Hibridación de fluorescencia in situ interfásica de frotis de médula ósea de mieloma múltiple
15 de abril de 2022
Aquí, presentamos un protocolo para mejorar el éxito de la detección de hibridación de fluorescencia in situ interfásica en frotis de médula ósea de pacientes con mieloma múltiple.
La aplicación de la Hibridación Fluorescente In Situ llamada FISH a la estratificación del riesgo genético en el mieloma múltiple es esencial. La parte crítica de los informes fish no son todas las células nucleadas, sino las células plasmáticas clonales específicamente purificadas o identificadas mediante la clasificación con perlas magnéticas anti-CD138 o el marcado con kappa citoplasmático o inmunoglobulina de cadena ligera Lambda con pruebas FISH llamadas cIg FISH. La interfase FISH después de la clasificación de células plasmáticas o cIg FISH resulta ser significativa en el diagnóstico de mieloma múltiple, debido a la proporción relativamente menor de células plasmáticas en la médula ósea.
Sin embargo, estos métodos tienen algunas deficiencias, incluidos procesos complejos, altas demandas de muestras y altos costos experimentales. Las células plasmáticas se pueden localizar rápidamente en un frotis de médula ósea. En base a esto, utilizamos el frotis de médula ósea FISH para la detección de células de mieloma múltiple.
Este estudio se realizó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan. Los especímenes fueron recolectados de un paciente con mieloma múltiple en el Departamento de Hematología del Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan de China. Coloque los primeros 0,2 mililitros de solución de médula ósea en un portaobjetos de vidrio desechable limpio, extienda los frotis de médula ósea a un grosor uniforme y colas afiladas retirando rápidamente la médula ósea y luego séquela naturalmente.
Cubra las películas de médula ósea con un mililitro de solución de Wright-Giemsa durante aproximadamente 10 segundos a temperatura ambiente. Agregue un mililitro de tampón de fosfato a las diapositivas, se requirió cuidado para evitar que la solución de tinte se seque o fluya fuera de las diapositivas. Mezcle la solución de tinte suavemente y manténgala durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Enjuague los toboganes con agua limpia y séquelos en el aire a temperatura ambiente. Use microscopía de luz hacia adelante para detectar células plasmáticas malignas, las células plasmáticas deben estar bien dispersas. Ahora lo que vemos en el campo son las células plasmáticas que están bastante dispersas.
Esta es una célula de plasma nuclear binuclear típica. Cubra el área hibridada con solución fijadora durante 10 minutos para decolorar y fijar las células plasmáticas. Enjuague el portaobjetos con agua desionizada y séquelo al aire a temperatura ambiente.
Precaliente un frasco que contenga dos veces el tampón SSC a 56 grados Celsius en un baño de agua. Lave el frotis de médula ósea preparado en el tampón SSC precalentado dos veces durante 10 minutos, seguido de sumergirlo en agua desionizada a temperatura ambiente. Deshidrate el frotis en un gradiente de etanol 70%85% y 100% etanol cada uno durante un minuto.
Seque el frotis al aire durante 10 minutos. Primero agregue TP53 en el centrómero de la mezcla de sonda del cromosoma 17 al área de hibridación y cúbralo con una cubierta deslizante presione suavemente las pinzas puntiagudas finas para eliminar las burbujas de aire de debajo. Selle todos los lados del deslizamiento de la cubierta con cemento de goma para garantizar una buena estanqueidad.
Después de la solidificación del cemento de caucho, la corredera se colocó en una máquina automática FISH, la desnaturalización se realizó a 78 grados centígrados durante cinco minutos, seguida de hibridación a 37 grados centígrados durante la noche. Recoja la diapositiva de la máquina FISH. Use unas pinzas puntiagudas finas para quitar el cemento de goma suavemente.
Sumerja la corredera en dos veces SSC a temperatura ambiente durante aproximadamente uno o dos minutos para lavar el deslizamiento de la cubierta. Lave el tobogán en un tampón de precalentamiento de 68 grados Celsius en un baño de agua durante dos minutos. Lave los toboganes con dos veces SSC en un baño de agua de 37 grados Celsius durante un minuto.
