Name: Aislamiento de células endoteliales de la luz de arterias carótidas de ratón para experimentos multiómicos unicelulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprende a aislar células endoteliales de arterias carótidas de ratón para análisis multiómicos unicelulares. Este método permite estudiar respuestas al flujo sanguíneo alterado y vías moleculares en aterosclerosis.

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Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud subvenciones HL119798, HL095070 y HL139757 a HJ. HJ también cuenta con el apoyo de la cátedra Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chairship. Los servicios prestados por el Emory Integrated Genomics Core (EIGC) fueron subvencionados por la Facultad de Medicina de la Universidad de Emory y también fueron apoyados en parte por la Alianza de Ciencias Clínicas y Traslacionales de Georgia de los Institutos Nacionales de Salud bajo el premio No. UL1TR002378. El contenido proporcionado anteriormente es responsabilidad exclusiva de los autores y no refleja las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Todos los procedimientos con animales descritos a continuación fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Emory. Se utilizaron ratones C57BL / 6 no hipercolesterolémicos, emparejados por edad y sexo para mitigar la variación dependiente del sexo y compensar cualquier complicación de las afecciones hipercolesterolémicas.
1. Cirugía de ligadura carotídea parcial (LCP)
NOTA: La ligadura parcial de la arteria carótida de LCA se llevó a cabo como se describió y demostró anteriormente3.
<ol><li>Anestesiar al ratón por inhalación de isoflurano (5% de isofluorano en oxígeno para la inducción y 1,5% después de eso para el mantenimiento) durante todo el procedimiento utilizando un vaporizador anestésico. Coloque el ratón en decúbito supino sobre una almohadilla isotérmica Deltaphase para evitar la pérdida de calor corporal durante la cirugía.</li>
	<li>Aplique un ungüento ocular para prevenir la exposición a la queratitis y confirme la profundidad de la anestesia por la ausencia de respuesta de pellizco del dedo del pie.</li>
	<li>Inyecte buprenorfina 0,05 mg/kg por vía subcutánea para controlar el dolor de forma preventiva. Desinfecte el área depilada aplicando y limpiando con betadina e isopropanol solución tres veces. Asegúrese de que betadine sea el último paso para esterilizar el área de la cirugía, comenzando desde el centro y terminando por los lados.</li>
	<li>Usando técnicas asépticas, haga una incisión ventral en la línea media (~ 1 cm) en la región del cuello y exponga el punto de ramificación de LCA mediante disección roma.</li>
	<li>Ligate las arterias carótida interna izquierda, carótida externa y occipital con sutura de seda 6-0; Deje intacta la arteria tiroidea superior.</li>
	<li>Aproximar la piel y cerrar la incisión con pegamento de tejido y/o suturas.</li>
	<li>Transfiera el ratón a una jaula de recuperación precalentada (mantenida a 37 °C) y colóquelo sobre una toalla limpia durante un máximo de 1 h para evitar la hipotermia postoperatoria. NOTA: En nuestra experiencia, una dosis única preventiva de buprenorfina (0,05 mg/kg) suele ser suficiente para el manejo del dolor postoperatorio. Se puede administrar una dosis repetida de buprenorfina si el animal está en peligro después de las primeras 24 horas. Si se realiza correctamente, no hay mortalidad asociada con este procedimiento, y el estrés postoperatorio para el ratón es mínimo. Los ratones son devueltos a sus respectivas jaulas y monitoreados diariamente después de la cirugía.</li>
	<li>Prepare la configuración de perfusión.<ol><li>Use NaCl al 0,9% (solución salina normal) que contenga 10 U/ml de heparina en una bolsa intravenosa. Enganche la bolsa intravenosa a 244-274 cm (8-9 pies) del suelo o aproximadamente 122-152 cm (4-5 pies) más alta que la tabla de disección. Coloque la aguja de mariposa en el extremo de la línea salina y elimine cualquier burbuja de aire de la línea IV.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Aislamiento de las arterias carótidas después del sacrificio
<ol><li>Sacrificar los ratones por inhalación deCO2 siguiendo el protocolo institucional IACUC.</li>
	<li>Rocíe etanol al 70% sobre la piel del ratón y colóquelo en posición supina en la tabla de disección que contiene toallas de papel adsorbentes. Asegure las patas del ratón a las toallas adsorbentes en la tabla de disección con cinta adhesiva o una aguja de 21 G.</li>
	<li>Usando un par de tijeras estériles, retire la piel del ratón comenzando desde el abdomen hasta la parte superior del tórax.</li>
	<li>Use un par de tijeras para abrir la pared abdominal debajo de la caja torácica mediante disección roma.</li>
	<li>Usando las tijeras, haga cuidadosamente una incisión a lo largo del diafragma y continúe a través de las costillas a ambos lados del tórax hasta que se pueda levantar el esternón. Levante suavemente el esternón con un par de fórceps; Después de eso, retire la caja torácica para exponer el corazón.</li>
