Name: Un método simple y efectivo para aislar consistentemente cardiomiocitos de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Aprenda un método eficiente para aislar cardiomiocitos de ratón sin técnica Langendorff, minimizando el tiempo isquémico con perfusión in vivo. Este protocolo mejora el rendimiento celular y facilita experimentos funcionales en cardiología.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) y T32 HL134616 (Sturgill y Salyer) de los Institutos Nacionales de Salud.

Todos los procedimientos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ohio de acuerdo con las pautas de los NIH.
1. Preparación de la solución
NOTA: Consulte la Tabla 2 para conocer las concentraciones de tampón.
<ol><li>Preaislamiento (hasta 2 semanas antes del aislamiento de miocitos)<ol><li>Base tampón de perfusión: Preparar 1 L de base tampón de perfusión (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, glucosa y BDM) en 1 L de 18,2 MΩ·cm H2O. Ajustar a pH7,4 antes de la filtración estéril de 0,22 μm. Conservar a 4 °C hasta el día del aislamiento.</li>
		<li>Tampón de limpieza: Prepare 1 L de tampón de limpieza (NaCl, KCl, NaH 2PO 4, HEPES, glucosa, EDTA y BDM) en 1 L de ultrapuro 18.2 MΩ·cm H2O. Ajuste a pH7.4 antes de la filtración estéril de 0.22 μm. Conservar a 4 °C hasta el día del aislamiento.</li>
		<li>Solución madre de CaCl 2 de 100 mM: Pesar 1,11 g de CaCl 2 y disolver en 100 ml de 18,2 MΩ·cmH2O. ultrapuro hasta el día del aislamiento.</li>
		<li>Alícuotas de liberasa: Disuelva 5 mg de enzimas digestivas en 5 ml de agua estéril sin RNasa. Preparar 0,8 ml de alícuotas y almacenar a -20 °C hasta el día del aislamiento.</li>
		<li>Laminar los platos: Aplicar 100 μL de laminina de ratón de 40 μg/ml a placas de Petri estériles de 30 ml con fondo de vidrio. Dejar reposar durante 30 min y eliminar el exceso de laminina. Coloque la laminina en una placa de Petri con incubación UV a temperatura ambiente durante 30 min. Conservar a 4 °C hasta el día del aislamiento (las placas de Petri laminadas pueden utilizarse hasta 2 semanas).</li>
		<li>Medios DMEM: En un gabinete de bioseguridad, agregue 2.5 ml de FBS, 0.5 ml de penicilina-estreptomicina (50 U/mL-50 μg) y 1 ml de 500 mM BDM a 46 ml de DMEM. Conservar a 4 °C hasta el día del aislamiento (el medio puede utilizarse hasta 2 semanas).</li>
		<li>Medios M199: Prepare 1 L de medio M199 (NaHCO3, HEPES, L-glutatión, M199, BDM y BSA) en 1 L de 18.2 MΩ·cm H2O. Ajuste a pH 7.4 antes de la filtración estéril (filtro de 0.22 μm). Conservar a 4 °C hasta el día del aislamiento.</li>
		<li>500 mM BDM stock: Añadir 0,5 g de BDM a 10 mL de ultrapuro 18,2 MΩ·cm H2O. Conservar a 4 °C hasta el día del aislamiento.</li>
		<li>Creación de plataforma estabilizadora: Moldee plastilina alrededor de la base de la aguja atornillada en la llave de paso Luer. Moldee la placa de Petri que contendrá el corazón y asegúrese de que la aguja esté a la altura adecuada para la inyección del ventrículo (~ 5 mm por encima del fondo del plato).</li>
	</ol></li>
