Name: Generación de organoides del corazón humano autoensamblables derivados de células madre pluripotentes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprende a generar organoides cardíacos humanos autoensamblables a partir de células madre pluripotentes. Este protocolo de tres pasos permite modelar enfermedades cardiovasculares y realizar cribado farmacológico de alta eficiencia.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio K01HL135464 y R01HL151505 y por la Asociación Americana del Corazón bajo el número de premio 19IPLOI34660342. Deseamos agradecer al Núcleo de Microscopía Avanzada de MSU y al Dr. William Jackson en el Departamento de Farmacología y Toxicología de MSU por el acceso a microscopios confocales, el Núcleo de Microscopía IQ y el Núcleo de Genómica MSU por los servicios de secuenciación. También queremos agradecer a todos los miembros del Laboratorio Aguirre por sus valiosos comentarios y consejos.

1. Cultura y mantenimiento de hPSC
NOTA: Las PSC inducidas por humanos (hiPSC) o las células madre embrionarias humanas (hESC) deben cultivarse durante al menos 2 pasajes consecutivos después de la descongelación antes de ser utilizadas para generar EB para la diferenciación o la criopreservación adicional. Las hPSC se cultivan en medio PSC (consulte la Tabla de materiales) en placas de cultivo de 6 pocillos recubiertas de matriz extracelular de membrana basal (BM-ECM). Al realizar cambios de medio en hPSCs en placas de 6 pocillos, agregue el medio directamente al lado interno del pozo en lugar de directamente en la parte superior de las células para evitar el desprendimiento o estrés celular no deseado. Los usuarios deben tener cuidado con los medios PSC precalentados que no deben calentarse a 37 ° C; todos los medios PSC utilizados en este protocolo eran termoestables.
<ol><li>Para recubrir las placas de pozo con el BM-ECM, descongele una alícuota del BM-ECM (almacenada a -20 °C según las instrucciones del fabricante) en hielo y mezcle 0,5 mg del BM-ECM con 12 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/medio F12 (almacenado a 4 °C). Distribuya 2 ml de la mezcla DMEM/F12-BM-ECM en cada pocillo de una placa de 6 pocillos e incube a 37 °C durante al menos 2 h.</li>
	<li>Para descongelar las células, primero, descongele el criovial hPSC en una cuenta de 37 ° C o baño de agua durante 1-2 minutos hasta que solo se vea una pequeña cantidad de hielo. Transfiera las células descongeladas a un tubo de centrífuga y agregue lentamente 8-9 ml del medio PSC complementado con 2 μM del inhibidor de ROCK, tiazovivina (Thiaz) y centrífuga a 300 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en el medio PSC suplementado con 2 μM de Thiaz. Distribuya las células en el medio de cultivo en 1-2 pocillos dependiendo de la concentración de células crioviales y el cultivo a 37 °C, 5% de CO2 durante 24 h antes de cambiar el medio PSC.</li>
	<li>Cambie el medio en las celdas a intervalos de 48 h. Realice lavados y cambios de medio utilizando DMEM/F12 (1 mL/pozo) y el medio PSC (2 mL/pozo), respectivamente. NOTA: Los lavados ayudan a eliminar los desechos celulares y los desechos, mientras que los cambios en los medios frescos proporcionan a las células una fuente renovada de nutrientes.</li>
	<li>Pasar las células en la subconfluencia (60-80% confluente) aspirando el medio, luego lavar cada pozo con 1 ml de 1 solución tamponada con fosfato de Dulbecco (sin calcio, sin magnesio; DPBS). Aspire el DPBS y agregue 1 ml del reactivo de disociación para hPSC (consulte la Tabla de materiales), seguido de la aspiración de todos menos una película delgada del reactivo después de 10 s.</li>
	<li>Incubar durante 2-5 min con la película delgada del reactivo de disociación para hPSCs hasta que se formen huecos entre las células. NOTA: El tiempo para detener la disociación depende de la línea celular.</li>
	<li>Agregue 1 ml del medio PSC suplementado con 2 μM de Thiaz (medio PSC + Thiaz) al pozo y golpee suavemente la placa para inducir el desprendimiento celular. Pipetear las células desprendidas en el medio 1-2 veces para romper cualquier colonia grande, y resuspendir las células en el medio PSC + Thiaz en una proporción de 1: 6 pocillos (células de 1 pozo resuspendido en 12 ml de medio de cultivo). Reponga las células en los pozos recubiertos de BM-ECM.</li>
</ol>2. Generación de organoides cardíacos humanos autoensamblables en 3D