	<li>Retire con cuidado el timo y cualquier tejido conectivo sobre el corazón para visualizar los vasos principales.</li>
	<li>Cortar la vena cava con tijeras para permitir que la sangre salga de la circulación cerrada.</li>
	<li>Inserte una aguja de mariposa de 21 G conectada a la línea IV a través del ápice del corazón hacia el ventrículo izquierdo y permita la perfusión retrógrada durante 2-3 minutos con solución salina normal a temperatura ambiente. Asegúrese de que se mantenga un caudal constante de solución salina normal manteniendo la bolsa salina a una altura de 8-9 pies del suelo. NOTA: Los pulmones y el hígado se vuelven pálidos, lo que indica una perfusión óptima. Se utilizan aproximadamente 20 ml de tampón de perfusión para cada ratón.</li>
	<li>Retire la piel de la región del cuello y retire toda la grasa, los músculos y los tejidos conectivos para exponer las arterias carótidas (Figura 1A). NOTA: El resto del procedimiento se lleva a cabo bajo el microscopio de disección.</li>
	<li>Ajuste el campo de visión para localizar los sitios de ligadura. Usando las tijeras de microdisección de 10 mm, haga una pequeña incisión debajo del sitio de ligadura en el LCA para permitir la perfusión.</li>
	<li>Perfundir de nuevo durante 1 minuto adicional a través del ventrículo izquierdo y asegúrese de que el LCA esté bien perfundido y libre de cualquier rastro visible de sangre.</li>
	<li>Use pinzas de punta fina y tijeras de resorte pequeñas para eliminar cuidadosamente los tejidos periadventicios que rodean las carótidas mientras la carótida está unida al cuerpo. NOTA: Tenga mucho cuidado de no apretar o estirar las arterias carótidas durante este paso de limpieza, ya que esto puede aumentar el número de células no viables. Si se realiza correctamente, la viabilidad celular en la suspensión celular final suele ser del >93%.</li>
</ol>3. Aislamiento unicelular enriquecido con células endoteliales de ratones carotídeos
NOTA: Los reactivos descritos a continuación pueden prepararse previamente y almacenarse a 4 °C hasta su uso: tampones de lisis de un solo núcleo 1x y 0,1x con los reactivos enumerados en la Tabla 1; tampón de lavado de un solo núcleo con los reactivos enumerados en la tabla 1; receta de tampón de núcleos de un solo núcleo con los reactivos enumerados en la Tabla 1. Las existencias de explotación de estos colchones deben prepararse siguiendo el protocolo del fabricante. Composición del tampón digestivo: colagenasa tipo II 600 U/mL y DNasa I 60 U/mL en suero bovino fetal al 0,5% (FBS) que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS).
<ol><li>Mientras las carótidas todavía están unidas, lave el exterior de las arterias carótidas con solución salina normal para eliminar cualquier rastro de sangre.</li>
	<li>Usando una jeringa de insulina equipada con una aguja de 29 G, inyecte ~ 50 μL del tampón de digestión en el lumen del extremo distal de la arteria carótida izquierda. A medida que el tampón de digestión comienza a llenar la arteria carótida, sujete el extremo proximal de la carótida con un microclip (Figura 1B). Introduzca 15-20 μL adicionales de tampón de digestión en el lumen y recorte el extremo distal para evitar la liberación del tampón de digestión.</li>
	<li>Explantar cuidadosamente las arterias carótidas del ratón (Figura 1B,C) y colocarlas en platos de 35 mm que contengan solución salina tamponada con Hepes tibia (a 37 °C). NOTA: Asegúrese de que ambas abrazaderas estén bien colocadas. Si la pinza se afloja, la solución de digestión puede salir de la luz y afectar el recuento de células obtenidas. Si esto sucede, agregue una solución enzimática adicional utilizando una jeringa de insulina equipada con una aguja de 29 G desde el extremo abierto de la carótida y vuelva a asegurar la pinza (Figura 1D). Si la solución tampón enzimática vuelve a filtrarse, es probable que la carótida se corte durante el proceso de explantación. En este caso, descartar la carótida y excluir la muestra del estudio. El manejo brusco repetido de la carótida disminuirá la viabilidad celular y la calidad de la preparación de una sola célula. Tenga cuidado de identificar y etiquetar correctamente las arterias carótidas izquierda y derecha.</li>
	<li>Incubar las carótidas explantadas durante 45 min a 37 °C con balanceo intermitente.</li>
</ol>4. Lavado de las arterias carótidas
<ol><li>Después de completar la digestión enzimática luminal, retire la arteria carótida junto con las pinzas del plato de 35 mm. Retire cuidadosamente cada pinza, teniendo cuidado de que el tampón de digestión no tenga fugas.</li>
	<li>Sostenga suavemente un extremo de la arteria carótida con fórceps finos sobre un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Insertar una aguja de 29 G equipada con una jeringa de insulina que contenga 100 μL de tampón de digestión caliente (37 °C) en el lumen con la otra mano (Figura 1D).</li>