	<li>El día del aislamiento<ol><li>Tampón de perfusión: El día del aislamiento, añadir 9,5 mg de MgCl2 a 100 ml de base tampón de perfusión. Deje mezclar completamente antes de retirar 30 ml de tampón de perfusión completo y colóquelo en una botella de vidrio limpia y de boca ancha de 100 ml con tapa de rosca (tampón de digestión). NOTA: Estas adiciones se pueden hacer el día del aislamiento sin ajustes adicionales de pH, ya que su adición altera insignificantemente el pH.<ol><li>Retire 12 ml de tampón de perfusión y colóquelo a un lado (tampón de parada). Vierta los 58 ml restantes de tampón de perfusión en otra botella de vidrio limpia y de boca ancha de 100 ml con tapa de rosca. Conservar el tampón de perfusión restante a 37 °C durante todo el aislamiento.</li>
		</ol></li>
		<li>Tampón de digestión: Añadir 7,5 μL de 100 mM CaCl2 a 30 ml de tampón de perfusión para una concentración final de 25 μM. Inmediatamente antes del aislamiento, añadir 770 μL de Liberase al tampón de digestión para una concentración final de 26 μg/ml.</li>
		<li>Detener tampón: Disolver 240 mg de BSA en 12 ml de tampón de perfusión. Conservar a 37 °C durante todo el aislamiento.</li>
		<li>Tampón de limpieza: Prepare una jeringa de 3 ml de tampón de limpieza y limpie la aguja de burbujas. Almacenar en hielo hasta el aislamiento.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparación del colector
<ol><li>Limpie el colector de temperatura controlada con tampón de perfusión recién preparado, teniendo cuidado de asegurarse de que no queden burbujas. Con un conector de bloqueo Luer, atornille una aguja de 27 G y limpie las burbujas. Un colector despejado es esencial para un aislamiento exitoso.</li>
</ol>3. Preparación animal
<ol><li>Inyectar el ratón por vía intraperitoneal con 100 mg/kg de ketamina y 20 mg/kg de xilazina por peso corporal inmediatamente antes del aislamiento. Este procedimiento utilizó un ratón macho C57Bl/6 de 4 meses de edad.</li>
	<li>Si es necesario, coloque el ratón en una almohadilla quirúrgica calentada para estimular la sedación. Coloque los brazos del ratón y pegue las extremidades y la base de la cola a un pañal azul de laboratorio. Asegúrese de que el animal esté completamente anestesiado mediante la retirada del reflejo de pellizco del dedo del pie. Aplique una cortina estéril alrededor del área quirúrgica.</li>
</ol>4. Procedimiento de aislamiento de cardiomiocitos
<ol><li>Exponer el esternón del ratón y, lateralmente a la línea media, cortar proximalmente a través de las costillas y a la axila. Corte suavemente completamente a través del diafragma, asegurando cortes poco profundos para evitar el corazón. Sujete el esternón con un hemostático y doble las costillas hacia atrás para exponer la cavidad torácica.</li>
	<li>Retire suavemente el pericardio del corazón y corte completamente a través de la vena cava inferior, inmediatamente distal al corazón. Use una jeringa de 3 ml con una aguja de 27 g para inyectar rápidamente 3 ml de tampón de limpieza helada en el ventrículo derecho del corazón durante 1 minuto.</li>
	<li>Sostenga suavemente el corazón con pinzas y aléjese del cuerpo, exponiendo la mayor cantidad posible de aorta. Usando un hemostático, sujete la aorta ascendente, teniendo cuidado de no sujetar las aurículas, y extirpe el corazón del pecho.</li>
	<li>Transfiera rápidamente el corazón pinzado a la tapa de una placa de Petri de polipropileno con aproximadamente 10 ml de tampón de perfusión caliente. Coloque el corazón pinzado en la plataforma de soporte y use una aguja estabilizada de 27 G conectada al colector para inyectar 10 ml de tampón de perfusión de temperatura controlada a 37 °C en el ventrículo izquierdo durante 5 min.</li>
