Establecimiento de un modelo de pancreatitis aguda grave en ratones mediante inyección retrógrada de taurocolato de sodio en el conducto biliopancreático
1 de abril de 2022
Aquí se describe un modelo de ratón de pancreatitis aguda grave. El procedimiento presentado aquí es muy rápido, simple y accesible, lo que potencialmente permite el estudio de los mecanismos moleculares y las diferentes intervenciones terapéuticas en la pancreatitis aguda de una manera conveniente.
El objetivo general de este video es establecer un modelo de ratón de pancreatitis aguda a través de la inyección retrógrada de taurocolato de sodio en el conducto biliopancreático. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Soochow. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron bajo anestesia completa.
No se utilizaron analgésicos para no interferir con el curso natural de la enfermedad, lo que fue evidenciado por literaturas previas y aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Soochow. Ayune al ratón de ocho a 12 horas antes de la cirugía. Prepare filtros de solución de taurocolato de sodio al 5% a través de un microfiltro 0.22.
Autoclave los instrumentos y materiales quirúrgicos, incluidos fórceps, tijeras, soporte de cuchillas, soporte de agujas, clip hemostático, abrazaderas vasculares y cortinas estériles. La microjeringilla fue esterilizada mediante irradiación. Con el ratón, induzca una anestesia general con inyección intraperitoneal de solución de sodio de pentobarbital al 1% a una dosis de 50 miligramos por kilogramo.
Fije el ratón en posición supina sobre una placa plana de espuma irradiada con la cinta. Retire el pelaje de un ratón con una crema depilación desde el nivel del proceso xifoide hasta la línea de conexión de la columna ilíaca superior anterior bilateral, con los lados izquierdo y derecho paralelos a la línea axilar frontal. Limpie la piel de dos a tres veces con 0.5% de yodóforo y déjela secar durante uno o dos minutos cada vez.
Cubra el ratón con cortinas estériles. Corte la capa de piel abierta y luego ábrala por vía subcutánea. Haga una incisión abdominal mediana aproximada de dos a tres centímetros de largo.
Localice el duodeno de izquierda a derecha a lo largo del estómago. Tire suavemente del duodeno hacia afuera y hacia el lado izquierdo usando fórceps quirúrgicos y un hisopo de algodón empapado en desinfectante para exponer el páncreas, el conducto biliopancreático y la papila duodenal. Usar 8-0 suturas para pasar a través de la conexión entre el duodeno y el páncreas alrededor de la papila, tire de la sutura hacia el lado izquierdo del cuerpo del ratón para fijar el duodeno.
Tire suavemente de la piel y el borde inferior del hígado a un lado. Sujete el conducto hepático común. Perfore el microinyector en el conducto biliopancreático distal retrógradamente.
Fije la punta de la aguja cerca de la papila duodenal con una pinza. Infundir 10 microlitros de taurocolato de sodio al 5% en el conducto biliopancreático a una velocidad de 5 microlitros por minuto. Mantenga el conducto biliopancreático cerrado durante 5 min para lograr una presión estable.
Retire las abrazaderas. Saque el microinyector, retire la otra abrazadera y fije la sutura. Restaure el duodeno a la posición anatómica original y verifique el sangrado.
Cierre la herida con 6-0 suturas. Retire la cortina estéril. Desinfecte la incisión con yodóforo al 0,5%.
Recupere a los animales de la anestesia en una almohadilla térmica de 37 grados centígrados. Administrar 0,8 mililitros de solución salina al 0,9% por vía subcutánea para la suplementación con líquidos. A las 24 horas después de la operación, anestesiar al ratón con pentobarbital sódico utilizando la misma dosis y la misma vía de inyección.
Recoger la sangre entera de la aorta abdominal y girar a 1, 500 x g durante 15 minutos para aislar el suero para las pruebas serológicas. Recolectar el páncreas y los tejidos pulmonares para la evaluación histología. Sumerja el páncreas en una solución de paraformaldehído al 4% durante 24 horas.
Deshidratar en una serie de concentraciones de alcohol e incrustar en parafina. Use un microtomo para preparar 5 secciones de tejido pancreático micro gruesas. Realizar tinción de H&E para la evaluación histológica del páncreas.
Los ratones estaban ligeramente inactivos y perdieron peso a las 24 horas después de la operación en comparación con la preoperación. Las tasas de supervivencia de los ratones control y SAP fueron del 100% y 72,7% respectivamente, a las 72 horas después de la operación. De acuerdo con los resultados de tinción de H&E de las secciones de páncreas, se pudo observar necrosis pulpar del tejido del páncreas en ratones SAP, mientras que no se pudieron encontrar cambios significativos en ratones de control.
Además, se encontró un aumento significativo de los niveles de actividad de amilasa, lipasa, páncreas y MPO pulmonar en ratones SAP en comparación con ratones control. Además, también se encontraron niveles significativamente elevados de los índices hepático y renal, incluidos ALT, AST, BUN y creatinina. Usando la inyección retrógrada de taurocolato de sodio en el conducto biliopancreático, se pudo inducir pancreatitis aguda grave en ratones.
Buena exposición del conducto biliopancreático para asegurar la punción exitosa. Durante la punción, asegure el ángulo y la fuerza adecuados para evitar la perforación del conducto biliopancreático. El modelo SAP inducido por TC descrito aquí es un modelo adecuado para estudiar los mecanismos implicados en la pancreatitis aguda grave.
Es un modelo económico que utiliza reactivos menos costosos y este video ayuda a capacitar al cirujano novato más rápido.