	<li>Enjuague rápidamente la luz de la carótida en el tubo de microcentrífuga. Bloquee la reacción enzimática agregando 0.3 ml de FBS en el tubo de 1.5 ml. Coloque el tubo sobre hielo. NOTA: El lavado contiene las células de la digestión enzimática luminal. Agregar FBS y reducir la temperatura detiene el proceso de digestión enzimática. Si el número de células en la preparación es alto y contiene desechos o tejido graso, se recomienda encarecidamente el uso de un filtro de células de 50 o 70 μm para filtrar los restos de tejidos no deseados. Para aumentar el recuento de células individuales, se recomienda enjuagar varias carótidas. Aquí, para obtener al menos 5.000 células, se enjuagaron entre 10 y 12 carótidas y se agruparon como una muestra.</li>
	<li>Centrifugar las células a 500 × g durante 5 min a 4 °C utilizando una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo (véase la tabla de materiales).</li>
	<li>Desechar el sobrenadante y resuspender la gránula celular en un tampón de digestión que contenga el reactivo de disociación celular (ver la Tabla de materiales) durante 5 min a 37 °C para separar todas las células en células individuales. NOTA: Si el número de celdas en la preparación es bajo, aumente la velocidad de la centrífuga hasta 2,000-3,000 × g para girar las celdas. Además, el uso de tubos centrífugos de 0,5 ml facilita una mejor visualización del pellet celular en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Bloquee la reacción enzimática agregando 0.15 ml de FBS en el tubo de 0.5 ml.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión unicelular a 500 × g durante 5 min a 4 °C utilizando una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo, como en el paso 4.4.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 100 μL de solución de albúmina sérica bovina (BSA) helada al 1% en PBS en un tubo de microcentrífuga de 0,2 ml. NOTA: El uso de tubos centrífugos de 0,2 ml mejora la visualización del pellet de una sola célula en la parte inferior del tubo.</li>
</ol>5. Análisis de una sola célula y de un solo núcleo
<ol><li>Resuspender y enviar la preparación de una sola célula para scRNAseq.<ol><li>Resuspender el pellet unicelular con 100 μL de BSA al 1% helada en PBS en un tubo de 0,2 ml.</li>
		<li>Después de resuspender las celdas para la encapsulación de una sola célula, proceda inmediatamente a la encapsulación de una sola celda y al código de barras utilizando un sistema de partición y código de barras de una sola célula basado en microfluídica (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Antes de enviar las muestras al núcleo genómico, cuente e inspeccione las preparaciones unicelulares; asegurar la ausencia de agregados celulares. NOTA: La agregación de células individuales se puede minimizar aún más aumentando la cantidad de BSA hasta un 2%.</li>
	</ol></li>
	<li>Vuelva a suspender y envíe la preparación de celda única para scATACseq.<ol><li>Resuspender el pellet de celda en 100 μL de BSA al 0,04% en 1x PBS helado y centrifugar la suspensión unicelular a 500 × g a 4 °C.</li>
		<li>Lise la suspensión de una sola celda con tampón de lisis 0.1x helado (Tabla 1) e incubar durante 5 minutos en hielo.</li>
		<li>Mezclar el lisado 10 veces con una pipeta P-20 e incubar durante 10 minutos adicionales.</li>
		<li>Añadir 500 μL de tampón de lavado refrigerado (Tabla 1) a las células lisadas y mezclar 5 veces con una pipeta. NOTA: Utilice un filtro de células de 70 μm para filtrar cualquier residuo de la suspensión celular y transferirlo a un tubo de 2 ml.</li>
		<li>Centrifugar el lisado a 500 × g durante 5 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante y resuspender el nuclei-pellet en el tampón de núcleos diluidos (150 μL) (ver la Tabla de materiales y la Tabla 1). Contar e inspeccionar las preparaciones de un solo núcleo utilizando un hemocitómetro11.</li>
		<li>Envíe la muestra de núcleos únicos al núcleo genómico para la transposición de núcleos únicos, la partición de núcleos, la preparación de bibliotecas y la secuenciación. NOTA: Si el número inicial de células es bajo, es común observar restos a lo largo de los núcleos. Por lo tanto, se recomienda comenzar con un alto número de células.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li>
<li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow%2C+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Heart+and+Circulation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li>
<li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861(2010).</li>
<li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li>
<li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039(2014).</li>
<li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li>
<li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000(2013).</li>
<li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491(2020).</li>
<li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+integration+of+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180(2021).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
<li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210(2019).</li>
</ol>