	<li>Transfiera el corazón pinzado y la plataforma de soporte a una placa de Petri con aproximadamente 5 ml de tampón de digestión. Intercambie las jeringas de entrada por una jeringa de 50 ml con 25 ml de tampón de digestión.</li>
	<li>Limpie el colector de cualquier burbuja y el tampón de perfusión restante antes de la inyección. Reemplace cuidadosamente la aguja en la misma posición de la aguja en el ápice ventricular izquierdo.</li>
	<li>Use una bomba de perfusión para inyectar tampón de digestión de temperatura controlada a 37 °C en el ventrículo izquierdo durante 15 minutos usando una jeringa de 50 ml. Controle la temperatura de la solución con una camisa de agua previamente calibrada para expulsar una solución a 37 °C en el extremo de la aguja.</li>
	<li>Retire los ventrículos de las aurículas y transfiéralos a un vaso de precipitados de 10 ml. Agregue 3 ml de tampón de digestión al vaso de precipitados y, con tijeras afiladas, corte los ventrículos en trozos grandes. Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio y colóquelo en un baño de agua agitante precalentado a 37 °C durante 5 min.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante, teniendo cuidado de evitar eliminar trozos de tejido. Resuspender los trozos de tejido en 3 ml de tampón de digestión y triturar durante aproximadamente 4 minutos o hasta que se logre una mezcla homogénea.</li>
	<li>Filtre las células a través de un filtro de células de nylon de 70 μm en un tubo de polipropileno de 50 ml.</li>
	<li>Devolver el filtrado a un tubo de polipropileno de fondo redondo de 14 ml y centrifugar durante 1 min a 100 rpm. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 ml de tope de parada.</li>
	<li>Añadir 54 μL de material de CaCl 2 de 100 mM a las células resuspendidas para obtener una concentración final de CaCl2 de 1,8 mM. Este paso también se puede realizar paso a paso para aumentar el rendimiento celular.</li>
	<li>Deje que las células vivas se asienten por gravedad durante 10 minutos antes de retirar el sobrenadante que contiene células muertas. Resuspender el pellet en solución de almacenamiento (solución de perfusión con 200 μM CaCl2). Estas células ahora se pueden usar para experimentos funcionales (es decir, imágenes / contracción de calcio, pinza de parche, etc.), cultivo, etc. NOTA: Las células también pueden ser resuspendidas en soluciones dependientes de laboratorio o experimento.</li>
</ol>5. Cultivo celular
<ol><li>Cuente las células usando un hemocitómetro o por un conteo de vista de campo usando una cubierta cuadriculada. Como los miocitos son muy grandes, el conteo con un hemocitómetro no siempre es preciso. Esto se utiliza para tener una idea de aproximadamente cuántas células se obtuvieron del aislamiento.</li>
	<li>Diluya las células a ~ 25,000 células / ml con medios DMEM. Agregue 1 ml de solución celular a cada pocillo.</li>
	<li>Incubar a 37 °C, 95% O2, 5%CO2 durante 2 h.</li>
	<li>Aspire suavemente los medios DMEM de cada pocillo y agregue 2 ml de medios M199.</li>
	<li>Incubar a 37 °C, 95% O2, 5%CO2 durante un máximo de 24 h.</li>
</ol>

