Optimización del modelo de ratón de oclusión de venas retinianas para limitar la variabilidad
6 de agosto de 2021
Aquí, describimos un protocolo optimizado para la oclusión de la vena retiniana utilizando rosa de bengala y un sistema de microscopio de imágenes de retina guiado por láser con recomendaciones para maximizar su reproducibilidad en cepas modificadas genéticamente.
El protocolo proporciona un modelo para investigar los mecanismos de lesión vascular y el posterior desarrollo de edema de una manera no invasiva. La principal ventaja de esta técnica es que se puede seguir la lesión en vivo a lo largo del tiempo sin intervención quirúrgica. Esto proporciona vías para probar tratamientos de manera más eficiente.
Puede ser difícil aprender a realizar el veneado adecuado de la cola y acomodar al animal en la plataforma correctamente. Para ambas técnicas recomiendo ser paciente y tomar las cosas con calma. Para comenzar, maneje suavemente el cable de fibra óptica y conéctelo a la caja de control láser y al adaptador láser del microscopio de imágenes de retina, luego encienda la caja de la lámpara del microscopio de imágenes de retina.
Encienda la computadora y abra el programa de imágenes. Coloque un pedazo de papel blanco frente al ocular del microscopio y ajuste el balance de blancos haciendo clic en Ajustar en el programa de imágenes. Encienda la caja de control láser girando la llave y siguiendo las instrucciones en la pantalla de la caja de control láser.
Para verificar la potencia láser de referencia, ajuste la caja de control láser a 50 milivatios y 2.000 milisegundos. Luego encienda el láser y coloque el medidor de potencia frente al ocular. Presione el pedal del interruptor para activar el láser, con el objetivo de que la lectura de potencia del láser sea de 13 a 15 milivatios.
Luego, usando la pantalla de la caja de control láser, ajuste la potencia del láser experimental a 100 milivatios y 1, 000 milisegundos, y apague el láser. Vierta 300 mililitros de agua en un vaso de precipitados de 500 mililitros y caliente el vaso de precipitados en un horno de microondas durante un minuto. Luego coloque una gasa en el agua tibia.
A continuación, coloque un ratón macho de dos meses en un retenedor. Presione suavemente la gasa tibia en la cola del ratón y busque las venas dilatadas. Con una aguja de calibre 26, inyecte la cantidad adecuada de rosa de bengala de acuerdo con el peso del animal y aplique presión en el lugar de la inyección para evitar hematomas o sangrado antes de limpiar el sitio.
Luego suelte el mouse del restringido y devuélvalo a la jaula. Espere ocho minutos para que la rosa de bengala circule antes de la inyección de anestésicos. Encienda la plataforma del ratón con calefacción.
Luego agregue una gota de fenilefrina y tropicamida en cada ojo del ratón. Después de confirmar la anestesia, agregue una gota de clorhidrato de proparacaína por ojo, luego agregue ungüento para los ojos en ambos ojos. A continuación, inyecte 150 microlitros de carprofeno por vía subcutánea entre las orejas.
Luego acomode el mouse en la plataforma y ajuste la plataforma hasta que la vista del fondo de ojo de la retina sea clara y enfocada. Cuente las venas de la retina y tome una imagen del fondo de ojo. A continuación, encienda el láser y apunte hacia una vena retiniana aproximadamente a 375 micrómetros del disco óptico.
Irradiar el recipiente presionando el interruptor del pie y moviendo ligeramente el rayo láser hasta 100 micrómetros. Repita este paso tres veces y mueva el rayo láser después de cada pulso para que la irradiación no se enfoque en un punto. Repita la irradiación en otros vasos principales para lograr de dos a tres oclusiones.
Después de irradiar los vasos, apague la lámpara y espere 10 minutos. Luego vuelva a encender la lámpara, cuente el número de venas ocluidas y tome una imagen del fondo de ojo. Después de la adquisición de imágenes y la inyección de solución salina, agregue gotas oftálmicas lubricantes y ungüento de gel en ambos ojos.
Observe al ratón mientras se recupera de la anestesia y devuélvalo a la jaula con otros animales solo cuando esté completamente recuperado. El número de oclusiones logradas inmediatamente después de la irradiación láser no fue diferente entre los animales que fueron sometidos con láser 10 y 20 minutos después de la administración de rosa de bengala. El número de oclusiones sostenidas hasta un día después de la oclusión de la vena retiniana disminuyó significativamente en animales con láser 20 minutos después de la administración de rosa de bengala, independientemente del genotipo.
Sin modificar la potencia experimental de 100 milivatios, una potencia láser de referencia baja de 11,5 milivatios no dio lugar a oclusiones. En contraste, una salida láser de referencia de 13.5 milivatios resultó en oclusiones exitosas. Cuatro tipos principales de oclusiones ocurren después de la fotocoagulación con láser: vasos completamente ocluidos, vasos parcialmente ocluidos, vasos parcialmente reperfundidos y vasos completamente reperfundidos.
La vasculatura irradiada de ratones knockout Casp9 de células endoteliales inducibles por tamoxifeno pasó más tiempo en estados parcialmente reperfundidos y parcialmente ocluidos que la de los ratones C57 Black 6, que pasaron más tiempo en estados completamente ocluidos. El estado de oclusión de los vasos cambia rápidamente dentro de los primeros 10 minutos después de la fotocoagulación con láser y se observan hemorragias en forma de llama 24 horas después de la lesión. Diferentes patologías oftálmicas ocurrieron después de la oclusión de la vena retiniana.
El nivel de edema retiniano después de la oclusión de la vena retiniana se puede cuantificar en los ojos lesionados utilizando imágenes de tomografía de coherencia óptica. El estado de las capas neuronales también se puede determinar evaluando la desorganización de las capas internas de la retina. Aquí se muestra un ejemplo de una imagen de tomografía de coherencia óptica con las etiquetas correspondientes para cada capa.
