Name: Evaluación del consumo de aminoácidos en células óseas cultivadas y tallos óseos aislados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprende a evaluar el consumo de aminoácidos en células óseas y huesos aislados mediante un ensayo rápido y sensible con aminoácidos radiomarcados. Este método económico facilita el estudio del metabolismo óseo.

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El laboratorio Karner cuenta con el apoyo de subvenciones R01 del Instituto Nacional de Salud (AR076325 y AR071967) a C.M.K.

Todos los procedimientos con ratones descritos en este documento fueron aprobados por los Comités de Estudios Animales del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas en Dallas. El protocolo de radiación fue aprobado por el Comité Asesor de Seguridad Radiológica del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas en Dallas.
1. Captación de aminoácidos en las células (Protocolo I)
<ol><li>Placa 5 x 104 células ST2 en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos. Células en placa en α-MEM que contienen 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina y 0,1 μg/ml de estreptomicina (Pen/Strep). Coloque pocillos adicionales de células para cuantificar el número de células por condición para las normalizaciones en el paso 1.12. Incubar células en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C con 5% deCO2.</li>
	<li>Cultive las células durante 2-3 días hasta que estén confluentes.</li>
	<li>El día del experimento, prepare las siguientes soluciones: 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4 y tampón Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8.0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-glucosa). Precalentar a 37 °C.</li>
	<li>Aspirar el medio y lavar las células dos veces con 1 mL de 1x PBS, pH 7.4. NOTA: Este protocolo también es apropiado para dividir rápidamente células no confluentes. En este caso, es importante normalizar la radiactividad al número absoluto de células o al contenido de ADN. Además, considere aumentar el tamaño de la placa de cultivo o matraz para aumentar el número total de células y los valores de cpm. Es importante determinar esto empíricamente sobre una base individual.</li>
	<li>Aspirar 1x PBS y lavar las células una vez con 1 ml de KRH.</li>
	<li>Producir 4 μCi/mL de L-[3,4-3 H]-glutamina diluyendo 4 μL de [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-Glutamina por 1 ml de KRH. NOTA: Antes de usar materiales radiactivos, comuníquese con la Oficina de Seguridad Radiológica de su institución de origen para obtener aprobaciones. Todos los procedimientos relacionados con la radiación deben realizarse detrás del escudo de plexiglás.</li>
	<li>Incubar células con 0,5 mL de KRH que contengan 4 μCi/mL de L-[3,4-3 H]-Glutamina durante 5 min.</li>
	<li>Recoger el medio radiactivo y dispensar en el contenedor de residuos líquidos. Lave las células tres veces brevemente con KRH helado para terminar la reacción. Recoja y deseche todos los lavados en el contenedor de residuos líquidos radiactivos.</li>
	<li>Agregue 1 ml de SDS al 1% a cada pocillo y triture 10 veces para lisar y homogeneizar las células. Transfiera los lisados celulares a tubos de 1,5 ml. Deseche las placas de cultivo celular, las pipetas serológicas y las puntas de pipeta en el contenedor de residuos radiactivos sólidos.</li>
	<li>Centrifugar a >10.000 x g durante 10 min. Transfiera los sobrenadantes a viales de centelleo que contengan 8 ml de la solución de centelleo. Mezclar agitando vigorosamente los viales de centelleo. Desechar los tubos y las puntas de pipeta en un contenedor de residuos radiactivos sólidos.</li>
	<li>Lea la radiactividad en recuentos por minuto (cpm) usando un contador de centelleo. Deseche los viales de centelleo en el contenedor de residuos del vial de centelleo.</li>
	<li>Tripsinizar, resuspender y contar las células de las placas no radiactivas restantes de las células (ver paso 1.1) para estimar el número de células en los cultivos radiactivos lisados. Usando un hemocitómetro, cuente el número de células por pocillo no radiactivo para cada condición experimental. Normalizar el cpm desde el paso 1.11 hasta el número de células estimado de las placas no radiactivas.</li>
	<li>Después de completar el experimento, descontamine la campana de cultivo celular, el banco y todos los instrumentos con un aerosol descontaminante de radiactividad. Finalmente, realice pruebas de limpieza para asegurarse de que el área de trabajo esté libre de radiación.</li>
