Modelado de un sitio activo enzimático utilizando software gratuito de visualización molecular

Visualizar macromoléculas biológicas es una habilidad crítica para estudiantes y profesionales de las ciencias biológicas. En este protocolo, demostramos cómo modelar el sitio activo de la enzima glucoquinasa utilizando cuatro programas disponibles gratuitamente para el modelado molecular. Este tutorial destaca varios pasos del protocolo para cada programa, que incluye la selección de ligandos unidos y el uso de los ligandos para mostrar aminoácidos y moléculas de agua dentro de cinco angstroms.

La información de apoyo de este manuscrito contiene un video dedicado para cada programa, que detalla todos los pasos del protocolo con una explicación adicional. La estructura modelará PDBID. 3FGU representa el complejo catalítico de la enzima glucoquinasa.

El sitio activo de la enzima está unido a dos de sus sustratos, beta-D-glucosa, que ha dado el identificador BGC y un ion de magnesio, MG. Además, este análogo de sustrato, un ácido fosfo amino fosfórico, éster de adenilato, ANP se une al sitio activo de la glucoquinasa. Este análogo no hidrolizable del trifosfato de adenosina, ATP evita que ocurra la reacción de fosforilación, que captura el complejo del sitio activo precatálisis. La interfaz del programa de modelado UCSF ChimeraX contiene menús desplegables, una barra de herramientas, el visor de estructuras y una línea de comandos.

Comenzaremos el protocolo con el paso 1.4, seleccionando residuos dentro de cinco angstroms para definir un sitio activo. Para seleccionar los ligandos, presione el control shift y haga clic en cualquier átomo o enlace en cada uno de los tres ligandos. Presione la tecla de flecha hacia arriba hasta que los tres ligandos estén resaltados con un brillo verde.

Defina la selección para su uso futuro haciendo clic en el menú desplegable, seleccione definir selector, escriba ligandos para el nombre de la selección y haga clic en Aceptar. De nuevo, utilizando el menú de selección, seleccione zona. Cambie esto a residuos y asegúrese de que la casilla superior esté marcada.

Haga clic en Aceptar. Observe que las partes de la caricatura dentro de cinco angstroms de estos ligandos están resaltadas. Para mostrar las cadenas laterales como palos y mostrar el sitio activo de las moléculas de agua, use el menú de enlaces atómicos de acciones para mostrarlas.

O enciéndalos con estos botones aquí. Para borrar la selección, haga clic en cualquier lugar del espacio vacío. El resultado final de este protocolo debe ser un modelo con el sitio activo de la proteína y los ligandos mostrados como palos coloreados de forma contrastante.

Las interacciones clave de unión polar se muestran con líneas punteadas y algunos de los residuos que hacen contactos están etiquetados. La interfaz iCn3D contiene menús desplegables, el visor de estructuras y un registro de comandos. Esta vista muestra los conjuntos de selección y los menús emergentes de secuencia y anotaciones, que aparecen a medida que el usuario ejecuta los comandos que los requieren.

Comenzaremos el protocolo en el paso 2.4, seleccionando residuos dentro de cinco angstroms para definir un sitio activo. Para seleccionar los ligandos, utilice el menú desplegable seleccionar y haga clic en seleccionar en 3D, asegúrese de que el residuo esté marcado. Manteniendo presionado el botón alt en una PC o el botón de opción en una Mac, haga clic en el primer ligando.

Luego presione control y haga clic en las dos ligas restantes para agregarlas a la selección. Guarde la selección usando el menú desplegable, haga clic en seleccionar, guarde la selección, ingrese un nombre y haga clic en guardar. El menú emergente Seleccionar conjuntos aparecerá ahora con los tres ligandos seleccionados.

Ahora seleccione los residuos dentro de cinco angstroms de los ligandos. Utilice el menú desplegable seleccionado por distancia. En el menú emergente que aparece, cambie la lanza del segundo elemento con un radio a cinco angstroms escribiendo el bloque, haga clic en mostrar.

