Técnica para la obtención de células madre mesenquimales a partir de tejido adiposo y caracterización de fracciones vasculares estromales en criopreservación a largo plazo

Aquí, hemos demostrado el protocolo para obtener y preservar las células buenas y viables para usos de pasos terapéuticos, como la infusión de células mesenquimales pluripotentes. La principal ventaja de esto, es que utilizando esta técnica, podemos obtener el volumen celular viable frente al tiempo ganado en la etapa de aislamiento de las células del tejido recolectado. Esta técnica se puede extender a todas las enfermedades o afecciones en las que se aplican medicamentos heterogénicos y terapia celular.

Este método también se puede aplicar a las pruebas de estabilidad citogenómica en áreas como las pruebas de drogas, donde se pueden alentar los cultivos celulares a largo plazo. Siempre que manipule las células vivas, mantenga la calma y la confianza. Tenga mucho cuidado con la sepsis y esté constantemente alerta con los ojos de un científico para observar cualquier adversidad y tomar buenas decisiones.

Comience pesando la bolsa y midiendo la temperatura con un termómetro clínico infrarrojo digital sin contacto. Deje la bolsa durante cinco minutos dentro de la cámara de flujo laminar para precipitar las capas grasas y separar el tejido que contiene las células. Inyecte 100 mililitros de DPBS con calcio en la bolsa de transferencia y mézclela con las manos.

Déjalo reposar durante cinco minutos. Luego use una jeringa de 60 mililitros conectada al adaptador de bolsa para desechar la mayor parte del líquido basal que precipita. Repita este proceso dos veces.

Agregue 100 mililitros de la solución de digestión a la bolsa y déjela a 37 grados centígrados durante 30 minutos bajo agitación lenta. Luego transfiera todo el contenido de la bolsa a cuatro tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugarlos a 400 G durante 10 minutos a 22 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y agregue 5 mililitros de DMEM bajo en glucosa suplementado con 20% de suero bovino fetal al pellet celular.

Mezclar una solución fresca de 10 microlitros de azul de tripano al 0,05% en agua destilada con 10 microlitros de suspensión celular durante cinco minutos. Utilice un microscopio de luz invertida con un aumento de 20X y cuente las células viables en una cámara de conteo de células Neubauer. Suspender el pellet celular en un medio crioprotector a una concentración de 1 millón de células por mililitro.

Luego coloque 1 mililitro de esta mezcla en viales criogénicos. Use un recipiente de congelación con una velocidad de enfriamiento de 1 grado centígrado por minuto y guárdelo a 80 grados centígrados durante un año. Después de un año, guárdelo en cajas de cassette estándar sumergidas en fase de vapor de nitrógeno líquido.

Los datos de los diferentes pasos del procedimiento de los nueve pacientes se presentan en esta tabla. De acuerdo con el rendimiento celular inicial, se determinó un volumen variable de células para cada muestra. 1 mililitro de muestras con mayor rendimiento celular, 1,1 mililitros para muestras con rendimiento celular intermedio y 2 mililitros por muestra con menor rendimiento celular.

El rendimiento celular antes del paso uno varió ampliamente incluso cuando se observó la misma confluencia antes de la tripsinización. Por lo tanto, aquí las células pueden haber crecido en capas. La imagen representativa muestra las ADSC mesenquimales adherentes al plástico en el primer paso después del aislamiento en microscopía óptica.

Las células muestran adhesión a la morfología plástica y fibroblásica. Las células viables contadas en la cámara de Neubauer en el ensayo de azul de tripano se muestran aquí. Los datos de citometría de flujo de seis pacientes se presentan en esta tabla.

A partir de estas células CD45 negativas, se determinó el porcentaje de ADSC con diferentes combinaciones de marcadores de células madre. Las imágenes representativas muestran la subpoblación de células positivas para marcadores asociados a células madre en SVF del caso nueve después de ocho meses de criopreservación. Aquí, R1 es la región celular total analizada en el gráfico de dispersión directa versus dispersión lateral.

Y R2 es la región CD45 negativa. Las poblaciones de CD73, CD90 y CD105 son positivas en esta región. La diferenciación ADSC en condrocitos, osteocitos y adipocitos se muestra aquí.

Al intentar este procedimiento, recuerde remover lentamente, preferiblemente con las manos, mientras se deja a 37 grados centígrados durante 30 minutos para observar las adherencias y ampollas. Mantenga la temperatura ambiente de trabajo alrededor de 25 grados centígrados y evite cualquier choque térmico a temperaturas mucho mayores. La técnica que hemos mostrado aquí se puede utilizar para aislar con éxito las células mesenquimales pluripotentes de otros tejidos.