<ol><li>Formación del cuerpo embrioide (EB): NOTA: Es imperativo limitar las células diferenciadas observables antes de la formación del cuerpo embrionario. Dos o tres pocillos de una placa de 6 pocillos con una confluencia del 60-80% producirán suficientes células para una sola placa de organoides de 96 pocillos. Todos los medios deben alicitarse y calentarse en un baño de agua o cuenta de 37 ° C antes de cualquier cambio de medio para minimizar el choque de temperatura en los EB u organoides (esto no incluye los reactivos de disociación celular). Véase la Figura 1A,B.<ol>
<li>Día -2<ol>
<li>Para crear EB, en el día -2, lave las hPSC subconfluentes (60-80% confluentes) con DPBS durante al menos 10 s para lavar cualquier residuo celular y aspirar el DPBS.</li>
			<li>Para separar las células y liberarlas en un estado de una sola celda, agregue 1 ml de reactivo de disociación celular a temperatura ambiente (consulte la Tabla de materiales) a cada pozo durante 3-6 min. Golpee suavemente la placa ~ 5 veces cada minuto para inducir el desprendimiento mientras revisa bajo el microscopio. Agregue 1 ml de medio PSC + Thiaz para detener la reacción.</li>
			<li>Para recolectar las células y romper los agregados restantes, pipetee los medios hacia arriba y hacia abajo en el pozo 2-3 veces para generar una suspensión de una sola célula. Transfiera la suspensión unicelular a un tubo de centrífuga y gire durante 5 min a 300 × g.</li>
			<li>Para obtener la concentración celular deseada, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 1 ml de medio PSC +Thiaz. Cuente las células usando un contador celular o hemocitómetro y diluya las células en medio PSC + Thiaz a una concentración de 100,000 células / ml.</li>
			<li>Para distribuir las células para la formación de EB, use una pipeta multicanal para agregar 100 μL (10,000 celdas) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fijación ultra baja de fondo redondo. Centrifugar la placa a 100 × g durante 3 min e incubar durante 24 h a 37 °C, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Día -1<ol>
<li>Retire cuidadosamente 50 μL de medio de cada pozo y agregue 200 μL de medio PSC fresco calentado a 37 ° C para lograr un volumen final de 250 μL por pozo. Incubar las células durante 24 h a 37 °C, 5% CO2. NOTA: Retire y agregue el medio con cuidado en el costado del pozo para evitar molestar a los EB en el fondo del pozo. Debido a la naturaleza delicada de los EB y el cultivo de suspensión, es necesario dejar un pequeño volumen de líquido en cada pozo al cambiar el medio para evitar molestar a los EB.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciación de organoides del corazón humano (hHO): NOTA: Todos los medios deben calentarse en un baño de agua o cuenta de 37 ° C antes de cualquier cambio de medio. Retire y agregue el medio con cuidado en el costado del pozo para evitar perturbar los organoides en desarrollo en el fondo del pozo. No se necesitan lavados entre los cambios de medios para minimizar la agitación y permitir la eliminación gradual de inhibidores y factores de crecimiento. Se utilizó RPMI con suplemento de B-27 al 2% (Tabla de Materiales) durante todo el protocolo de diferenciación. El suplemento de B-27 contiene insulina a menos que se especifique (sin insulina en los días 0-5). Ver Figura 1C.<ol>
<li>Día 0<ol>
<li>Para iniciar la diferenciación hacia un linaje mesodermo, retire 166 μL de medio de cada pozo (~2/3 del volumen total del pozo) y agregue 166 μL de RPMI 1640 que contenga suplemento de B-27 sin insulina, 6 μM CHIR99021, 1.875 ng/mL de proteína morfogenética ósea 4 (BMP4) y 1.5 ng/mL de Activina A para una concentración final de pozo de 4 μM CHIR99021, 1,25 ng/mL BMP4, y 1 ng/mL de Activina A. Incubar durante 24 h a 37 °C, 5% co2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Día 1<ol>
<li>Retire 166 μL de medio de cada pocillo y agregue 166 μL de RPMI 1640 fresco con suplemento de B-27 sin insulina. Incubar durante 24 h a 37 °C, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Día 2<ol>
<li>Para inducir la especificación del mesodermo cardíaco, retire 166 μL de medio de cada pocillo y agregue 166 μL de RPMI 1640 que contenga un suplemento de B-27 sin insulina y 3 μM Wnt-C59 para una concentración final de pozo de 2 μM Wnt-C59. Incubar durante 48 h a 37 °C, 5% de CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Día 4<ol>
<li>Retire 166 μL de medio de cada pocillo y agregue 166 μL de RPMI 1640 fresco con suplemento de B-27 sin insulina. Incubar durante 48 h a 37 °C, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Día 6<ol>
<li>Retire 166 μL de medio de cada pocillo y agregue 166 μL de RPMI 1640 con suplemento de B-27. Incubar durante 24 h a 37 °C, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Día 7<ol>
<li>Para inducir la diferenciación proepicárdica, retire 166 μL de medio de cada pocillo y agregue 166 μL de RPMI 1640 fresco que contenga suplemento de B-27 y 3 μM de CHIR99021 para una concentración final de pozo de 2 μM de CHIR99021. Incubar durante 1 h a 37 °C, 5% CO2.</li>