HJ es el fundador de FloKines Pharma. Otros autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Este documento proporciona un protocolo detallado para aislar preparaciones unicelulares de las arterias carótidas del ratón. La influencia del flujo d en las células endoteliales se puede estudiar con precisión si la cirugía de LCP se realiza correctamente. Es crucial identificar correctamente las ramas de la carótida común, como la carótida externa, la carótida interna, la arteria occipital y la arteria tiroidea superior. La validación de los patrones de flujo por ecografía valida aún más el inicio exitoso de ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63128">Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1 
Aitor Andueza*1 
Juyoung Kim1 
Dong-Won Kang1 
Hanjoong Jo1,2 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University 
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1 
Aitor Andueza*1 
Nicolas Villa-Roel1 
Juyoung Kim1 
Dong-Won Kang1 
Hanjoong Jo1,2 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63128">Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments

Este laboratorio demostró previamente que la inducción del flujo d conduce al desarrollo rápido y robusto de aterosclerosis en ratones hiperlipidémicos 1,2. El nuevo modelo de ratón de aterosclerosis inducida por flujo D fue posible mediante cirugía de ligadura carotídea parcial (LCP) 3. La cirugía de LCP induce una condición de flujo sanguíneo bajo y oscilatorio o flujo D en la arteria carótida izquierda ligada (LCA). En contraste, la arteria carótida derecha contralateral (ACR) continúa enfrentando un flujo laminar estable (flujo s). Anteriormente, para comprender el efecto del flujo d en las células endoteliales, las arterias carótidas se diseccionaron después de la cirugía de ligadura parcial y se enjuagaron con un agente lisante a base de isotiocianato de fenol y guanidina (método de lavado de ARN / ADN luminal)2,4, que proporcionó ARN o ADN enriquecidos endotelialmente "agrupados". Estos ARN o ADN a granel agrupados se procesaron para estudios transcriptómicos o estudios de metiloma de ADN epigenómico, respectivamente 4,5,6. Estos estudios ayudaron a descubrir múltiples genes sensibles al flujo y microARN cuyos roles en la biología endotelial y la aterosclerosis fueron ampliamente investigados 4,6,7.
Sin embargo, a pesar del enriquecimiento endotelial, estos estudios masivos de ARN / ADN no pudieron distinguir el papel específico de cada tipo de célula en la pared arterial en la aterosclerosis inducida por flujo d. Para superaresta limitación se realizó aislamiento unicelular (sc) enriquecido endotelial y estudios de secuenciación de scRNA y scATAC 8. Para esto, los ratones C57Bl6 fueron sometidos a la cirugía PCL para inducir el flujo d en el LCA mientras usaban el RCA expuesto al flujo s como control. Dos días o dos semanas después de la cirugía de LCP, los ratones fueron sacrificados, y las carótidas fueron diseccionadas y limpiadas. La luz de los ACV y los ACR se infundió con colagenasa, y se recogieron los digeridos luminales de colagenasa que contenían CE como una fracción significativa y otras células arteriales. La suspensión de una sola célula (scRNAseq) o la suspensión de un solo núcleo (scATACseq) se prepararon y codificaron con códigos de barras con identificadores únicos para cada célula o núcleo utilizando una configuración genómica 10x. Los ARN se sometieron a la preparación de la biblioteca de ADNc y se secuenciaron.
Los conjuntos de datos scRNAseq y scATACseq se procesaron utilizando el software Cell Ranger Single-Cell y se analizaron posteriormente mediante los paquetes Seurat y Signac R 9,10. A cada célula y núcleo se le asignó un tipo de célula de estos análisis y se agrupó en el tipo de célula en función de los genes marcadores y los patrones de expresión génica únicos. Los resultados de scRNAseq y scATACseq demostraron que estas preparaciones unicelulares están enriquecidas con CE y también contienen células musculares lisas (SMC), fibroblastos y células inmunes.
Un análisis posterior reveló que la población de EC en la digestión luminal es altamente divergente y plástica (8 grupos diferentes de EC) y responde al flujo sanguíneo. Lo más importante es que estos resultados demostraron que el flujo d reprograma los CE de un fenotipo antiinflamatorio protegido por atero a fenotipos proaterogénicos, incluida la transición proinflamatoria, endotelial a mesenquimal, la transición de células madre / progenitoras endoteliales y, lo que es más sorprendente, la transición de células endoteliales a inmunes. Además, los datos de scATACseq revelan nuevos cambios de accesibilidad a la cromatina dependientes del flujo y sitios de unión al factor de transcripción de una manera genómica completa, que forman la base de varias hipótesis nuevas. La metodología y el protocolo para preparar células endoteliales individuales para estudios multiómicos unicelulares de las arterias carótidas de ratón se detallan a continuación.

