también se describen en detalle.

Monitoreo del crecimiento dinámico de los vasos retinianos en un modelo de ratón con retinopatía inducida por oxígeno

Este artículo describe un ensayo de tinción de lectina bien establecido y reproducible para las preparaciones retinianas de montaje completo y los protocolos necesarios para la medición cuantitativa de los parámetros vasculares frecuentemente alterados en las retinopatías proliferativas y no proliferativas.

Cuantificación de parámetros vasculares en retinas de monte entero de ratones con retinopatías no proliferativas y proliferativas

Aquí, describimos una técnica de imagen in vivo utilizando tomografía de coherencia óptica para facilitar el diagnóstico y la medición cuantitativa de la retinopatía en ratones.

Aplicación de la tomografía de coherencia óptica a un modelo de retinopatía en ratones

Aquí, presentamos tres protocolos de análisis de datos para imágenes de angiografía fluoresceínica (AF) y tomografía de coherencia óptica (OCT) en el estudio de la oclusión de la vena retiniana (OVR).

In vivo Lecturas de lesiones vasculares en la retina del ratón para promover la reproducibilidad

Las inyecciones subretinianas son una técnica indispensable para el desarrollo preclínico de terapias para enfermedades de fotorreceptores y EPR. Describimos una técnica de inyección subretiniana transescleral optimizada en ratones que mejora las tasas de éxito intraoperatorio y minimiza el daño retiniano.

Técnica de inyección subretiniana transescleral mínimamente invasiva optimizada en ratón

Aprende a optimizar un modelo de oclusión de venas retinianas en ratones usando rosa de bengala y láser para estudiar lesiones vasculares y edema en tiempo real sin cirugía.

Optimización del modelo de ratón de oclusión de venas retinianas para limitar la variabilidad

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