			<li>Retire 166 μL de medio de cada pocillo y agregue 166 μL de suplemento fresco de RPMI 1640 que contenga B-27. Incubar durante 48 h a 37 °C, 5% CO2. NOTA: Se recomienda precaución adicional en este segundo cambio medio en el día 7, ya que los organoides son más propensos al movimiento debido a los cambios en los medios.</li>
			<li>Desde el día 7 en adelante hasta la recolección o transferencia para análisis o experimentación, realizar cambios de medio cada 48 h retirando 166 μL de medio de cada pozo y agregar 166 μL de RPMI 1640 fresco que contenga suplemento de B-27. NOTA: Los organoides están listos para análisis y experimentación en el día 15, a menos que las etapas de desarrollo más tempranas sean de interés. Se pueden cultivar más allá del día 15 para cultivos a largo plazo o experimentos de maduración.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análisis organoide
<ol><li>Transferencia de organoides enteros (vivos o fijos) NOTA: Para la transferencia de organoides vivos, asegúrese de que las puntas de pipeta utilizadas sean estériles.<ol>
<li>Corte la punta de una punta de pipeta P200 de 5-10 mm de la abertura de la punta, lo que resulta en una abertura ancha de ~ 2-3 mm de diámetro.</li>
		<li>Inserte la punta directamente en el pozo de fondo redondo que contiene el organoide para que la pipeta sea completamente vertical (perpendicular a la placa). Asegúrese de que el émbolo de pipeta ya esté presionado todo el camino antes de insertar la punta en el medio.</li>
		<li>Suelte lentamente el émbolo de pipeta, ocupando suficiente medio (100-200 μL) para recoger el organoide.</li>
		<li>Transfiera el organoide en el medio al destino objetivo (por ejemplo, para fijación, imágenes en vivo, registro de electrofisiología, nuevo cultivo de placas).</li>
	</ol></li>
	<li>Fijación de organoides NOTA: La fijación y tinción de organoides se puede hacer en la placa de cultivo de 96 pocillos o en los tubos de la microcentrífuga. El paraformaldehído (PFA) debe manipularse solo en una campana extractora de humos.<ol>
<li>Para la fijación en tubos de microcentrífuga, transfiera organoides vivos a tubos separados con 1-8 organoides por tubo. NOTA: No exceda de 8 organoides por tubo.</li>
		<li>Retire con cuidado y deseche la mayor cantidad posible de medio del tubo sin tocar los organoides.</li>
		<li>Agregue 4% de PFA a cada tubo o pozo (300-400 μL por tubo de microcentrífuga y 100-200 μL por pocillo de una placa de 96 pocillos). Incubar a temperatura ambiente durante 30-45 min. NOTA: Los tiempos de incubación superiores a 1 h pueden requerir pasos de recuperación de antígenos y no se recomiendan.</li>
		<li>Deseche de forma segura el PFA sin perturbar los organoides. Realizar 3 lavados con DPBS suplementados con 1,5 g/L de glicina (DPBS/Gly), utilizando el mismo volumen utilizado para el 4% de PFA, esperando 5 min entre lavados. Retire DPBS/Gly y proceda a la inmunotinción u otros análisis o agregue DPBS y guárdelo a 4 °C para su uso futuro durante un máximo de 2 semanas. NOTA: Almacenar organoides fijos por más de 2 semanas puede resultar en degradación y contaminación de los tejidos y no se recomienda.</li>
	</ol></li>
	<li>Tinción inmunofluorescente de montaje completo<ol>
<li>Añadir 100 μL de solución de bloqueo/permeabilización (10% de suero normal de burro + 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) + 0,5% de Tritón X-100 en 1x DPBS) a cada pocillo o tubo que contenga los organoides fijos. Incubar a temperatura ambiente durante la noche en una coctelera. NOTA: No exceda de 8 organoides por tubo.</li>
		<li>Retire con cuidado y deseche la mayor cantidad posible de la solución de bloqueo sin tocar los organoides. Realice 3 lavados con DPBS, esperando 5 minutos entre lavados.</li>
		<li>Preparar la solución primaria de anticuerpos (1% de suero normal de burro + 0,5% de BSA + 0,5% de Tritón X-100 en 1x DPBS) con los anticuerpos primarios deseados a las concentraciones recomendadas. Incubar a 4 °C durante 24 h en una coctelera.</li>
		<li>Retire con cuidado y deseche la mayor cantidad posible de la solución de anticuerpos sin tocar los organoides. Realice 3 lavados con DPBS, esperando 5 minutos entre lavados.</li>
		<li>Preparar una solución secundaria de anticuerpos (1% de suero normal de burro + 0,5% de BSA + 0,5% de Tritón X-100 en 1x DPBS) con los anticuerpos secundarios deseados a las concentraciones recomendadas. Si los anticuerpos están marcados fluorescentemente, incube a 4 °C en la oscuridad (por ejemplo, cubierto de papel de aluminio) durante 24 horas en un agitador.</li>