<table><tbody><tr><td>Chemicals, Peptides, and Recombent Proteins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td><td>Corning</td><td>21040CMX12</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrífuga</td><td>Tubos Eppendorf</td><td>022-43-108-1</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo de Centrífuga - Estante de Espuma, Estéril</td><td>Fablab</td><td>FL4022</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos de Centrífuga SuperClear</td><td>Labcon</td><td>3191-335-028</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Sutura de seda estéril</td><td>Covidien</td><td>s-1172 c2</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtro de células, blanco, estéril, empaquetado individualmente</td><td>Thermo Fisher Scientic</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Solución de accutasa,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td>filtrado</td>estérilmente o</tr><tr><td>tampón ATAC equivalente (componente I de la mezcla de transposición)</td><td>10x Genomics</td><td>2000122</td><td></td></tr><tr><td>Enzima ATAC (componente II de la mezcla de transposición)</td><td>10x Genomics</td><td>2000123/ 2000138</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Med-Vet International</td><td>RXBUPRENOR5-V</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Controller & Siguiente Kit de accesorios GEM</td><td>10X Genomics 1000204</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chromium Siguiente GEM Kits de reactivos de una sola célula 3' v3.1</td><td>10X Genomics</td><td>1000121</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Siguiente GEM Kits de reactivos ATAC de célula única v1.1</td><td>10X Genomics</td><td>1000175</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa II</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100502.5</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de disección</td><td>Roboz Surgical Instruments Co</td><td>RS-5005</td><td></td></tr><tr><td>Dnase1</td><td>New England Biolabs Inc</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga (Modelo de sobremesa # 5425)</td><td>Eppendorf</td><td>22620444230VR</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino - Premium Select</td><td>R& D systems</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ángulo fijo</td><td>Eppendorf</td><td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td><td></td></tr><tr><td>HEPES solución salina tamponada</td><td>Millipore Sigma</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina (jeringa de 3/10 mL 29 G)</td><td>BD</td><td>305932</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson vet</td><td>789 313 89</td><td></td></tr><tr><td>MACs Smart Strainers (30 &micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (100 &micro; m)</td><td>&nbsp; Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina normal (cloruro de sodio al 0,9%</td><td>Baxter International Inc</td><td>2B1323</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de núcleos (20x)</td><td>10x Genomics</td><td>PN 2000153/2000207</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientic</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras pequeñas</td><td>Roboz Surgical Instruments Co</td><td>RS-5675</td><td></td></tr><tr><td>Micro clip de acero inoxidable que aplica pinzas con bloqueo</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5480</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Tissue Mend II</td><td>Webster Veteinanry</td><td>07-856-7946</td><td></td></tr><tr><td>Tipo II Colagenasa</td><td>MP biomedicals</td><td>2100502.1</td><td></td></tr><tr><td>Deposited Data</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>scArchivos ATACseq FastQ</td><td>NCBI</td><td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td><td></td></tr><tr><td>scRNAseq FastQ</td> <td>filesNCBI</td><td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td><td></td></tr><tr><td>Software and Algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger 3.1.0</td><td>10X Genomics</td><td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td><td></td></tr><tr><td>Cicero</td><td>Pliner et al., 2018</td><td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td><td></td></tr> <tr><td>Ggplot2 v3.2.1</td><td>Hadley Wickham</td><td>https://cran.r-project.org</td><td></td></tr><tr><td>Harmony</td><td>Korsunsky et al., 2019</td><td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Schneider et al., 2012</td><td>https://imagej.nih.gov</td><td></td></tr><tr><td>Monocle 2.8.0</td><td>Qiu et al., 2017</td><td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td><td></td></tr><tr><td>R versión 3.6.2</td><td>R Foundation</td><td></td><td></td>https://www.r-project.org</tr><tr><td>Seurat 3.1.3</td><td>Stuart et al., 2019</td><td>https://github.com/satijalab/seurat</td><td></td></tr><tr><td>Signac 0.2.5</td><td>Stuart et al., 2019</td><td>https://github.com/timoast/signac</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de células endoteliales de la luz de arterias carótidas de ratón para experimentos multiómicos unicelulares