</ol>2. Captación de aminoácidos en tejidos óseos recién aislados (Protocolo II)
<ol><li>Precalentar KRH a 37 °C.</li>
	<li>Eutanasia a un ratón de 3 días de edad y quitar la piel de los brazos. Desarticule el húmero del hombro con unas tijeras y diseccione ambos húmeros. Retire todos los tejidos extemporáneos con un bisturí y fórceps. Retire las epífisis del hueso. NOTA: Además de los humerios, este protocolo se puede adaptar a fémures, tibias y calvarios neonatales, así como a humerios, fémures y tibias aislados de ratones de 2 y 4 meses de edad (datos no publicados).</li>
	<li>Enjuague la médula del hueso y pese los ejes óseos para normalizarlos en el paso 2.14.</li>
	<li>Hervir un húmero en 1x PBS a 100 °C durante 10 min para descelularizar el hueso. El hueso hervido descelularizado se utiliza como control negativo. NOTA: Como control de calidad, la parafina incrusta los huesos hervidos y no hervidos para las tinciones histológicas para confirmar visualmente que la ebullición fue eficaz en la descelularización del hueso.</li>
	<li>Equilibrar ambos húmeros en 1 mL de KRH durante 30 min en la incubadora de cultivo celular a 37 °C.</li>
	<li>Hacer una solución de trabajo de 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-Arginina en KRH diluyendo 4 μL de 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Arginina por 1 mL KRH. NOTA: Este protocolo es apropiado para evaluar la absorción de cualquier nutriente radiomarcado que se elija. L-[2,3,4-3 H]-glutamina, L-[14CU]-alanina y L-[2,3-3 H]-prolina han sido probados con resultados similares. Se muestran datos de arginina para resaltar la utilidad de este protocolo. PRECAUCIÓN: Todos los procedimientos con radiación deben realizarse detrás del escudo de plexiglás mientras se usa el equipo de protección personal (EPP) adecuado.</li>
	<li>Incubar el hueso control experimental y hervido por separado en KRH que contenga 4 μCi/ml de L-[2,3,4-3 H]-arginina durante un máximo de 90 min a 37 °C. NOTA: Es importante determinar empíricamente los tiempos de incubación para diferentes condiciones, incluida la edad de los ratones, los diferentes elementos esqueléticos y los tipos de aminoácidos radiomarcados mediante la realización de un curso de tiempo. La saturación ocurre principalmente después de aproximadamente 3-4 h. La captación debe evaluarse en un punto temporal en la rabia lineal de la absorción.</li>
	<li>Retirar el medio radiactivo y desecharlo en el contenedor de residuos radiactivos líquidos. Lave el húmero tres veces usando 1 ml de KRH para terminar la reacción. Deseche todos los lavados en el contenedor de residuos radiactivos líquidos.</li>
	<li>Transfiera cada hueso a un tubo de 1,5 ml. Añadir 500 μL de tampón RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (p/v); 0,1% SDS (p/v)]. Deseche las placas de cultivo, las pipetas serológicas y las puntas de pipeta en un recipiente de residuos sólidos radiactivos.</li>
	<li>Homogeneiza el húmero picando 100 veces con tijeras en un tampón RIPA.</li>
	<li>Sonicar (Amplitud: 35%, Pulso 1 s) el hueso homogeneizado resultante durante 10 s. NOTA: También se sabe que la sonicación produce aerosoles. Los pasos de sonicación se pueden realizar en un gabinete de seguridad biológica. Para reducir la formación de aerosoles, es importante no llenar demasiado los tubos. La sonicación de pequeños volúmenes de muestra puede resultar en una sonicación incompleta o pérdida de muestras debido a la formación de espuma. Si se produce formación de espuma, centrifugar la muestra durante 5 minutos para que se asiente.</li>
	<li>Aclarar el lisado por centrifugación durante 10 min a >10.000 x g a temperatura ambiente. Transfiera 200 μL del sobrenadante a viales de centelleo que contengan 8 ml de la solución de centelleo. Mezclar agitando vigorosamente los viales de centelleo. Deseche todos los desechos radiactivos sólidos (por ejemplo, tubos usados, puntas de pipetas, placas, etc.) en el contenedor de desechos radiactivos sólidos.</li>
	<li>Lea la radiactividad (cpm) con el contador de centelleo. Deseche los viales de centelleo usados en el contenedor de residuos radiactivos designado para viales de centelleo.</li>
	<li>Resta el cpm del hueso hervido (valor basal) del cpm del hueso experimental. Normalizar la radiactividad con el peso óseo a partir del paso 2.3.</li>
	<li>Rocíe la campana de cultivo celular, los instrumentos y el banco con descontaminante de radiactividad. Realice pruebas de limpieza para confirmar que el área de trabajo está libre de radiación.</li>
</ol>