Y luego cierre la ventana haciendo clic en la X en la esquina superior derecha. Guarde el sitio activo de cinco angstrom haciendo clic en el menú desplegable, seleccione guardar selección y use el teclado para ingresar un nombre. A continuación, haga clic en Guardar.

Ahora cree una nueva selección que combine los dos conjuntos. Estos se pueden combinar en el menú emergente seleccionar conjuntos. En una PC, haga clic de control en los dos conjuntos o en un clic de comando de Mac.

De nuevo, haga clic en el menú desplegable, seleccione guardar selección y escriba un nuevo nombre y, a continuación, haga clic en guardar. Para mostrar interacciones como los enlaces de hidrógeno, utilice el menú de análisis y seleccione las interacciones. Solo nos interesarán los enlaces de hidrógeno y los puentes de sal aquí.

Así que desmarcaremos el resto de estos. Seleccionaremos tres ligandos. Y para el segundo conjunto, los residuos dentro de cinco angstroms.

Haga clic en Interacciones de visualización 3D y cierre la ventana. Esto muestra algunos de los residuos que están interactuando, pero no muestra todo el sitio activo de cinco angstrom. Para mostrar eso, volverá a usar el menú Seleccionar conjuntos.

Haga clic en cinco angstrom completo y luego en el menú desplegable, haga clic en estilo cadenas laterales, palos. Para aplicar la coloración CPK, haga clic en el menú desplegable de color y haga clic en átomo. El resultado final del protocolo debe ser un modelo que se vea así con el sitio activo de la proteína y el ligando mostrados como palos coloreados de manera contrastante.

Las interacciones de unión importantes se muestran con líneas punteadas y todos los residuos dentro de una de las selecciones que se crearon durante el protocolo están etiquetados. La interfaz de Jmol contiene menús desplegables, una barra de herramientas, el visor de estructuras, un menú emergente y la consola de Jmol que contiene la línea de comandos. Comenzamos el protocolo Jmol en el paso 3.4, seleccionando residuos dentro de cinco angstroms para definir un sitio activo.

La consola Jmol es la mejor manera de seleccionar los residuos dentro de cinco angstroms. Escriba este comando para seleccionar residuos dentro de cinco angstroms de los tres ligandos. Se seleccionan 193 átomos, pero estos no representan los residuos completos de aminoácidos.

Para seleccionarlos, use el comando escrito, seleccione dentro de (grupo, seleccionado) y presione entrar. Observe que aparecen halos de selección adicionales. Para mostrar estos residuos como palos, haga clic con el botón derecho para abrir el menú emergente, sitúe el cursor sobre el estilo, el esquema y, a continuación, haga clic en los palos.

Observe que todavía hay algunos halos vacíos aquí. Estas son las moléculas de agua en el sitio activo. Para seleccionar solo las moléculas de agua, podemos volver a ejecutar este comando y luego modificarlo.

Haga clic dentro de la consola, luego use las teclas de flecha hacia arriba para encontrar ese comando y haga clic en Entrar para volver a ejecutarlo. Para mostrar las moléculas de agua como átomos, queremos eliminar la selección del ligando y la proteína. Escribiremos dos comandos para hacerlo.

Nuestros liganos se consideran grupos hetero, pero el agua también se considera uno. Entonces, dentro de este comando, debemos definir que no estamos eliminando el agua. Presione enter y ahora solo se seleccionan las moléculas de agua.

Haga clic en el menú desplegable, sitúe el cursor sobre el átomo y haga clic en el 20% del radio de van der Waals. El ion magnesio verde todavía se muestra como palos. Más comúnmente los iones se muestran como esferas.

Haga clic en la consola Jmol y luego escriba select MG y luego space fill 50%Los ligandos dentro de las cadenas están coloreados de manera idéntica. Para distinguirlos entre sí, es útil volver a colorear los ligandos. En la consola, ejecutaré un comando multilínea, que he copiado y pegado de una hoja de trucos que elaboro en el video suplementario de Jmol.