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria de las regiones arteriales expuestas a un flujo sanguíneo alterado (flujo d). El flujo D regula la expresión de genes en el endotelio a nivel transcriptómico y epigenómico, dando lugar a respuestas proaterogénicas. Recientemente, se realizaron estudios de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq) y ensayo de células individuales para secuenciación de cromatina accesible por transposasa (scATACseq) para determinar los cambios transcriptómicos y de accesibilidad a la cromatina a una resolución de una sola célula utilizando el modelo de ligadura carotídea parcial (PCL) de ratón. Como las células endoteliales (CE) representan una fracción menor de las poblaciones celulares totales en la pared arterial, se utilizó un método de digestión luminal para obtener preparaciones unicelulares enriquecidas con EC. Para este estudio, los ratones fueron sometidos a cirugía de LCP para inducir el flujo d en la arteria carótida izquierda (LCA) mientras usaban la arteria carótida derecha (RCA) como control. Las arterias carótidas se diseccionaron dos días o dos semanas después de la cirugía de LCP. La luz de cada carótida se sometió a la digestión de colagenasa, y se obtuvieron células individuales enriquecidas endotelialmente o núcleos únicos. Estas preparaciones de una sola célula y de un solo núcleo se codificaron posteriormente utilizando una configuración microfluídica de Genomics 10x. Las células individuales y núcleos únicos con código de barras se utilizaron para la preparación de ARN, la generación de bibliotecas y la secuenciación en un secuenciador de ADN de alto rendimiento. Después del procesamiento bioinformático, los conjuntos de datos scRNAseq y scATACseq identificaron varios tipos de células de la digestión luminal, que consisten principalmente en CE. Las células musculares lisas, los fibroblastos y las células inmunes también estaban presentes. Este método de enriquecimiento de EC ayudó a comprender el efecto del flujo sanguíneo en el endotelio, lo que podría haber sido difícil con el método de digestión arterial total. El método de preparación de células individuales enriquecido con CE se puede utilizar para realizar estudios ómicos de células individuales en ratones EC-knockouts y transgénicos donde no se ha estudiado el efecto del flujo sanguíneo sobre estos genes. Es importante destacar que esta técnica se puede adaptar para aislar células individuales enriquecidas con CE de explantes de arterias humanas para realizar estudios mecanicistas similares.

Se realizaron cirugías de ligadura carotídea parcial en 44 ratones, y el inicio del flujo d en el LCA se validó mediante la realización de ecografía un día después de la cirugía de ligadura parcial. La cirugía de ligadura parcial exitosa reduce la velocidad del flujo sanguíneo y revierte el flujo sanguíneo (flujo alterado) en el LCA3. Las arterias carótidas se diseccionaron a los dos días o a las dos semanas después de la ligadura. La luz de cada carótida se sometió a la digestión de cola...

Presentamos un método para aislar células endoteliales y núcleos de la luz de arterias carótidas de ratón expuestas a condiciones de flujo estables o alteradas para realizar experimentos ómicos unicelulares.

Aislamiento de células endoteliales de la luz de arterias carótidas de ratón para experimentos multiómicos unicelulares