		<li>Retire con cuidado y deseche la mayor cantidad posible de la solución de anticuerpos sin tocar los organoides. Realice 3 lavados con DPBS, esperando 5 minutos entre lavados.</li>
		<li>Prepare diapositivas con perlas (90-300 μm de diámetro) montadas en un medio de montaje (consulte la Tabla de materiales) cerca de los bordes de la diapositiva donde se colocará el deslizamiento con los organoides. NOTA: Se recomienda permitir que el medio de montaje alrededor de las perlas se seque antes de continuar; esto evitará que las cuentas se muevan. Ver Figura 2.</li>
		<li>Transfiera los organoides teñidos usando una punta de pipeta cortada a la diapositiva, entre las cuentas, asegurando el espaciado para evitar el contacto entre los organoides una vez en la diapositiva. Use la esquina de una toallita de laboratorio enrollada para eliminar cuidadosamente el exceso de líquido alrededor del organoide.</li>
		<li>Cubra los organoides con medio de montaje-limpieza (la solución de limpieza de fructosa-glicerol es de 60% (vol/vol) de glicerol y 2,5 M de fructosa)37 utilizando 120-150 μL del medio de montaje-limpieza por portaobjetos. NOTA: Se recomienda utilizar una punta de pipeta cortada cuando se trabaje con el medio de montaje-limpieza, ya que es muy viscoso.</li>
		<li>Coloque el cubrehojas sobre la diapositiva con los organoides cubiertos con una solución de montaje-despeje y presione lentamente el deslizamiento sobre la diapositiva, asegurándose de que los organoides estén entre las cuentas montadas.</li>
		<li>Selle el perímetro de la cubierta en la corredera con barniz de uñas de capa superior. Deje que el tobogán se seque en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 h. Conservar a 4 °C en la oscuridad para su almacenamiento a largo plazo.</li>
	</ol></li>
	<li>Imágenes transitorias de calcio en organoides del corazón vivo NOTA: De acuerdo con las instrucciones del fabricante, Fluo4-AM se reconstituyó en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración final de solución madre de 0,5 mM. Fluo4-AM se agregó directamente al pozo organoide en la placa de 96 pocillos.<ol>
<li>Realice 2 lavados en los organoides utilizando el medio RPMI 1640.<ol>
<li>Retire 166 μL del medio gastado del pozo.</li>
			<li>Agregue 166 μL de medio RPMI 1640 calentado, retire 166 μL de medio y agregue 166 μL de medio RPMI 1640 fresco. NOTA: Los lavados se realizan para eliminar el material de desecho y los desechos celulares. Dos tercios del medio se retiran de los pocillos durante los lavados para evitar perturbar los organoides en el fondo del pozo antes del ensayo funcional.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Agregue el medio Fluo4-AM a los organoides.<ol>
<li>Agregue Fluo4-AM reconstituido en DMSO a RPMI 1640 que contiene suplemento de B-27 para preparar una solución de 1,5 μM.</li>
			<li>Retire 166 μL de medio del pozo.</li>
			<li>Añadir 166 μL de 1,5 μM De Fluo4-AM en el suplemento DE RPMI 1640 que contiene B-27 para una concentración final de pozo de 1 μM. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 30 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realice 2 lavados como en el paso 3.4.1.</li>
		<li>Agregue 166 μL de RPMI 1640 que contiene suplemento de B-27 al pozo.</li>
		<li>Usando una punta cortada de una punta de pipeta P200, transfiera el organoide a una placa de Petri con fondo de vidrio (por ejemplo, vidrio de cubierta con cámara de 8 pocillos con vidrio de cubierta de alto rendimiento # 1.5) con 100-200 μL de medio. NOTA: Ver sección 3.1 sobre la transferencia de organoides enteros.</li>
		<li>Imagen de los organoides que viven bajo un microscopio con una cámara controlada por temperatura y CO2 a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		<li>Grabe varios videos de 10-20 s en varios lugares del organoide, mostrando el aumento y la disminución de los niveles de intensidad de fluorescencia a medida que el calcio entra y sale de las células. NOTA: Para grabaciones de alta resolución, se recomienda grabar a una velocidad de 10 fps o más rápida; Se recomiendan 50 fps.</li>
		<li>Analice los videos utilizando un software de análisis de imágenes (por ejemplo, ImageJ) seleccionando regiones de interés y midiendo los niveles de intensidad a lo largo del tiempo.</li>
		<li>Normalice las grabaciones de intensidad usando ΔF/F0 vs. tiempo en milisegundos y gráfico.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Los recientes avances en cardiomiocitos derivados de células madre humanas y otras células de origen cardíaco se han utilizado para modelar el desarrollo del corazón humano22,24,25 y la enfermedad26,27,28 y como herramientas para detectar terapias29,30 y agentes <sup class="xref...