<ol><li>Xiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+%CE%B1-KG-dependent+histone+and+DNA+demethylases+by+fumarate+and+succinate+that+are+accumulated+in+mutations+of+FH+and+SDH+tumor+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors.</a> Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).</li>
<li>Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Krebs+to+clinic%3A+glutamine+metabolism+to+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).</li>
<li>Karner, C. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+and+cellular+metabolism+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).</li>
<li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin%2FIGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+dehydrogenase+promotes+senescence+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species.</a> Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).</li>
<li>Comes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Proline+induces+a+mesenchymal-like+invasive+program+in+embryonic+stem+cells+by+remodeling+H3K9+and+H3K36+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine-driven+oxidative+phosphorylation+is+a+major+ATP+source+in+transformed+mammalian+cells+in+both+normoxia+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia.</a> Molecular Systems Biology. 9, 712(2013).</li>
<li>Hosios, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+rather+than+glucose+account+for+the+majority+of+cell+mass+in+proliferating+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells.</a> Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).</li>
<li>Welbourne, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonia+production+and+glutamine+incorporation+into+glutathione+in+the+functioning+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney.</a> Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).</li>
<li>Sullivan, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+aspartate+biosynthesis+is+an+essential+function+of+respiration+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells.</a> Cell. 162 (3), 552-563 (2015).</li>
<li>Nelsen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+regulate+hepatocyte+proliferation+through+modulation+of+cyclin+D1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).</li>
<li>Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asparagine+promotes+cancer+cell+proliferation+through+use+as+an+amino+acid+exchange+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor.</a> Nature Communications. 7, 11457(2016).</li>
<li>Green, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branched-chain+amino+acid+catabolism+fuels+adipocyte+differentiation+and+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis.</a> Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).</li>
<li>Shiraki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methionine+metabolism+regulates+maintenance+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li>
<li>Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+regulation+of+glutamine+consumption+by+WNT+during+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation.</a> Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).</li>
<li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li>
<li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sensor+Eif2ak4%2FGCN2+is+required+for+proliferation+of+osteoblast+progenitors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).</li>
<li>Rached, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO1+is+a+positive+regulator+of+bone+formation+by+favoring+protein+synthesis+and+resistance+to+oxidative+stress+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts.</a> Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).</li>
<li>Elefteriou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF4+mediation+of+NF1+functions+in+osteoblast+reveals+a+nutritional+basis+for+congenital+skeletal+dysplasiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae.</a> Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).</li>
<li>Maleknia, S. D., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+amino+acids+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%2C+Peptides+and+Proteins+in+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of amino acids and proteins.</a> Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).</li>
<li>Rennie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+use+of+tracers+in+nutrition+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Proceedings+of+the+Nutrition+Society%22%5BJournal%5D)">An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).</li>
<li>Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+transport+in+adult+diaphyseal+bone%3A+contrast+with+amino+acid+transport+mechanisms+in+fetal+membranous+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone.</a> Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).</li>
<li>Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+transport+of+amino+acids+into+bone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Active transport of amino acids into bone cells.</a> Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).</li>
<li>Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+transporters+revisited%3A+New+views+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amino acid transporters revisited: New views in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen revelaciones.