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

En un vaso sanguíneo, el número de células endoteliales es muy bajo, lo que dificulta su estudio. Nuestro protocolo elimina esta limitación y nos permite estudiar nuevas vías moleculares y terapéuticas. Nuestro protocolo nos permite obtener muestras enriquecidas endotelialmente, y estudiar cómo el flujo perturbado agudo y crónico afecta a este tipo celular.La capacidad de estudiar las células endoteliales con más detalle permite definir genes diana y, por lo tanto, terapias potenciales para la aterosclerosis dirigidas a las células endoteliales. El aislamiento de la arteria carótida es complicado y requiere paciencia y experiencia. Para comenzar, prepare al animal inyectando 0.05 miligramos por kilogramo de buprenorfina por vía subcutánea.Esterilice el área depilada usando Betadine e isopropanol solución tres veces. Haga una incisión ventral en la línea media de aproximadamente un centímetro en la región del cuello. Luego exponga el punto de bifurcación LCA mediante disección roma.Ligate la carótida interna izquierda, la carótida externa y las arterias occipitales con suturas 6-0, dejando intacta la arteria tiroidea superior. Cierre la incisión con pegamento de tejido o suturas. Transfiera el ratón a una jaula de recuperación precalentada mantenida a 37 grados centígrados.Coloque el ratón sobre una toalla limpia durante un máximo de una hora para evitar la hipotermia postoperatoria. Inserte una aguja de calibre 21 en la línea IV conectada a través del ápice del corazón hacia el ventrículo izquierdo. Permita la perfusión retrógrada durante dos o tres minutos usando solución salina normal a temperatura ambiente.Mantenga un caudal constante aplicando una presión constante mientras inyecta o usa una línea IV, y mantenga la bolsa salina a una altura de ocho a nueve pies. Retire la piel de la región del cuello con toda la grasa, los músculos y los tejidos conectivos para exponer las arterias carótidas. Luego retire los tejidos periadventicios alrededor de las carótidas dejando la carótida unida al cuerpo.Haga una incisión debajo del sitio de ligadura en el LCA para permitir la perfusión. Perfunda el LCA a través del ventrículo izquierdo durante otro minuto para eliminar cualquier rastro de sangre. Lave el exterior de las arterias carótidas con solución salina normal para eliminar cualquier rastro de sangre.Use una jeringa de insulina con una aguja de calibre 29 para inyectar 50 microlitros de tampón de digestión en el lumen del extremo distal de la arteria carótida izquierda. Use un microclip para sujetar el extremo proximal de la arteria carótida lleno de tampón de digestión. Agregue de 15 a 20 microlitros de tampón de digestión en el lumen y recorte el extremo distal para evitar cualquier liberación de tampón de digestión.Transfiera las arterias carótidas del ratón a platos de 35 milímetros que contengan solución salina tamponada HEPES tibia de 37 grados centígrados. E incubarlos durante 45 minutos a 37 grados centígrados con balanceo intermitente. Retire la arteria carótida con las pinzas del plato de 35 milímetros después de que se complete la digestión enzimática luminal.Separe las abrazaderas con cuidado, para que el amortiguador de digestión no tenga fugas. Sostenga un extremo de la arteria carótida sobre un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue 100 microlitros de tampón de digestión caliente a la luz insertando una aguja de calibre 29 equipada con una jeringa de insulina.Enjuague rápidamente la luz de la arteria carótida en el tubo de microcentrífuga, luego agregue 0.3 microlitros de FBS en el tubo para detener la reacción. Coloque el tubo de microcentrífuga sobre hielo. Centrifugar las celdas a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, utilizando una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo y desechar el sobrenadante.Vuelva a suspender las células en un tampón de digestión, que contiene el reactivo de disociación celular, e incubarlas durante cinco minutos a 37 grados centígrados para separarlas en células individuales. Bloquee la reacción enzimática agregando 0.15 mililitros de FBS al tubo de 0.5 mililitros y repita la centrifugación. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 100 microlitros de solución BSA al 1% helada en PBS en un tubo de microcentrífuga de 0,2 mililitros.Para el análisis de una sola célula, resuspenda el pellet con 100 microlitros de BSA al 1% de hielo frío en PBS en un tubo de 0,2 mililitros. Para el análisis de un solo núcleo, resuspenda el pellet celular en 100 microlitros de 0.04% BSA en PBS helado y centrifugar la suspensión de una sola celda a 500G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Descomponga la suspensión de una sola célula con tampón de lisis helada e incube durante cinco minutos en hielo.Mezclar el lisado con una pipeta P20 e incubar durante otros 10 minutos. Después, transfiera el lisado en un tubo de 0.5 mililitros. Lave las células con 500 microlitros de tampón y mézclelas con una pipeta.Luego repita la centrifugación. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de núcleos en 150 microlitros del tampón de núcleos diluidos. Cuente las preparaciones de núcleos individuales usando un hemocitómetro.Después del estudio de secuenciación de núcleos únicos, se obtuvieron y visualizaron núcleos únicos y de célula única mediante microscopía de campo claro y contraste de fase. También se demostró la eficiencia de la preparación de núcleos únicos a partir de la suspensión de una sola célula. Después del estudio de secuenciación de ARN de una sola célula, se obtuvieron varios parámetros como la distribución de genes por célula, el identificador molecular único por célula, las lecturas mitocondriales por célula y los datos de saturación de secuenciación.Para el estudio de secuencia ATAC de una sola célula, se observó la distribución del tamaño del inserto, incluido el patrón de bandas de nucleosomas. También se observó la puntuación normalizada de enriquecimiento de TSS. Además, el fragmento de porcentaje se lee en los picos.Se determinaron los fragmentos de la región máxima, la puntuación de enriquecimiento de TSS, la proporción de lecturas en los sitios genómicos de la lista negra y la relación de señal de los nucleosomas. La digestión enzimática es un estrés para las células, por lo tanto, es crucial mantener las muestras en hielo y realizar el procedimiento lo más rápido posible. Podemos usar este método para obtener y platear células endoteliales de ratones.También podemos utilizar esta técnica para realizar estudios basados en Omix a granel. Esta técnica allanó el camino para estudiar el efecto del flujo sanguíneo alterado en las células endoteliales in vivo de una manera de una sola célula.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Esto describe una cirugía de ligadura de la carótida parcial, lo que provoca trastornos condiciones de flujo y posterior desarrollo de la aterosclerosis (en dos semanas) con intraplaca neovascularización (en cuatro semanas) en el ratón de la arteria carótida común. También describe un nuevo método de aislamiento de ARN de la carótida íntima, proporcionando ARN de alta pureza endoteliales.