<ol><li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li>
<li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li>
<li>Traynham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesterified+nitrone+rescues+nitroso-redox+levels+and+increases+myocyte+contraction+via+increased+SR+Ca%282%2B%29+handling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling.</a> PLoS One. 7 (12), 52005(2012).</li>
<li>Nixon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+troponin+I+Ser-150+and+Ser-23%2F24+phosphorylation+sustains+thin+filament+Ca%282%2B%29+sensitivity+and+accelerates+deactivation+in+an+acidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).</li>
<li>Swager, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-5+levels+are+reduced+from+multiple+cell+types+in+human+failing+hearts+and+are+associated+with+mislocalization+of+ephrin-B1%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).</li>
<li>Pinckard, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+endocrine+role+for+the+BAT-released+lipokine+12%2C13-diHOME+to+mediate+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function.</a> Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).</li>
<li>Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+increased+systolic+Ca2%2B+and+phospholamban+phosphorylation+during+beta-adrenergic+stimulation+on+Ca2%2B+transient+kinetics+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).</li>
<li>Harris, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+3%27-sialyllactose+in+breast+milk+is+a+critical+mediator+to+improve+metabolic+health+and+cardiac+function+in+mouse+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring.</a> Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).</li>
<li>Roof, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXL-1020%2C+a+novel+nitroxyl+%28HNO%29+prodrug%2C+is+more+effective+than+milrinone+in+models+of+diastolic+dysfunction-a+cardiovascular+therapeutic%3A+an+efficacy+and+safety+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat.</a> Frontiers in Physiology. 8, 894(2017).</li>
<li>Milani-Nejad, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research%3A+advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li>
<li>Harary, I., Farley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+single+isolated+beating+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of single isolated beating heart cells.</a> Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).</li>
<li>Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+collagenases+and+other+proteolytic+enzymes+in+the+dispersal+of+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues.</a> Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).</li>
<li>Baker, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+apparatus+for+mammalian+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An improved apparatus for mammalian heart perfusion.</a> The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).</li>
<li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).</li>
<li>Motayagheni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Langendorff+technique+for+mouse+heart+cannulation%3A+Improved+heart+quality+and+decreased+risk+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia.</a> MethodsX. 4, 508-512 (2017).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+procedure+for+isolating+adult+mouse+cardiomyocytes+for+epicardial+activation+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).</li>
<li>Jian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cannulation+methods+for+cardiomyocytes+isolation+from+heart+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models.</a> PLoS One. 11 (8), 0160605(2016).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+Langendorff-free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li>
<li>Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Langendorff-free+method+for+isolation+of+cadiomyocytes+from+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22AIP+Conference+Proceedings%22%5BJournal%5D)">A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart.</a> AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140(2019).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688(2018).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antegrade+perfusion+method+for+cardiomyocyte+isolation+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61866(2021).</li>
<li>Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+preparation+of+Ca2%2B+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers.</a> Methods in Cell Biology. 99, 126(1994).</li>
<li>Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+myocytes+from+the+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Preparative+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart.</a> Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).</li>
<li>Thum, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butadione+Monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li>
<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).</li>
</ol>