El protocolo descrito en este documento proporciona un enfoque rápido y sensible para evaluar la absorción de aminoácidos en respuesta a diversas permutaciones experimentales, ya sea in vitro o ex vivo. En comparación con los kits disponibles comercialmente (por ejemplo, el kit de determinación de glutamina y glutamato), este método es mucho más sensible, más rápido y menos laborioso16,17,25. En nuestro protoco...

Los aminoácidos son compuestos orgánicos que contienen un grupo funcional amino (-NH2) y carboxilo (-COOH) con una cadena lateral variable que es específica para cada aminoácido. En general, los aminoácidos son bien conocidos como el constituyente básico de la proteína. Más recientemente, se han dilucidado nuevos usos y funciones de los aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos individuales pueden metabolizarse para generar metabolitos intermedios que contribuyen a la bioenergética, funcionan como cofactores enzimáticos, regulan las especies reactivas de oxígeno o se utilizan para sintetizar otros aminoácidos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Muchos estudios demuestran que el metabolismo de los aminoácidos es crítico para la pluripotencia, proliferación y diferenciación celular en diversos contextos 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Los osteoblastos son células secretoras que producen y secretan la matriz ósea extracelular rica en colágeno tipo 1. Para mantener altas tasas de síntesis de proteínas durante la formación ósea, los osteoblastos exigen un suministro constante de aminoácidos. Para satisfacer esta demanda, los osteoblastos deben adquirir activamente aminoácidos. De acuerdo con esto, estudios recientes revelan la importancia de la absorción de aminoácidos y el metabolismo en la actividad de los osteoblastos y la formación ósea 15,16,17,18,19,20.
Los osteoblastos adquieren aminoácidos celulares de tres fuentes principales: medio extracelular, degradación de proteínas intracelulares y biosíntesis de aminoácidos de novo. Este protocolo se centrará en la evaluación de la absorción de aminoácidos del entorno extracelular. Los métodos más comunes para medir la absorción de aminoácidos se basan en aminoácidos radiomarcados (por ejemplo, 3H o 14C) o marcados con isótopos pesados (por ejemplo, 13C). Los ensayos de isotopómeros pesados pueden analizar la absorción y el metabolismo de aminoácidos de manera más exhaustiva y segura, pero requieren más tiempo y tardan varios días en completarse, ya que se tarda un día en preparar y derivar muestras y varios días en analizarlas en el espectrómetro de masas dependiendo del número de muestras21,22. En comparación, los ensayos de captación de aminoácidos radiomarcados no son informativos sobre el metabolismo posterior, pero son baratos y relativamente rápidos, pudiendo completarse dentro de las 2-3 h desde el inicio del experimento23,24. Aquí, describimos un protocolo básico fácilmente modificable diseñado para evaluar la absorción de aminoácidos radiomarcados en células primarias cultivadas o líneas celulares in vitro o ejes óseos individuales ex vivo. La aplicación de estos dos protocolos puede extenderse a otros aminoácidos radiomarcados y otros tipos de células y tejidos asociados al hueso.

