Drosophila Comportamiento de evitación pasiva como nuevo paradigma para estudiar el aprendizaje asociativo aversivo

Este protocolo describe un ensayo conductual simple que permite estudiar el aprendizaje asociativo adverso y la consolidación de la memoria en moscas, incluidos los efectos de las interacciones del entorno genético. El ensayo presentado aquí es un procedimiento simple, reproducible y rentable para estudiar los mecanismos de memoria que se pueden ensamblar fácilmente con algunos suministros disponibles. Este ensayo podría proporcionar información sobre los mecanismos básicos subyacentes al aprendizaje y las deficiencias de la memoria resultantes de diversas manipulaciones genéticas, farmacológicas y dietéticas.

Demostrando este procedimiento estarán Morgan Tedder y Steven Bradley, estudiantes de pregrado de mi laboratorio. Para comenzar, perfore un agujero de cuatro milímetros perpendicularmente a unos cuatro milímetros del fondo dentro de un tubo de cultivo de polipropileno de 14 mililitros. Retire la parte superior del tubo de cultivo para hacer un fragmento inferior de 45 milímetros utilizado como compartimento inferior.

Corte la parte superior de la punta de una pipeta de 1000 microlitros para crear un fragmento de 12 milímetros. Inserte el fragmento en el orificio de cuatro milímetros del tubo de cultivo como muelle de carga para transferir las moscas. Corte una pieza de 15 milímetros de tubo de vinilo transparente e inserte el compartimento inferior y superior de los extremos opuestos en el tubo.

Fije el conjunto verticalmente con una abrazadera ajustable de dos puntas. Ubique el compartimento superior fijado verticalmente con tubos de choque. Conecte los tubos de descarga con un estimulador eléctrico para generar descargas eléctricas.

Usando un bloque helado, inmovilice moscas de tres a cuatro días de edad y transfiéralas a viales separados con alimentos 24 horas antes del experimento. Asigne un código a todos los viales como se describe en el manuscrito de texto. Succiona suavemente una mosca en el aspirador bucal extrayendo aire.

Deposite la mosca soplando ligeramente en el muelle de carga e inmediatamente inicie un temporizador de un minuto y un cronómetro. Encienda el estimulador y administre una descarga eléctrica cuando la mosca entre en el tubo de descarga. Presione el cronómetro para registrar la primera latencia.

Si la mosca vuelve a entrar en el tubo de choque, administre choques adicionales. Usando un conteo o un contador basado en Arduino, registre el número de choques durante una prueba de un minuto. Transfiera suavemente la mosca de vuelta al vial al final de una prueba de un minuto.

Registre la latencia, el número de choques recibidos y cualquier cambio notable en el comportamiento. Con etanol al 70%, limpie el compartimento inferior y el compartimento de choque. Limpie con un pañuelo de limpieza sin pelusa y séquelo con un secador de pelo.

Repita la prueba con la siguiente mosca. Limpie el compartimento inferior con agua y detergente inodoro después de completar el experimento. Con etanol al 70%, limpie el compartimento inferior y de choque y séquelo al aire durante la noche.

Al repetir el proceso anterior después de 24 horas, realice una segunda prueba. En una secuencia similar, pruebe las moscas. Después de realizar un ensayo de evitación pasiva en moscas macho Drosophila melanogaster, los resultados han demostrado que la latencia aumenta, el número de descargas disminuye, demostrando que las moscas aprendieron la asociación entre el compartimento superior y una descarga eléctrica.

La distribución de frecuencia reveló que la mayoría de las moscas ingresan al compartimiento superior y reciben de uno a tres choques en el primer ensayo. En la cuarta prueba, la mayoría de las moscas no entran en el compartimento superior y reciben cero golpes. En experimentos posteriores, la duración del ensayo se redujo a un minuto porque la distribución de frecuencia para las latencias mostró claramente que si la mosca no entra en el compartimento superior dentro de los 60 segundos en el primer ensayo, generalmente no entra en absoluto.

Los experimentos de ensayo de evitación pasiva se repitieron en moscas macho y hembra de Drosophila simulans. Los resultados han demostrado que las moscas fueron efectivas para aprender el comportamiento de evitación pasiva como lo demuestran los cambios en las distribuciones de frecuencia para latencias y choques en moscas macho y hembra. La comparación de latencias y el número de shocks entre hombres y mujeres no reveló diferencias estadísticamente significativas.

Sin embargo, las moscas hembras recibieron un poco más de choques en cada ensayo. El análisis de los combates de aseo en los ensayos dos y tres reveló que la duración total del aseo disminuye significativamente en las moscas hembras desde el ensayo uno hasta el ensayo tres. Esto sugiere que las moscas experimentan estrés conductual que es paralelo a los comportamientos similares a la ansiedad de los roedores.

La comparación de los efectos de la dieta occidental y el ejercicio de vuelo en el comportamiento de evitación pasiva muestra que la dieta occidental disminuye la latencia y aumenta el número de choques, lo que indica que la dieta occidental perjudica el aprendizaje asociativo aversivo en las moscas. Por el contrario, el ejercicio de vuelo mitigó el efecto negativo de la dieta occidental. Al intentar este procedimiento, recuerde no estresar a las moscas.

Las moscas estresadas entrarían en el compartimento superior demasiado rápido o no entrarían en absoluto. Todos los experimentos deben realizarse en las mismas condiciones ambientales y a la misma hora del día. Esta técnica proporciona a los investigadores un nuevo ensayo simple que se puede utilizar para diseccionar los mecanismos intrínsecos de aprendizaje y consolidación de la memoria en moscas.