No hay conflictos de intereses que revelar.

La principal ventaja de nuestra técnica de aislamiento de cardiomiocitos sin Langendorff es que limita la hipoxia y el tiempo isquémico al no requerir canulación a un aparato de Langendorff. Alternativamente a las técnicas clásicas de Langendorff que tardan varios minutos en extraer, limpiar y colgar el corazón, lo que a menudo resulta en daño isquémico al miocito, nuestro método incluye una limpieza in vivo de la sangre a través de una solución de limpieza helada. El tampón de limpieza helada contiene ...

Durante décadas, una idea esencial en la literatura de biología cardíaca es el mecanismo de acción molecular. El mecanismo de acción debe establecerse para publicar estudios confiables. Una estrategia bien establecida para determinar el mecanismo molecular son los estudios aislados de cardiomiocitos, que requieren cardiomiocitos de alta calidad para obtener datos confiables. Los experimentos celulares y moleculares realizados en cardiomiocitos para determinar el mecanismo de acción son el estándar de oro para investigar la contracción1, electrofisiología2, calcio (Ca 2+) ciclo3, miofilamento Ca2+ sensibilidad4, citoesqueleto5, metabolismo6, efectos de las hormonas7, moléculas de señalización8, estudios farmacológicos9 etc. El ratón se ha convertido en la especie de elección para la mayoría de los experimentos de biología cardíaca debido a la facilidad de manipulación genética, su pequeño tamaño, su vida útil relativamente corta, bajo costo, etc.10. Sin embargo, el aislamiento confiable de cardiomiocitos de ratón de alta calidad no es trivial con las técnicas actuales.
Los laboratorios han estado aislando cardiomiocitos durante casi 70 años11. Prácticamente todas las técnicas para aislar cardiomiocitos se basan en la digestión del corazón a través de varias enzimas (colagenasa, proteasa, tripsina, etc.). En los primeros períodos (1950-1960), se empleó el método de trozos, que consistía en extraer el corazón, cortar en trozos mucho más pequeños e incubar en solución con colagenasa / proteasa / tripsina12. En la década de 1970, los laboratorios implementaron el método mejorado "Langendorff"13, que aisló cardiomiocitos utilizando una técnica de aislamiento basada en la perfusión de la arteria coronaria (perfusión retrógrada con enzima a través del aparato de Langendorff); Esta técnica sigue siendo el método dominante de aislamiento de miocitos en el campo hoy en día, ~ 50 años después14,15,16. El trabajo reciente se ha desplazado a la canulación del corazón in vivo para limitar el tiempo de hipoxia y el daño isquémico, lo que resulta en aislamientos de cardiomiocitos superiores (mejores rendimientos y mayor calidad)17. Recientemente, esto ha evolucionado para realizar perfusiones cardíacas in vivo sin Langendorff 18,19,20,21,22. Hemos evolucionado la técnica de aislamiento de cardiomiocitos sin Langendorff basada en la técnica de Ackers-Johnson et al.18 y hemos adaptado varios componentes de las muchas técnicas de aislamiento anteriores. Estas adaptaciones clave incluyen la inyección de un tampón de limpieza helada y la incorporación de una plataforma de soporte para estabilizar la aguja, lo que permite una menor manipulación del corazón. También se detalla en esta técnica el control de la temperatura de los tampones inyectados (37 °C), lo que disminuyó el tiempo entre la inyección in vivo y la digestión debido a una menor perfusión de EDTA como se publicó anteriormente18. Al disminuir la manipulación del corazón y, por lo tanto, minimizar el tamaño del sitio de punción, se obtiene una perfusión completa y constante de las arterias coronarias. También refinamos la técnica con un método secundario de digestión de trozos, la cantidad de EDTA en el tampón de limpieza inyectado y cambiamos el pH. Nuestra técnica descrita es más confiable, más eficiente y no requiere el entrenamiento / práctica extensiva en comparación con el uso del aparato de Langendorff (Tabla 1).

<table><tbody><tr><td>10 cc Bd Jeringa Luer-Lok</td><td>Fisher Sci</td><td>14-827-52</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pyrex Vaso de precipitados de forma baja</td><td>Cole-Palmer</td><td>UX-34502-01</td><td></td></tr><tr><td>100 mL Botella de almacenamiento de medios de vidrio con tapa de polipropileno</td><td>DWK Life Sciences</td><td>UX-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Tubos de ensayo de polipropileno de fondo redondo con tapa</td><td>Fisher Sci</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>2,3-butanediona Monoxima</td><td>Sigma</td><td>B0753</td><td>>98%</td></tr><tr><td>3 cc BD Luer-Lok Jeringa</td><td>Fisher Sci</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio de 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>50 mL BD Jeringa sin aguja</td><td>Fisher Sci</td><td>13-689-8</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos de centrífuga cónicos</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-22999-84</td><td></td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS Almohadilla térmica de gel espacial</td><td>Fisher Sci</td><td>14-370-223</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 27 g x 1/2" Agujas hipodérmicas</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A3803</td><td>Fracción de choque térmico, polvo liofilizado, esencialmente libre de ácidos grasos, >98%</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>>99%</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Adecuado para cultivo celular, >99.5%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Sci</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Sci</td><td>AAA1071336</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC-tratado con TC Plato de cultivo Corning</td><td></td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>R& D Systems (Bio-techne)</td><td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Circuladores de inmersión calefactados</td><td>Fisher Sci</td><td>13-874-432</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas hemostáticas Hartman Mosquito</td><td>World Precision Instruments</td><td>15921</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Scientific Hy-Lite Juego de cámaras de conteo</td><td>Fisher Sci</td><td>02-671-11</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>>99.5%</td></tr><tr><td>Cinta de etiquetado</td><td>Fisher Sci</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>Legato 100 Bomba de jeringa</td><td>kdScientific</td><td>788100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutatión</td><td>Fisher Sci</td><td>ICN19467980</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TH Research Grade</td><td>Sigma</td><td>5401135001</td><td>Alta concentración de termolisina</td></tr><tr><td>M199</td><td>Fisher Sci</td><td>MT10060CV</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de</td> <td>magnesioInvitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Laminina de ratón</td><td>Corning 354232</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Fisher Sci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>>99%</td></tr><tr><td>Baño de agua alternativo digital de precisión</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td> TSCIR19 <td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Adecuado para células cultivo</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>>99%</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td>>99%</td></tr><tr><td>Filtro de células estériles 70 &micro; m</td><td>Fisher Sci</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Estudiante Tijeras Finas</td><td>Herramientas de Ciencias Finas</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas absorbentes VWR</td><td>Fisher Sci</td><td>NC9481815</td><td></td></tr></tbody></table>