<table><tbody><tr><td>0,25% tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Jeringa</td><td>BD precisión</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30G Aguja</td><td>BD precisión</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Arginina Monoclorhidrato L-[2,3,4-3H]-, 1mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1123001MC</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS6500 contador de centelleo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de colina</td><td>Sigma</td><td>C7077</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Solución de glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Herramienta</td><td></td><td></td> de disección <td>Pinzas, tijeras, cajillas</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>HEPES(1M)</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>L-[3,4-3H(N)]-Glutamina</td><td>PerkinElmer</td><td>NET551250UC</td> Viales de centelleo líquido Sigma Z190535 <td></td></tr><tr><td>Solución de cloruro de litio, 8M</td><td>Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> MEM&alpha;<td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>12561</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga, 15mL</td><td>Biotix</td><td>89511-256</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonic& Materiales</td><td>VCX130</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma 648311</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultima Gold (Solución de centelleo)</td><td>PerkinElmer</td><td>6013329</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-(Metilamino)ácido isobutírico</td><td>Sigma</td><td>M2383</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación del consumo de aminoácidos en células óseas cultivadas y tallos óseos aislados

Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts

El desarrollo óseo y la homeostasis dependen de la diferenciación y la actividad de los osteoblastos formadores de hueso. La diferenciación de osteoblastos se caracteriza secuencialmente por la proliferación seguida de la síntesis de proteínas y, en última instancia, la secreción de la matriz ósea. La proliferación y la síntesis de proteínas requieren un suministro constante de aminoácidos. A pesar de esto, se sabe muy poco sobre el consumo de aminoácidos en los osteoblastos. Aquí describimos un protocolo muy sensible que está diseñado para medir el consumo de aminoácidos utilizando aminoácidos radiomarcados. Este método está optimizado para cuantificar los cambios en la absorción de aminoácidos que están asociados con la proliferación o diferenciación de osteoblastos, tratamientos con medicamentos o factores de crecimiento, o diversas manipulaciones genéticas. Es importante destacar que este método se puede utilizar indistintamente para cuantificar el consumo de aminoácidos en líneas celulares cultivadas o células primarias in vitro o en ejes óseos aislados ex vivo. Finalmente, nuestro método se puede adaptar fácilmente para medir el transporte de cualquiera de los aminoácidos, así como la glucosa y otros nutrientes radiomarcados.

El transporte de aminoácidos está regulado por muchos transportadores de aminoácidos unidos a la membrana que han sido categorizados en distintos sistemas de transporte basados en numerosas características, incluyendo la especificidad del sustrato, la cinética, así como la dependencia de iones y pH25. Por ejemplo, la absorción de glutamina puede estar mediada por los sistemas de transporte dependientes de Na+ A, ASC, γ+L y N o el Sistema L independiente de Na+. Los sistemas d...

Este protocolo presenta un ensayo de captación de aminoácidos radiomarcado, que es útil para evaluar el consumo de aminoácidos en células primarias o en huesos aislados.

Evaluación del consumo de aminoácidos en células óseas cultivadas y tallos óseos aislados

Bone development and homeostasis is dependent upon the differentiation and activity of bone forming osteoblasts. Osteoblast differentiation is ...