Configure justo en la oscuridad para que se seque bien durante 10 minutos a 10 microlitros de DAPI en el área hibridada, cubra con un resbalón de cubierta. Vea la diapositiva hibridada utilizando un conjunto de filtros adecuado en un microscopio de fluorescencia, use un filtro óptico de fluoróforo azul monocromático para observar la intensidad de fluorescencia del núcleo celular. Tome imágenes del núcleo celular bajo un conjunto de filtros DAPI.
CEP17 fue etiquetado con fluorescencia verde. Utilice el filtro óptico de fluoróforo verde de espectro para observar la ubicación de CEP17. Tome la imagen de las señales CEP17 bajo el conjunto de filtros verdes.
El gen TP53 fue marcado con fluorescencia naranja. Utilice el filtro óptico de fluoróforo naranja de espectro para observar TP53, tome la imagen de señales TP53 debajo del conjunto, fusione estas tres imágenes en su totalidad y examine las anomalías numéricas. En una célula interfase normal se observan dos señales naranjas y dos verdes dentro de un núcleo con fluorescencia azul que indica un par de cromosomas normales 17.
Los resultados mostraron la morfología y genética de la médula ósea en un paciente con mieloma múltiple. La Figura A mostró que se encontró que el 15% de las células plasmáticas en un frotis de médula ósea tenían cantidades más grandes y oscuras y nucleares junto con grandes cantidades de citoplasma de lo normal. La figura B mostró una imagen en escala de grises representativa por una célula plasmática nucleada en un frotis de médula ósea.
La Figura C mostró cuatro señales naranjas y cuatro verdes en un núcleo interfase de células plasmáticas, lo que sugiere que cuatro copias del cromosoma 17 se localizaron en un núcleo. La Figura D mostró que el cariograma cromosómico anormal de este paciente confirmó dos pares de cromosomas 17 en un núcleo. Los frotis de médula ósea son mucho más fáciles de obtener que las muestras de médula ósea anticoagulantes porque la obtención de médula ósea anticoagulada requiere procedimientos complejos para obtener el núcleo.
En consecuencia, establecimos un método convincente para el frotis de médula ósea FISH para la detección de células de mieloma múltiple.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para mejorar la eficacia de la detección de hibridación fluorescente in situ en interfase (FISH) en frotis de médula ósea de pacientes con mieloma múltiple. El estudio destaca la importancia de identificar con precisión las células plasmáticas clonales para un diagnóstico efectivo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oncología
- Genética
Antecedentes
- La hibridación fluorescente in situ (FISH) es fundamental para la estratificación del riesgo genético en el mieloma múltiple.
- Es necesario identificar específicamente las células plasmáticas clonales para un informe preciso de FISH.
- Los métodos actuales presentan limitaciones, como la complejidad y los altos costos.
- Los frotis de médula ósea pueden facilitar una identificación más rápida de las células plasmáticas.
Objetivo del estudio
- Mejorar la detección de células de mieloma múltiple mediante FISH en frotis de médula ósea.
- Abordar las limitaciones de los métodos de FISH existentes.
- Optimizar el proceso de identificación de células plasmáticas clonales.
Métodos Utilizados
- Uso de microesferas magnéticas anti-CD138 para la clasificación de células plasmáticas.
- Aplicación de marcado de cadenas ligeras citoplasmáticas kappa o lambda de inmunoglobulina.
- Aplicación de FISH en interfase tras la clasificación de células plasmáticas.
- Uso de FISH en frotis de médula ósea para una detección eficiente.
Resultados principales
- La hibridación in situ con fluorescencia en frotis de médula ósea identifica eficazmente las células de mieloma múltiple.
- Mayor precisión en el diagnóstico del mieloma múltiple mediante la detección dirigida de células plasmáticas.
- Reducción de la demanda de muestras y de los costos experimentales en comparación con los métodos tradicionales.
- Un protocolo mejorado facilita un diagnóstico y planificación del tratamiento más rápidos.
Conclusiones
- El estudio presenta una alternativa viable para la detección de células de mieloma múltiple.