un método simple y efectivo para aislar consistentemente cardiomiocitos de ratón

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

La necesidad de métodos reproducibles pero técnicamente simples que produzcan cardiomiocitos de alta calidad es esencial para la investigación en biología cardíaca. Los experimentos funcionales celulares y moleculares (por ejemplo, contracción, electrofisiología, ciclo de calcio, etc.) en cardiomiocitos son el estándar de oro para establecer los mecanismos de la enfermedad. El ratón es la especie de elección para experimentos funcionales y la técnica descrita es específicamente para el aislamiento de cardiomiocitos de ratón. Los métodos anteriores que requerían un aparato de Langendorff requieren altos niveles de entrenamiento y precisión para la canulación aórtica, lo que a menudo resulta en isquemia. El campo se está desplazando hacia métodos de aislamiento sin Langendorff que son simples, son reproducibles y producen miocitos viables para la adquisición de datos fisiológicos y el cultivo. Estos métodos disminuyen en gran medida el tiempo de isquemia en comparación con la canulación aórtica y dan como resultado cardiomiocitos obtenidos de manera confiable. Nuestra adaptación al método sin Langendorff incluye una perfusión inicial con solución de limpieza helada, el uso de una plataforma estabilizadora que garantiza una aguja estable durante la perfusión y pasos de digestión adicionales para garantizar la obtención confiable de cardiomiocitos para su uso en mediciones funcionales y cultivo. Este método es simple y rápido de realizar y requiere poca habilidad técnica.

Hay algunos elementos a examinar al determinar el éxito de un aislamiento. En primer lugar, los cardiomiocitos deben tener forma de bastón sin ampollas de membrana, como las células aisladas en la Figura 1. Un aislamiento típico producirá ~ 80% de los miocitos en forma de bastón. Si el aislamiento produce menos del 50% de células en forma de bastón, entonces se considera un aislamiento fallido y no se utilizan cardiomiocitos. Por último, los cardiomiocitos deben estar inactivos. Los miocitos...

El estándar de oro en cardiología para experimentos funcionales celulares y moleculares son los cardiomiocitos. Este artículo describe adaptaciones a la técnica no Langendorff para aislar cardiomiocitos de ratón.