Los defectos cardíacos congénitos (CHD) son el tipo más común de defecto congénito en los seres humanos y afectan aproximadamente al 1% de todos los nacidos vivos1,2,3. En la mayoría de las circunstancias, las razones de los CHD siguen siendo desconocidas. La capacidad de crear modelos de corazón humano en el laboratorio que se asemejan mucho al corazón humano en desarrollo constituye un importante paso adelante para estudiar directamente las causas subyacentes de las enfermedades coronarias en humanos en lugar de en modelos animales sustitutos.
El epítome de los modelos de tejido cultivados en laboratorio son organoides, construcciones de células 3D que se asemejan a un órgano de interés en la composición celular y la función fisiológica. Los organoides a menudo se derivan de células madre o células progenitoras y se han utilizado con éxito para modelar muchos órganos como el cerebro4,5, el riñón6,7, el intestino8,9, el pulmón10,11, el hígado12,13 y el páncreas14,15 , solo por nombrar algunos. Han surgido estudios recientes que demuestran la viabilidad de crear organoides cardíacos autoensamblables para estudiar el desarrollo del corazón in vitro. Estos modelos incluyen el uso de células madre embrionarias de ratón (mESCs) para modelar el desarrollo cardíaco temprano16,17 hasta la especificación auriculoventricular18 y células madre pluripotentes humanas (hPSCs) para generar organoides cardíaco-endodermo de capa multigermes19 y cardioides con cámara20 con composición celular altamente compleja.
Este artículo presenta un novedoso protocolo de modulación WNT de 3 pasos para generar hHO altamente complejos de una manera eficiente y rentable. Los organoides se generan en placas de 96 pocillos, lo que resulta en un sistema escalable y de alto rendimiento que se puede automatizar fácilmente. Este método se basa en la creación de agregados de hPSC y desencadena los pasos de desarrollo de la cardiogénesis, incluida la formación de mesodermo y mesodermo cardíaco, la especificación del primer y segundo campo cardíaco, la formación de órganos proepicárdicos y la especificación auriculoventricular. Después de 15 días de diferenciación, los hHO contienen todos los linajes celulares principales que se encuentran en el corazón, cámaras internas bien definidas, cámaras auriculares y ventriculares, y una red vascular en todo el organoide. Este sistema organoide cardíaco altamente sofisticado y reproducible es susceptible de investigar análisis estructurales, funcionales, moleculares y transcriptómicos en el estudio del desarrollo cardíaco y las enfermedades, y la detección farmacológica.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Burro anti-ratón</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Burro anti-conejo</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Burro anti-ratón</td><td>Invitrogen</td><td>A-21203</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Burro anti-conejo</td><td>Invitrogen</td><td>A-21207</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Burro anticabra</td><td>Invitrogen</td><td>A32849</td><td>1:200</td></tr><tr><td>HAND1</td><td>Abcam</td><td>ab196622</td><td>Conejo; 1:200</td></tr><tr><td>HAND2</td><td>Abcam</td><td>ab200040</td><td>Conejo; 1:200</td></tr><tr><td>NFAT2</td><td>Abcam</td><td>ab25916</td><td>Conejo; 1:100</td></tr><tr><td>PECAM1</td><td>DSHB</td><td>P2B1</td><td>Conejo; 1:50</td></tr><tr><td>TNNT2</td><td>Abcam</td><td>ab8295</td><td>Ratón; 1:200</td></tr><tr><td>THY1</td><td>Abcam</td><td>ab133350</td><td>Conejo; 1:200</td></tr><tr><td>TJP1</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-19090</td><td>Cabra; 1:250</td></tr><tr><td>VIM</td><td>Abcam</td><td>ab11256</td><td>Cabra; 1:250</td></tr><tr><td>WT1</td><td>Abcam</td><td>ab89901</td><td>Conejo; 1:200</td></tr><tr><td>Medios y reactivos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>NC9464543</td><td>reactivo de disociación celular</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338AC010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (sin insulina)</td><td>Gibco</td><td>A1895601</td><td>suplemento de cultivo celular sin insulina</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504-044 suplemento para</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>Gibco</td><td>PHC9534</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Bioworld</td><td>50253966</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck</td><td>442310</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)-Fructosa</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Flex Medium Kit</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td>medio de células madre pluripotentes (PSC) que contiene 1% penicilina-estreptomicina</td></tr><tr><td>Fluo4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Millipore Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Millipore Sigma 410225</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR</td><td>Corning</td><td>CB40230</td><td>Matriz extracelular de membrana basal (BM-ECM)</td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Millipore Sigma</td><td>S30-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td>IC15014601 Polvo disuelto en tampón PBS &ndash; uso al 4%</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr> solución <tr><td>tampón de fosfato</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Solución tampón de fosfato (10x)</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas de poliperlas Polysciences</td><td>, Inc.</td><td>73155</td><td>90 y micro; m</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>NC0729236</td><td>reactivo de disociación para hPSCs</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Millipore Sigma</td><td>SML1045</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Solución Azul de Trypan</td><td>Gibco</td><td>1525006</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Vibrance Antifade Medio de montaje</td><td>Vector Laboratories</td><td>H170010</td><td></td></tr><tr><td>WNT-C59</td><td>Selleck</td><td>NC0710557</td><td></td></tr><tr><td>Otros</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>02682002</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubos Falcon Fisher</td><td>Scientific</td><td>1495970C</td><td></td></tr><tr><td>Viales criogénicos de 2 mL</td><td>Corning</td><td>13-700-500</td><td></td></tr><tr><td>Depósitos de reactivos de 50</td><td>mL Fisherbrand</td><td>13681502</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de fondo plano de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>0720083</td><td></td></tr><tr><td>8 Vidrio de cubierta con cámara de pozo # 1.5 Vidrio de cobertura de alto rendimiento</td><td>Cellvis</td><td>C8-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas de fijación ultra baja transparentes de 96 pocillos</td><td>Costar</td><td>07201680</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Image software de procesamiento</td></tr><tr><td></td><td>Kimwipes Kimberly-Clark Professional</td><td>06-666</td><td>toallitas de laboratorio</td></tr><tr><td>Micro Cover Glass</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td>24 x 50 mm Nº 1.5</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Moxi Cell Counter</td><td>Orflo Technologies</td><td>&nbsp; MXZ001</td><td></td></tr><tr><td>Moxi Z Cell Count Cassette &ndash; Tipo M</td><td>Orflo&nbsp; Tecnologías</td><td>MXC001</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas multicanal</td><td>Fisherbrand</td><td>FBE1200300</td><td>30-300 &micro; L</td></tr><tr><td>Olympus cellVivo</td><td>Olympus</td><td></td><td>Para Caclium Imagen, análisis con Imagej</td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall Legend X1 ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>75004261</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-687-717</td><td></td></tr><tr><td>Top Coat Nail Varish</td><td>Seche Vite</td><td></td><td>Se puede comprar en cualquier supermercado</td></tr></tbody></table>