La absorción de aminoácidos y el metabolismo son esenciales para la especificación, diferenciación y formación ósea de los osteoblastos. Este protocolo proporciona un método rápido y sensible para evaluar la absorción de aminoácidos. Nuestro protocolo utiliza aminoácidos radiomarcados para cuantificar la absorción de aminoácidos.Es un método barato, sensible y rápido que se puede modificar fácilmente para diferentes condiciones. Este protocolo se puede modificar fácilmente para evaluar la absorción de otros nutrientes radiomarcados como la glucosa y los ácidos grasos en una variedad de tejidos, así como en células primarias o transformadas. Para comenzar el ensayo de captación de aminoácidos se realiza cinco veces 10 a la cuarta células ST2 en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos en medio alfa MEM suplementado con FBS, penicilina y estreptomicina.Placa pozos adicionales de células para cuantificar el número de células por condición para las normalizaciones. A continuación, incube las células en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante dos o tres días hasta que confluya. Después de la incubación, aspirar el medio y lavar las células dos veces con un mililitro de PBS a pH 7.4.Luego aspire el PBS antes de lavar las células una vez con un mililitro HEPES de Krebs-Ringer o KRH. Incubar células con 0,5 mililitros de KRH recién preparado que contiene cuatro microcuries por mililitro L34 de glutamina tritiada durante cinco minutos. Después de la incubación, recoger el medio radiactivo para dispensar en el contenedor de residuos líquidos.Luego lave las células tres veces con KRH helado para terminar la reacción. A continuación, agregue un mililitro de dodecil sulfato de sodio al 1% a cada pocillo y triture la mezcla 10 veces para lisar y homogeneizar las células. Luego transfiera los lisados celulares a un tubo de 1.5 mililitros y aclare el lisado centrifugando a una velocidad mínima de 10, 000 G durante 10 minutos.Transfiera el sobrenadante a un vial de centelleo que contenga ocho mililitros de la solución de centelleo y lea la actividad de radio y los recuentos por minuto utilizando el contador de centelleo. A partir de las placas no radiactivas restantes de las células, tripsinizar, resuspender y contar las células para estimar el número de células en los cultivos radiactivos lisados. Usando un hemacitómetro, cuente el número de células por pocillo no radiactivo para cada condición experimental.Para determinar la absorción de aminoácidos, enjuague la médula del hueso antes de pesar el eje óseo. Para descelularizar el hueso, hierva un húmero en PBS a 100 grados centígrados durante 10 minutos. Equilibrar los húmeros vivos y hervidos en un mililitro de KRH durante 30 minutos en la incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados.A continuación, incube los huesos de control experimentales y hervidos por separado en KRH recién preparado que contiene cuatro microcurries por mililitro de arginina triciada L234 durante un máximo de 90 minutos a 37 grados centígrados. Después de eliminar el medio radiactivo, termine la reacción lavando el húmero tres veces con un mililitro de KRH helado. Transfiera cada hueso a un tubo de 1,5 mililitros con 500 microlitros de tampón RIPA.Luego homogeneice el húmero y el tampón RIPA cortando 100 veces con tijeras, seguido de la sonicación al 35% de amplitud y un segundo pulso durante 10 segundos. Clarificó el lisado por centrifugación durante 10 minutos a 10, 000 veces G a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, transfiera 200 microlitros del sobrenadante a viales de centelleo que contengan ocho mililitros de la solución de centelleo.Lea la actividad de radio usando el contador de centelleo. Se evaluaron las propiedades cinéticas de la captación in vitro de glutamina tritiada L34 y las células ST2 confluentes en presencia o ausencia de ácido metil amino isobutírico de sodio o litio. La eliminación de sodio condujo a una reducción del 90% en la absorción de glutamina.La presencia de litio aumentó la absorción de glutamina en un 2% en comparación con la condición libre de sodio. Mientras que el ácido metil amino isobutírico no afectó la absorción de glutamina. Las contribuciones porcentuales estimadas del sistema A, N, L o ASC y gamma más L indicaron que la mayor parte de la absorción de glutamina está mediada por los sistemas ASC y gamma más L. El sistema N es responsable de aproximadamente un 2% de absorción de glutamina dependiente de sodio.Y el sistema A mostró 0% de contribución y aceptación. La captación de arginina tritiada de X-VIVO L34 en húmeros neonatales hervidos y vivos se analizó en un transcurso de dos horas. La absorción de arginina aumentó linealmente a lo largo del experimento y el húmero vivo.El húmero hervido no exhibió un aumento dinámico de la absorción de arginina en el experimento. El análisis representativo muestra la absorción de arginina normalizada y corregida. Es importante hervir el hueso contralateral como control activo.Este paso es esencial ya que la matriz ósea puede absorber aminoácidos radiactivos, lo que resulta en resultados inexactos. El protocolo nos ha permitido confirmar la cinética de captación de aminoácidos tanto in vitro como in vivo.

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Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Una biblioteca de fagos se utilizó para identificar las secuencias de péptidos de que el hueso blanco. El objetivo fue investigar el efecto de estos péptidos en la diferenciación de células mesenquimales y para determinar su efecto sobre la regeneración ósea.