Un método simple y efectivo para aislar consistentemente cardiomiocitos de ratón

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Esta técnica es más fiable y eficiente y no requiere una amplia práctica o entrenamiento en comparación con las técnicas de aparatos Langendorff más utilizadas. La principal ventaja de esta técnica es que limita el tiempo isquémico ya que la perfusión inicial se produce in vivo. Al realizar esta técnica, es esencial evitar burbujas en el colector y evitar el movimiento excesivo del corazón durante la digestión, estas pueden disminuir el rendimiento.Demostrando esta técnica estará Sarah Sturgill, una estudiante graduada en el laboratorio del Dr. Mark Ziolo. Comience limpiando el colector de temperatura controlada utilizando un tampón de perfusión recién preparado. Para hacerlo, atornille una aguja de calibre 27 y limpie las burbujas con un conector luer lock.Asegúrese de que no queden burbujas. Para aislar el cardiomiocitos, exponer el esternón del ratón completamente anestesiado, y lateral a la línea media, cortar proximalmente a través de las costillas y a la axila. Luego corte a través del diafragma, asegurando cortes poco profundos para evitar el corazón.Sujete el esternón con un hemostático y doble las costillas hacia atrás para exponer la cavidad torácica. Retire el pericardio del corazón suavemente antes de cortar a través de la vena cava inferior inmediatamente distal al corazón. Inyecte tres mililitros de tampón de limpieza helada en el ventrículo derecho del corazón durante un minuto con una aguja de calibre 27.Luego, sostenga el corazón con pinzas. Aleje el cuerpo y exponga la mayor cantidad posible de aorta. Luego sujete la aorta ascendente con un hemostático y extirpe el corazón.Transfiera rápidamente el corazón sujetado a la tapa de una placa de Petri de polipropileno que contenga 10 mililitros de tampón de perfusión caliente. Coloque el corazón pinzado en la plataforma de soporte e inyecte 10 mililitros de tampón de perfusión con temperatura controlada a 37 grados centígrados en el ventrículo izquierdo durante cinco minutos usando una aguja estabilizada de calibre 27 conectada al colector. A continuación, transfiera el corazón pinzado y la plataforma de soporte a una placa de Petri con aproximadamente cinco mililitros de tampón de digestión.Intercambie las jeringas de entrada por una jeringa de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de tampón de digestión. Limpie el colector de cualquier burbuja y el tampón de perfusión restante antes de la inyección. Reemplace cuidadosamente la aguja en la misma posición de la aguja en el ápice ventricular izquierdo.Con la ayuda de una bomba de perfusión, inyecte tampón de digestión de 37 grados centígrados en el ventrículo izquierdo durante 15 minutos con una jeringa de 50 mililitros. Controle la temperatura de la solución con una camisa de agua calibrada para expulsar una solución de 37 grados centígrados. Retire los ventrículos de las aurículas antes de transferirlos a un vaso de precipitados de 10 mililitros.Agregue tres mililitros de tampón de digestión al vaso de precipitados y corte los ventrículos en trozos grandes con tijeras afiladas. Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio y colóquelo en un baño de agua agitante precalentado a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, resuspenda los trozos de tejido en tres mililitros de tampón de digestión y triture durante aproximadamente cuatro minutos o hasta que se logre una mezcla homogénea.Una vez hecho esto, filtre las células en un tubo de polipropileno de 50 mililitros con un colador de células de nylon de 70 micrómetros. Lave el colador de células de nylon con tres mililitros de tampón de digestión. Devolver el filtrado a un tubo de polipropileno de fondo redondo de 14 mililitros y centrifugarlo.Deseche el sobrenadante antes de resuspender el pellet en tres mililitros de tope de parada. A la suspensión celular, agregue 54 microlitros de 100 milimolares de cloruro de calcio para que la concentración final de cloruro de calcio sea de 1.8 milimolar. Deje que las células vivas se asienten durante 10 minutos y retire el sobrenadante que contiene células muertas.Después de resuspender el pellet en una solución de almacenamiento, las células se pueden utilizar para experimentos funcionales y cultivos. Las imágenes de microscopio de campo claro de células aisladas mostraron que el aislamiento de cardiomiocitos de ratón produjo células quiescentes en forma de bastón sin ampollas de membrana ni bordes redondeados. Las células mostraron aproximadamente un 80% de rendimiento y altas tasas de supervivencia que determinaron el éxito de la técnica de aislamiento.Para un aislamiento exitoso, es más importante eliminar las burbujas del colector e insertar la aguja en el mismo orificio del corazón. Una vez aislados, los cardiomiocitos se pueden utilizar para experimentos funcionales celulares y moleculares.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Los cultivos primarios de cardiomiocitos de ratón son una de las herramientas fundamentales para la investigación de la organización miofibrilar y la función. El siguiente protocolo describe el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos primarios de corazones de ratón neonatales. Los cultivos de cardiomiocitos resultantes pueden usarse posteriormente para una variedad de ensayos biomecánicos, bioquímicos y de células biológica.