generación de organoides del corazón humano autoensamblables derivados de células madre pluripotentes

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

La capacidad de estudiar el desarrollo cardíaco humano en la salud y la enfermedad está muy limitada por la capacidad de modelar la complejidad del corazón humano in vitro. El desarrollo de plataformas similares a órganos más eficientes que puedan modelar fenotipos complejos in vivo , como organoides y órganos en un chip, mejorará la capacidad de estudiar el desarrollo y la enfermedad del corazón humano. Este artículo describe un protocolo para generar organoides cardíacos humanos (hHO) altamente complejos mediante la autoorganización utilizando células madre pluripotentes humanas y la activación gradual de la vía de desarrollo utilizando inhibidores de moléculas pequeñas. Los cuerpos embrionarios (EB) se generan en una placa de 96 pocillos con pocillos de fijación ultra bajos de fondo redondo, lo que facilita el cultivo en suspensión de construcciones individualizadas.
Los EB se diferencian en hHO mediante una estrategia de modulación de señalización Wnt de tres pasos, que implica una activación inicial de la vía Wnt para inducir el destino del mesodermo cardíaco, un segundo paso de inhibición Wnt para crear linajes cardíacos definitivos y un tercer paso de activación Wnt para inducir tejidos de órganos proepicárdicos. Estos pasos, llevados a cabo en un formato de 96 pocillos, son altamente eficientes, reproducibles y producen grandes cantidades de organoides por tirada. El análisis por imágenes de inmunofluorescencia del día 3 al día 11 de la diferenciación revela especificaciones del primer y segundo campo cardíaco y tejidos altamente complejos dentro de hHOs en el día 15, incluido el tejido miocárdico con regiones de cardiomiocitos auriculares y ventriculares, así como cámaras internas revestidas con tejido endocárdico. Los organoides también exhiben una intrincada red vascular en toda la estructura y un revestimiento externo de tejido epicárdico. Desde un punto de vista funcional, los hHO superan con fuerza y presentan una actividad normal del calcio según lo determinado por las imágenes en vivo de Fluo-4. En general, este protocolo constituye una plataforma sólida para estudios in vitro en tejidos cardíacos similares a órganos humanos.

Para lograr la hHO autoorganizada in vitro, modificamos y combinamos los protocolos de diferenciación previamente descritos para la diferenciación monocapa 2D de cardiomiocitos21 y células epicárdicas22 utilizando moduladores de la vía Wnt y para organoides precardíacos 3D16 utilizando los factores de crecimiento BMP4 y Activina A. Utilizando el protocolo de diferenciación EB y hHO de placa de 96 pocillos descrito aquí y mostrado en <strong ...

Aquí, describimos un protocolo para crear organoides cardíacos humanos (hHO) relevantes para el desarrollo de manera eficiente utilizando células madre pluripotentes humanas por autoorganización. El protocolo se basa en la activación secuencial de señales de desarrollo y produce tejidos cardíacos humanos altamente complejos y funcionalmente relevantes.