- La hibridación fluorescente in situ en frotis de médula ósea puede superar las limitaciones de las técnicas de FISH existentes.
- La investigación futura podría centrarse en optimizar aún más este método para su uso clínico.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método aborda un cuello de botella clave en el diagnóstico del mieloma múltiple al permitir el análisis de FISH en frotis de médula ósea fácilmente disponibles, reduciendo la dependencia de aspirados frescos heparinizados. Facilita una estratificación genética del riesgo más rápida y accesible en los flujos de trabajo de oncología hematológica, especialmente cuando la obtención de muestras es difícil. El enfoque mejora la continuidad traslacional al aumentar la viabilidad de los especímenes sin comprometer la especificidad de las células plasmáticas clonales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la detección de anomalías cromosómicas en células plasmáticas clonales directamente a partir de frotis, apoyando la desactivación de riesgos mecanicistas de dianas genómicas.
- Valor operativo: Reduce la complejidad del procesamiento de muestras al eliminar la necesidad de clasificación o enriquecimiento celular previo a la hibridación in situ por fluorescencia (FISH).
Desarrollo de pruebas y cribado
- Valor científico: Proporciona una plataforma estandarizada basada en frotis para FISH en interfase que mejora la disponibilidad del ensayo en muestras con bajo rendimiento o de difícil obtención.
- Valor operativo: Aumenta la reproducibilidad al minimizar las variables preanalíticas asociadas con el manejo y procesamiento de aspirados frescos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Apoya estudios alineados con biomarcadores al preservar el contexto espacial de las células plasmáticas en frotis, permitiendo la correlación entre la morfología y las alteraciones genéticas.
- Valor operativo: Facilita el monitoreo longitudinal en modelos preclínicos donde la aspiración repetida de médula ósea es poco práctica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad de descubrimiento a traslación al proporcionar un protocolo FISH factible cuando las muestras primarias son limitadas, lo que permite análisis genéticos posteriores sin retrasar la identificación de compuestos activos ni la validación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre alteraciones genómicas clonales mediante la hibridación fluorescente in situ (FISH) en frotis de médula ósea archivados o de difícil procesamiento.
- Detección: Mejora la estandarización del ensayo al utilizar frotis como sustrato uniforme para la hibridación y la detección de señales.
- Análisis: Permite la evaluación cuantitativa de cambios en el número de copias cromosómicas (por ejemplo, TP53, CEP17) en núcleos en interfase, lo que contribuye a la estratificación de riesgos.
- Investigación Traducional: Mantiene la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir muestreos repetidos mediante frotis en estudios longitudinales.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo reutilizable de frotis listos para FISH, aplicable a múltiples modelos de mieloma múltiple y tipos de muestras.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en la evaluación del riesgo genómico al permitir la hibridación in situ con fluorescencia (FISH) en muestras que de otro modo no serían adecuadas para el análisis.
- Valor operativo: Aumenta la capacidad de procesamiento del laboratorio y reduce el tiempo de respuesta al simplificar la preparación de las muestras.
- Valor estratégico: Disminuye el riesgo biológico y técnico en las decisiones iniciales al ampliar el acceso a datos citogenéticos críticos.
- Impacto en el portafolio: Apoya el avance ajustado al riesgo al hacer viable la estratificación basada en FISH en entornos con recursos limitados o en contextos clínicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el diseño de sondas FISH, hibridación y microscopía de fluorescencia para la interpretación precisa de las señales.
- Depende del acceso a equipos FISH estándar, incluyendo cámaras de hibridación, tampones de lavado y conjuntos de filtros para DAPI, verde espectro y naranja espectro.
- Necesita la estandarización de los protocolos de preparación de extendidos y tinción para garantizar una morfología de células plasmáticas y retención consistentes.
- Debe tener en cuenta la variabilidad en la densidad de células plasmáticas entre los extendidos al determinar la profundidad del muestreo y los umbrales de cuantificación de señales.
- Limitado al análisis en interfase; no permite el cariotipado en metafase ni la detección de reordenamientos estructurales sin métodos adicionales.