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales Ratón

Aquí se describe el aislamiento de cardiomyoctyes adultas de ratón utilizando un sistema de perfusión Langendorff. Las células resultantes son de Ca2 +-tolerante, eléctricamente en reposo y pueden ser cultivadas y transfectadas con adeno-o lentivirus para manipular la expresión génica. Su funcionalidad también puede ser analizado usando el sistema de MMSYS y técnicas de patch clamp.

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

Se pueden aislar del corazón cardiomiocitos individuales de ratones de tipo salvaje y mutantes para estudiar su contractilidad y transitorios de calcio. Esto permite caracterizar la contribución de la disfunción celular a la disfunción cardíaca por cualquier causa.

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

Se describe un método fiable para el aislamiento de cardiomiocitos de ratón adulto. Este protocolo se obtiene un resultado coherente para el cultivo de cardiomiocitos adultos funcionales a partir de una variedad de ratones modificados genéticamente.

Aislamiento y cultivo de ratón adulto cardiomiocitos de Señalización Celular y<em&gt; In vitro</em&gt; Hipertrofia Cardíaca

Este protocolo describe un método paso a paso para el aislamiento reproducible y el cultivo a largo plazo de cardiomiocitos de ratón adultos con alto rendimiento, pureza y viabilidad.

Aislamiento, cultivo y la transducción de cardiomiocitos de ratones adultos

Este protocolo se utiliza para aislar cardiomiocitos auriculares individuales del corazón adulto del ratón utilizando un enfoque de digestión de trozos. Este enfoque se utiliza para aislar los miocitos auriculares derecho o izquierdo que se pueden utilizar para caracterizar la electrofisiología de miocitos auriculares en estudios de abrazaderas de parches.

Aislamiento de miocitos auriculares de ratones adultos

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento, la transfección y el cultivo a largo plazo de los cardiomiocitos adultos de ratón y rata.

Aislamiento, Transfección y Cultura a Largo Plazo de Cardiomiocitos adultos de ratón y rata

Se describe un método para el aislamiento simultáneo de micocitos y no miocitos tanto de las adriículas como de los ventrículos de un solo corazón de ratón adulto. Este protocolo da como resultado rendimientos consistentes de micocitos cardíacos altamente viables y no miocitos y detalla condiciones óptimas de cultivo específicos de células para fenotipado y análisis in vitro.

Aislamiento simultáneo y cultura de los miocitos atriales, los miocitos ventriculares y los no miocitos de un corazón de ratón adulto

Desarrollamos un método simple para aislar las células individuales de alta calidad del corazón del ratón por la técnica anterógrada de la perfusión. Este método está libre de Langendorff y es útil para aislar miocitos ventriculares y auriculares o células intersticiales, como fibroblastos cardíacos o progenitores.

Un Método De Perfusión Anterógrada Para El Aislamiento De Cardiomiocitos De Ratones

Los modelos de ratón permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis. Para este propósito, los cardiomiocitos de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de parche y pinza. Aquí, se describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares a través de la perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, que permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corriente de calcio de tipo L.

Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L

Este protocolo describe modificaciones del método de Langendorff, incluida la profundidad de la canulación de la aorta para el aislamiento simultáneo de miocitos auriculares y ventriculares de ratones adultos.

Modificaciones del método de Langendorff para el aislamiento simultáneo de miocitos auriculares y ventriculares de ratones adultos

Aprenda un método eficiente para aislar cardiomiocitos de ratón sin técnica Langendorff, minimizando el tiempo isquémico con perfusión in vivo. Este protocolo mejora el rendimiento celular y facilita experimentos funcionales en cardiología.

Un método simple y efectivo para aislar consistentemente cardiomiocitos de ratón

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