Generación de organoides del corazón humano autoensamblables derivados de células madre pluripotentes

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

Este protocolo nos permite crear una estructura 3D compleja que se asemeja mucho al corazón humano en desarrollo de una manera simple y rentable, que es reproducible a través de líneas celulares. Consiste en un único protocolo con tres pasos de diferenciación, que da lugar a todos los tipos celulares del corazón, incluyendo cámaras y una red vascular. Esta técnica nos permite modelar una amplia gama de enfermedades cardiovasculares humanas y detectar tratamientos farmacológicos efectivos.Gracias a la naturaleza de alto rendimiento de su diseño. Este método es útil para investigar el corazón humano en desarrollo, así como las enfermedades comúnmente asociadas con él. Uno de ellos son los defectos cardíacos congénitos.Este protocolo requiere habilidades básicas de cultivo celular. Recomendamos pipeteos atentos y delicados, así como un manejo suave de los organoides. Comience creando cuerpos embrioides o EB dos días antes de la diferenciación.Lave los HPSC subconfluentes con DBPS durante al menos 10 segundos. A continuación, aspire el DPBS. Agregue un mililitro de ACUTA a temperatura ambiente y golpee suavemente la placa aproximadamente cinco veces cada minuto durante tres a cinco minutos para inducir el desprendimiento, mientras se verifica bajo el microscopio.Luego agregue un mililitro de medio PSC y Thias Avin o Thias para detener la reacción. Pipetear los medios hacia arriba y hacia abajo en el pozo, dos o tres veces para generar una suspensión de una sola célula y recolectar las células. Luego transfiera la suspensión de una sola célula a un tubo de centrífuga y gire durante cinco minutos a 300 veces G.Aspire el sobrenadante y vuelva a gastar las células en un mililitro de medio PSC y Thias.Diluir las células en DPBS. Cuente las células usando un contador celular o un hemocisómetro y diluya las células en medio PSC con Thias a una concentración de 100, 000 células por mililitro. Agregue 100 microlitros de suspensión de células diluidas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fijación ultra baja de fondo redondo.Centrifugar la placa a 100 veces G durante tres minutos e incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas, retire cuidadosamente 50 microlitros de medio de cada pozo y agregue 200 camadas de núcleo de medio PSC fresco, caliente a 37 grados Celsius para un volumen de 250 microlitros por pozo. Incubar las células durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Retire 166 microlitros o dos tercios de medio de un lado de cada pozo, y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 que contengan suplemento de B27 sin insulina, seis 990211 de alegría micromolar, 0.875 nanogramos por mililitro de proteína morfogenética ósea cuatro y 1.5 nanogramos por mililitro de Activina A.Incube durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas retire 166 microlitros de medio de un lado de cada pocillo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 fresco con suplemento de B27 sin insulina. Incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Para inducir la especificación del mesodermo cardíaco en el segundo día, retire 166 microlitros de medio de cada pozo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640, que contengan suplemento de B27 sin insulina y tres micromolares Wnt-C59 y continúe la incubación durante 48 horas. En el cuarto día, retire 166 microlitros de medio de cada pozo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 fresco con suplemento de B27 sin insulina, luego incube otras 48 horas. En el sexto día, retire 166 microlitros de medio de cada pozo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 con suplemento de B27.Para este y todos los cambios de medios posteriores, use suplemento de B27 con insulina, incube durante otras 24 horas. En el séptimo día, el cultivo celular está listo para la diferenciación pro epicárdica. Retire 166 microlitros de medio de cada pocillo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 fresco que contenga suplemento de B27 y tres micromolares cheer 99021.Luego, en incubar durante una hora, después de una hora retire la placa de la incubadora, retire 166 microlitros de medio de un lado de cada pozo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 fresco que contenga suplemento de B27 continúe la incubación durante otras 48 horas. Repite este proceso cada 48 horas hasta la recogida. Los organoides están listos para análisis y experimentación el día 15 Para transferir los organoides completos, corte la punta de una pipeta P200, de cinco a 10 milímetros de la abertura con un diámetro de aproximadamente dos a tres milímetros.Presione el émbolo de pipeta e inserte la punta verticalmente en el pozo inferior redondo con el organoide. Tome aproximadamente de 100 a 200 microlitros de medio suficiente para recolectar los organoides y transferirlos al destino objetivo. Antes de que la EBS de diferenciación aparezca como masas esféricas negras, el proceso de diferenciación comienza en el día cero con una activación de la vía Wnt y la adición del factor de crecimiento durante exactamente 24 horas.Además, la edición de Wnt C59 en el segundo día da como resultado un agrandamiento del organoide de aproximadamente 200 micrómetros a un máximo de un milímetro. Los organoides del corazón humano comenzaron a latir tan pronto como el día seis y el 100% de los organoides mostraron latidos visibles en el día 10. Las imágenes de alto aumento del organoide del día siete revelaron que la mayoría de las células que expresaban la mano uno eran de origen cardiomiótico y la mano dos eran células no miositas de segunda células progenitoras del campo cardíaco.Las transcripciones de ARN tanto para la mano uno como para la mano dos se expresaron a partir del tercer día en los datos de secuenciación de ARN. Los marcadores FHF se expresaron altamente durante los días tres y 11, mientras que el marcador SF se expresó más altamente después del día 13. La tinción de inmunofluorescencia reveló la presencia de varios linajes de tipo de células cardíacas humanas que componen el corazón humano.Como el tejido miocárdico y epicárdico, las células endocárdicas, las células endoteliales y los fibroblastos cardíacos. Los marcadores que expresan los linajes celulares anteriores también se observaron en los perfiles de expresión del gen RNA SAC. Se utilizaron imágenes de calcio vivo de células individuales en organoides enteros para medir la función electrofisiológica de los organoides.La intensidad de la fluorescencia fluo-4 varió con el tiempo debido a la salida de entrada de calcio de la célula que revela potenciales de acción regulares. Los mapas de calor que muestran las intensidades de calcio sobre una región de alto aumento del organoide, muestran una mayor intensidad debido a los transitorios de calcio y las células individuales. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que los EB y los organoides posteriores no están unidos a la parte inferior de la placa, y nos moveremos con la eliminación además de los medios que requieren cambios de medios atentos.Los organoides pueden ser cultivados durante períodos de tiempo más largos introducidos en las técnicas de maduración, o incluso expuestos a estímulos externos, como el acondicionamiento mecánico o eléctrico, e incluso a factores estresantes como las toxinas. Esta técnica permite el acceso a etapas del desarrollo del corazón fetal humano que de otro modo serían inaccesibles en la investigación, allanando el camino para nuevos conocimientos sobre el desarrollo del corazón y la etiología de la enfermedad.