Un modelo de Disturbed inducida por el flujo de Aterosclerosis en la arteria carótida del ratón por la ligadura parcial y un método sencillo para el aislamiento de ARN del endotelio carótida

Presentamos una preparación para la visualización y manipulación de la señalización del calcio en el endotelio microvascular intacta nativo. Tubos endoteliales recién aisladas de las arterias de resistencia de ratones que suministran el músculo esquelético a retener en la morfología vivo y señalización dinámica dentro y entre las células vecinas. Tubos endoteliales pueden prepararse a partir de los microvasos de otros tejidos y órganos.

Aislamiento de microvascular endotelial Tubos de arterias de resistencia Ratón

La capacidad de aislar las células endoteliales de las válvulas cardíacas (VECs) es fundamental para comprender los mecanismos de desarrollo, mantenimiento y enfermedad de las válvulas.  En este trabajo describimos el aislamiento de VECs de ratones Tie2-GFP embrionarios y adultos utilizando FACS que permitirá realizar estudios que determinen la contribución de los VECs en los procesos de desarrollo y enfermedad.

Aislamiento de las células murinas de la válvula endoteliales

Las células endoteliales vasculares desempeñan un papel importante en muchos trastornos cardiovasculares importantes. Este artículo describe un método simple para aislar y expandir las células endoteliales de la aorta del ratón sin usar ningún equipo especial. Nuestro protocolo proporciona un medio eficaz para identificar mecanismos en la fisiopatología de las células endoteliales.

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

Este protocolo está preparado para compartir nuestro método de aislamiento de células endoteliales coronarias de ratón con fines de obtención de imágenes o para realizar experimentos de biología molecular.

Aislamiento de células endoteliales de ratón coronaria

Este protocolo describe un método para el aislamiento de células endoteliales retinianas postnatales murinas optimizadas para el rendimiento, la pureza y la viabilidad celular. Estas células son adecuadas para los enfoques de secuenciación de próxima generación.

Aislamiento de células endoteliales retinianas murinas para secuenciación de próxima generación

En este artículo, las células endoteliales pulmonares primarias se aislaron y cultivaron de ratones neonatos.

Aislamiento de células endoteliales pulmonares primarias de ratón

El protocolo describe el aislamiento, el cultivo y el perfil de las células endoteliales de la arteria mesentérica humana. Además, se proporciona un método para preparar la arteria humana para la transcriptómica espacial. La proteómica, la transcriptómica y los ensayos funcionales se pueden realizar en células aisladas. Este protocolo se puede reutilizar para cualquier arteria de tamaño mediano o grande.

Aislamiento y perfil de células endoteliales arteriales mesentéricas primarias humanas a nivel de transcriptoma

Este protocolo detalla un método para la disección de depósitos adiposos de ratón y el aislamiento y la digestión de las arterias respectivas para liberar y luego identificar la población de células endoteliales. Las células recién aisladas utilizadas en aplicaciones posteriores avanzarán en la comprensión de la biología celular vascular y los mecanismos de la disfunción vascular.

Aislamiento e identificación de células endoteliales vasculares de distintos depósitos adiposos para aplicaciones posteriores

Este artículo describe un método para el aislamiento basado en perlas magnéticas de células endoteliales murinas de capilares linfáticos dérmicos. Las células endoteliales linfáticas aisladas se pueden utilizar para experimentos in vitro posteriores y análisis de expresión de proteínas.

Aislamiento de células endoteliales linfáticas dérmicas murinas

Aquí describimos un protocolo de digestión celular de dos pasos para preparar una suspensión unicelular de las arterias carótidas de ratón.

Preparación de una suspensión unicelular de arterias carótidas de ratón para la secuenciación de células individuales

Aprende a aislar células endoteliales de arterias carótidas de ratón para análisis multiómicos unicelulares. Este método permite estudiar respuestas al flujo sanguíneo alterado y vías moleculares en aterosclerosis.

Aislamiento de células endoteliales de la luz de arterias carótidas de ratón para experimentos multiómicos unicelulares

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