El resultado de este protocolo debe ser un modelo que se vea así con el sitio activo de la proteína mostrado como palos. Y los ligandos que nos muestran se pegan en un esquema de color más suave. Las líneas amarillas indican las interacciones de unión y los residuos individuales se etiquetan como se desea.

La interfaz PyMOL contiene menús desplegables, el visor de estructuras, el panel de nombres de objetos y el menú de controles del ratón. La línea de comandos principal también está etiquetada en esta figura. Comenzamos el protocolo primario en el paso 4.4, seleccionando residuos dentro de cinco angstroms para definir un sitio activo.

Para seleccionar los ligandos haga clic en cada uno de ellos. Aparece una nueva selección, que se puede cambiar de nombre haciendo clic en el botón A. Usando el teclado, elimine las letras sele y escriba liganes en lugar de ellas.

Pulse Intro. Podemos usar esta selección para definir el área a su alrededor. Comience haciendo clic en el botón A y seleccione el elemento de menú duplicado.

En esta nueva selección, sel01, haga clic en A y seleccione el elemento de menú Cambiar nombre. Con el teclado, elimine las letras existentes y escriba active. Esto sigue siendo seleccionar nuestros tres ligandos por lo que tendremos que modificarlo de nuevo, utilizando el botón de acciones A.

Haga clic en el botón, seleccione modificar y expanda la selección en cinco angstroms. Ahora hemos capturado los ligandos y los residuos dentro de cinco angstroms. La S en el botón S significa mostrar.

Haga clic en esto para mostrar la proteína de diferentes maneras. Mostraremos este regaliz como palos. Haga clic en el espacio vacío para borrar la selección.

Esto ha capturado los aminoácidos dentro de cinco angstroms, pero no el agua. Podemos de nuevo, duplicar la selección y ahora modificarla para seleccionar solo el agua. En el botón acciones A, duplicar.

Aparece la selección 2. Cambiemos el nombre de esto a agua activa. Esta vez usaremos el botón A para modificar, alrededor para seleccionar los átomos alrededor de nuestra selección.

Átomos dentro de cuatro angstroms. Esto ha seleccionado el agua pero también algunos átomos de las cadenas laterales. Para modificar esto aún más, utilice el botón A para modificar y restringir al disolvente.

Ahora podemos ver que solo las moléculas de agua están iluminadas. De nuevo en el botón A, podemos aplicar un preset. Seleccione preset, bola y palo y ahora las moléculas de agua se muestran como esferas.

El resultado final del protocolo es un modelo que se ve así con el sitio activo en ligandos mostrados como palos coloreados de forma contrastante. Las líneas de guión amarillas muestran las interacciones de unión polar y los residuos individuales se etiquetan utilizando las selecciones creadas en el panel de objetos de nombres. Los errores en la ejecución del protocolo pueden conducir a resultados subóptimos.

Por ejemplo, toda la proteína que se muestra como palos. Para solucionar problemas, el usuario primero deberá ocultar la representación del stick para toda la estructura. Y luego vuelva a mostrar la representación del stick solo para el objeto llamado activo usando el botón S.

Aquí los modelos generados utilizando cada programa se muestran uno al lado del otro. Aunque hay diferencias en la visualización de la enzima, las mismas características e interacciones clave se pueden ver en cada uno de los cuatro modelos. Un usuario interesado en dominar uno de los programas que contiene una línea de comandos desea aprender a aplicar y modificar comandos escritos.

Como mencioné en el protocolo Jmol, una herramienta útil es una hoja de trucos de comandos. Un archivo de texto sin formato que contiene códigos de uso frecuente para hacer referencia. Para convertirse en un usuario avanzado, es útil comprender qué partes del protocolo se pueden adaptar y modificar.

Con la práctica, estos protocolos se pueden aplicar para modelar cualquier sitio activo enzimático de interés.