generating-self-assembling-human-heart-organoids-derived-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este video describe la creación de organoides de tipo prosencéfalo a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs), demostrando la progresión de agregados de células madre a estructuras complejas que imitan la corteza del cerebro y se diferencian en varios tipos de neuronas.

Generación de organoides cerebrales de tipo prosencéfalo a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Aquí describimos un método escalable, con una simple combinación de activina A y mediada por el lentivirus Id1-sobreexpresión, para generar progenitores cardiacos primera de corazón como campo y ventricular como cardiomiocitos desde células madre humanas pluripotentes.

Generación del primer corazón campo-como progenitores cardiaca y Ventricular como cardiomiocitos desde células madre humanas pluripotentes

Este protocolo se generó como un medio para producir organoides cerebrales de una manera simplificada y de bajo costo sin factores de crecimiento exógenos o matriz de membrana de sótano sin dejar de mantener la diversidad de tipos de células cerebrales y muchas características de la organización celular.

Un método autodirigido estático para generar organoides cerebrales a partir de células madre embrionarias humanas

Aquí describimos un protocolo para generar organoides renales a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Este protocolo genera organoides renales en dos semanas. Los organoides renales resultantes se pueden cultivar en matraces giratorios a gran escala o placas de agitación magnética de múltiples pozos para enfoques paralelos de prueba de drogas.

Un método simplificado para generar organoides renales a partir de células madre pluripotentes humanas

El objetivo de este protocolo es explicar y demostrar el desarrollo de un modelo microfluídico tridimensional (3D) de tejido cardíaco humano altamente alineado, compuesto por cardiomiocitos derivados de células madre co-cultivados con fibroblastos cardíacos (CF) dentro de un hidrogel biomimético a base de colágeno, para aplicaciones en ingeniería de tejido cardíaco, detección de fármacos y modelado de enfermedades.

Desarrollo de tejido cardíaco humano organizado en 3D dentro de una plataforma microfluídica

Aquí se presenta un conjunto de protocolos para la generación y criopreservación de esferoides cardíacos (CS) a partir de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos cultivados en un formato multidimensional de alto rendimiento. Este modelo tridimensional funciona como una plataforma robusta para el modelado de enfermedades, exámenes de detección de alto rendimiento y mantiene su funcionalidad después de la criopreservación.

Generación, detección de alto rendimiento y biobancos de esferoides cardíacos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos

Este protocolo describe la generación de vasos sanguíneos autoorganizados a partir de células madre pluripotentes humanas y pluripotentes inducidas. Estas redes de vasos sanguíneos exhiben una red endotelial extensa y conectada rodeada de pericitos, actina del músculo liso y una membrana basal continua.

Generación de organoides de vasos sanguíneos humanos a partir de células madre pluripotentes

Este protocolo presenta un método para generar organoides vasculares utilizando células madre pluripotentes humanas.

Generación de organoides vasculares a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Los organoides cardíacos humanos autoensamblantes (hCOs) son un sistema emergente para modelar el desarrollo y las enfermedades cardíacas humanas. Aquí se proporciona una metodología para generar y dañar hCOs mediante hipoxia-reoxigenación y detalles de los resultados histológicos y funcionales esperados tras la lesión.

Un modelo de lesión por hipoxia-reoxigenación en cardioides humanos autoensamblantes

Aquí se describe protocolos para romper las células de mamíferos por molienda en estado sólido a una temperatura criogénica, producir un extracto celular a partir del polvo de células resultante, y aislar los complejos de proteínas de interés por captura de afinidad sobre perlas paramagnéticas a escala micrométrica de anticuerpos acoplados.

Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

Aprende a generar organoides cardíacos humanos autoensamblables a partir de células madre pluripotentes. Este protocolo de tres pasos permite modelar enfermedades cardiovasculares y realizar cribado farmacológico de alta eficiencia.

Generación de organoides del corazón humano autoensamblables derivados de células madre pluripotentes

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