Medir la potencia láser de referencia es importante. Esta lectura tendrá un gran impacto en el éxito de las oclusiones y se puede optimizar. Se pueden realizar métodos adicionales como OCT, ERG y Optiger.
Esto ayudará a abordar los efectos de la lesión neurovascular en la integridad neuronal de la retina y la función de la vía visual. Esta técnica allana el camino para interrogar las vías moleculares que impulsan la enfermedad neurovascular y, al seguir a los animales individuales a lo largo del tiempo, proporciona datos que pueden traducirse más fácilmente a la enfermedad humana.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Visión general
Este estudio describe un protocolo optimizado para la oclusión de la vena retiniana utilizando bengala rosa y un sistema de microscopía de imagen retiniana guiado por láser. El modelo facilita la investigación de los mecanismos de lesión vascular y el desarrollo de edema en tiempo real sin intervención quirúrgica, permitiendo una prueba de tratamiento más eficiente.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oftalmología
- Biología vascular
Antecedentes
- Los modelos de oclusión venosa retiniana son importantes para el estudio de lesiones vasculares.
- La bengala rosa sirve como un agente vital para mejorar la eficacia de la imagen y la oclusión.
- El método permite la observación en vivo del daño retiniano y la recuperación.
- Se enfatiza una mejor capacidad para cuantificar las respuestas retinianas utilizando técnicas como la tomografía de coherencia óptica (OCT).
Propósito del estudio
- Desarrollar un modelo reproducible para investigar lesiones vasculares retinianas.
- Medir y observar cambios en los estados de los vasos sanguíneos retinianos después de la oclusión inducida por láser.
- Mejorar el conocimiento sobre los efectos de la lesión neurovascular en la función retiniana.
Métodos utilizados
- La plataforma principal utilizada es un microscopio de imagen retiniana guiado por láser.
- El modelo biológico consiste en ratones modificados genéticamente utilizados para evaluar oclusiones vasculares.
- Los pasos críticos involucran la adquisición de imágenes, la configuración de control del láser y el manejo adecuado de la bengala rosa.
- Se anotaron las mediciones de potencia del láser y el momento apropiado después de la administración de la bengala rosa.
- Se especificaron los protocolos de anestesia y monitoreo de recuperación para garantizar el bienestar animal.
Resultados principales
- El momento de la aplicación del láser después de la dosis de bengala rosa influyó en el número de oclusiones sostenidas.
- Se observaron diferentes estados de oclusión, revelando importantes conocimientos sobre las respuestas hemorrágicas post-lesión.
- Se cuantificaron cambios moleculares clave, demostrando la eficacia del modelo para el estudio de los mecanismos de reparación vascular.
- Se utilizó la imagen OCT para evaluar el edema retiniano y la desorganización de la capa interna.
Conclusiones
- Este protocolo permite una investigación detallada de los mecanismos de la enfermedad neurovascular.
- La capacidad de monitorear los cambios retinianos a lo largo del tiempo ayudará a traducir los hallazgos a condiciones humanas.
- En general, el estudio mejora la comprensión de las lesiones vasculares y el potencial para intervenciones de tratamiento en enfermedades retinianas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This optimized retinal vein occlusion model addresses variability in preclinical ophthalmology studies by standardizing critical procedural parameters. By controlling baseline laser output and post-dye administration timing, the method improves reproducibility of vascular injury induction across genetically diverse mouse strains. This supports more reliable evaluation of neurovascular therapeutics targeting retinal edema and hypoxic-ischemic injury mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular injury pathways in retinal disease models with controlled occlusion consistency.
- Operational Value: Reduces experimental noise from variable laser timing and power settings, improving assay sensitivity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized vascular injury model for evaluating compound effects on retinal edema and reperfusion dynamics.
- Operational Value: Supports reproducible endpoint measurement via optical coherence tomography for quantitative screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models neurovascular injury progression including hemorrhage and neuronal layer disorganization relevant to human retinal pathologies.
- Operational Value: Facilitates longitudinal monitoring of vascular repair mechanisms in the same animal over time.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical efficacy testing by providing a quantifiable model of retinal vascular injury.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of molecular drivers in vascular leakage and inflammatory responses post-occlusion.
- Screening: Enables standardized assessment of therapeutic candidates on occlusion persistence and edema reduction.
- Analytics: Generates quantitative OCT-derived metrics on retinal thickness and layer integrity for comparative analysis.
- Translational Research: Models human-relevant neurovascular injury phenotypes including flame-shaped hemorrhages and inner retinal disruption.
- Enterprise Reuse: Adaptable across mouse strains and genetic backgrounds for consistent target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by reducing biological variability in injury models.
- Operational Value: Standardizes laser and dye timing parameters to enhance inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Increases go/no-go decision reliability by minimizing false negatives from inconsistent model penetrance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurovascular candidates based on reproducible edema and reperfusion outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical tail vein injection and retinal imaging microscopy.
- Dependent on calibrated laser systems with adjustable baseline and experimental power settings.
- Necessitates standardized animal handling and anesthesia protocols to minimize physiological confounders.
- Must account for strain-specific vascular responses when comparing occlusion durability across genotypes.
- Limited by the learning curve in achieving consistent venous cannulation and laser targeting precision.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:45
Laser Setup
2:05
Mouse Tail Vein Injection of Rose Bengal
2:54
Occlusion of Major Veins
4:07
Establishing the Number of Veins Occluded at Day 0 and Aftercare
4:40
Results: Analysis of Types and Timelines of Photo-Occlusion, Baseline and Experimental Laser Output Measurement, Ophthalmic Pathologies, and Quantification of OCT Images
6:37
Conclusion