Péptidos de la Biblioteca de Phage Display modular la expresión génica en las células mesenquimales y potenciar la osteogénesis en defectos óseos unicorticales

En este vídeo, describimos un método para la detección de depósitos de calcio secretados por osteoblastos utilizando un colorante aniónico, Alizarin Red S. Primero se tiñen los osteoblastos cultivados y luego se recupera el colorante para la cuantificación colorimétrica de los depósitos de calcio o el grado de mineralización de los osteoblastos.

Ensayo de mineralización in vitro: un método colorimétrico para cuantificar los depósitos de calcio osteoblásticos en el sustituto de injerto óseo mediante tinción y extracción de rojo de alizarina S

Este video muestra una técnica in vitro para estimar la absorción de aminoácidos por parte de las células estromales derivadas de la médula ósea. Los transportadores de aminoácidos dependientes de Na+ median la absorción de aminoácidos radiomarcados dentro de las células, y la absorción celular se estima midiendo la radiactividad.

Ensayo de absorción de aminoácidos radiomarcados para cuantificar la absorción celular de aminoácidos

Se describe aquí cómo preparar medio hueso acondicionado (BCM) y probar su actividad in vitro.

Bone Medium acondicionado: Preparación y Bioensayo

Uranio se sabe que afectan el metabolismo óseo. Aquí, presentamos un protocolo dirigido a investigar el efecto de la exposición de uranio natural en la viabilidad, la diferenciación y la función de los osteoclastos, las células de reabsorción ósea.

Métodos para analizar los efectos del uranio Natural en In Vitro la osteoclastogénesis

Presentamos un protocolo para comparar el estado de los minerales en vesículas por dos líneas de células de hueso humano: hFOB 1.19 y Saos-2. Sus perfiles de mineralización fueron analizados por alizarina rojo-S (AR-S) coloración, visualización luz de ultravioleta (UV), la proyección de imagen de microscopía electrónica (TEM) transmisión y microanálisis por energía dispersiva por rayos x (EDX).

Análisis de minerales producidos por hFOB 1.19 y Saos-2 células usando la microscopia electrónica transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía

Aquí, presentamos un método para la cultura ex vivo de huesos largos de murino en las etapas del feto y del recién nacido, adecuado para analizar el desarrollo de hueso y cartílago y la la homeostasis en condiciones controladas, mientras que recapitular el proceso in vivo.

Cultivo y medición de huesos largos del feto y del recién nacido murino

El ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real mide la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular, que corresponde a la producción mitocondrial y glicolítica de trifosfato de adenosina, utilizando sensores de pH y oxígeno. El manuscrito explica un método para comprender el estado energético de los osteoblastos y la caracterización e interpretación del estado bioenergético celular.

Uso del analizador de flujo metabólico celular en tiempo real para monitorear la bioenergética de osteoblastos

Aquí, presentamos un procedimiento de ensayo simple y efectivo para ensayos de fosas de reabsorción utilizando placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio.

Un protocolo simple de ensayo de fosa para visualizar y cuantificar la reabsorción osteoclástica in vitro

Este protocolo describe la fabricación de construcciones óseas 3D utilizando osteocitos humanos incrustados en hidrogelatinas metacriladas (GelMA) suplementadas con matriz extracelular descelularizada. El método es de bajo coste, escalable y compatible con equipos básicos de laboratorio, proporcionando una plataforma traslacional para estudiar los procesos de enfermedad musculoesquelética.

Una plataforma de cultivo óseo 3D que utiliza osteocitos humanos y matriz extracelular descelularizada para modelar enfermedades musculoesqueléticas

Aprende a evaluar el consumo de aminoácidos en células óseas y huesos aislados mediante un ensayo rápido y sensible con aminoácidos radiomarcados. Este método económico facilita el estudio del metabolismo óseo.

Evaluación del consumo de aminoácidos en células óseas cultivadas y tallos óseos aislados

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