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Descripción general
Este artículo describe un modelo murino rápido y accesible para el estudio de la pancreatitis aguda grave mediante la inyección retrógrada de taurocolato sódico. El modelo permite investigar los mecanismos moleculares y las intervenciones terapéuticas en la pancreatitis aguda.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Patofisiología
Antecedentes
- La pancreatitis aguda es una afección grave que requiere modelos efectivos para su estudio.
- Los modelos existentes pueden ser complejos y consumir mucho tiempo.
- Este estudio tiene como objetivo simplificar el proceso de inducción de pancreatitis aguda en ratones.
- Comprender los mecanismos de la enfermedad puede conducir a estrategias terapéuticas mejores.
Objetivo del estudio
- Establecer un modelo murino confiable de pancreatitis aguda grave.
- Facilitar el estudio de los mecanismos de la enfermedad y las opciones de tratamiento.
- Proporcionar un método rentable que utilice reactivos fácilmente disponibles.
Métodos Utilizados
- Inyección retrógrada de taurocolato sódico en el conducto bilipancreático.
- Procedimientos en animales aprobados por el Comité de Ética Animal.
- Uso de anestesia y técnicas quirúrgicas para inducir pancreatitis.
- Evaluación histológica de los tejidos pancreáticos tras la operación.
Resultados principales
- Se indujo con éxito pancreatitis aguda grave en ratones.
- El análisis histológico mostró necrosis en los tejidos pancreáticos.
- Diferencias significativas en los niveles séricos de enzimas entre ratones control y con PAG.
- El modelo demostró altas tasas de supervivencia y reproductibilidad.
Conclusiones
- El modelo descrito es efectivo para estudiar la pancreatitis aguda grave.
- Permite una formación rápida de cirujanos novatos en el procedimiento.
- Este enfoque puede mejorar la investigación sobre intervenciones terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Establecer modelos preclínicos confiables de pancreatitis aguda grave es fundamental para la validación de dianas terapéuticas y la reducción del riesgo mecanicista en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos. Este modelo de inyección retrógrada de taurocolato sódico proporciona un sistema reproducible y rentable para investigar las vías fisiopatológicas y evaluar candidatos terapéuticos. Su accesibilidad favorece la preparación para cribados de alto rendimiento y la alineación de biomarcadores traslacionales en las líneas de I+D centradas en la pancreatitis.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de la necrosis pancreática y la elevación de biomarcadores enzimáticos.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas a través de resultados histopatológicos y serológicos medibles en la inducción de pancreatitis aguda severa (SAP).
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos en fase preclínica al modelar la fisiopatología de la pancreatitis aguda severa (SAP) relevante para humanos, optimizando así los compuestos líderes.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera sistemas estandarizados relevantes para enfermedades para la preparación de ensayos y cascadas de cribado de compuestos.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad de los ensayos mediante la inducción consistente de SAP a través de inyección controlada en el conducto bilipancreático.
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma en múltiples ciclos de evaluación de compuestos debido al bajo costo de reactivos y a la simplicidad quirúrgica.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Proporciona continuidad del sistema relevante para la enfermedad, desde el descubrimiento hasta la validación preclínica, mediante histopatología y biomarcadores séricos.
- Valor operativo: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante elevaciones séricas correlacionadas de amilasa, lipasa, ALT, AST, nitrógeno ureico en sangre y creatinina.
- Alineación de biomarcadores traslacionales: Permite la evaluación de terapéuticas candidatas frente a marcadores de lesión pancreática y de órganos clínicamente relevantes.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El modelo se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir la prueba de hipótesis, la clarificación de vías y la reducción de riesgos biológicos antes de las etapas de identificación de compuestos prometedores.
- Biología del Descubrimiento: Permite la indagación mecanicista de las vías de la pancreatitis aguda severa mediante la cuantificación de necrosis tisular y lecturas de marcadores inflamatorios.
- Selección: Proporciona resultados listos para su análisis y reproducibles mediante inyección retrógrada estandarizada y recogida postoperatoria de suero y tejidos.
- Análisis: Genera variables dependientes cuantitativas, incluidos los niveles séricos de enzimas y puntuaciones histológicas, para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante biomarcadores de lesión orgánica (ALT, AST, BUN, creatinina) que reflejan presentaciones clínicas de pancreatitis aguda severa.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable debido al bajo costo de los reactivos, la mínima complejidad quirúrgica y la alta reproducibilidad del modelo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva mediante la reducción de riesgos mecanicistas de la fisiopatología de SAP y la validación del compromiso del blanco terapéutico.
- Valor operativo: Garantiza estandarización, reproducibilidad y escalabilidad mediante una técnica sencilla con microjeringa y parámetros de infusión definidos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción del proyecto al reducir el riesgo biológico en fases tardías mediante la modelización temprana de la fisiopatología.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo utilizando umbrales de biomarcadores séricos y puntuación histológica como criterios para decisiones de avance o interrupción.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía, administración de anestesia y monitoreo postoperatorio de animales.
- Depende de instrumental quirúrgico estéril, microjeringa y bomba de infusión controlada para el acceso ductal.
- Necesita la estandarización entre equipos de la técnica quirúrgica, el momento postoperatorio y los protocolos de recolección de suero y tejidos.
- Las consideraciones de adaptación incluyen la variabilidad del modelo entre cepas de ratones y las respuestas específicas según el sexo al taurocolato sódico.
- Las limitaciones prácticas incluyen la variabilidad en las tasas de supervivencia y la necesidad de suplementación de líquidos postoperatorios para mantener la consistencia del modelo.
