Name: Explorando el metiloma de arginina mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprende a cuantificar la metilación de arginina mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear 1H. Este método permite analizar células, tejidos y biofluidos para evaluar biomarcadores en cáncer y otras enfermedades.

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El trabajo fue apoyado por las subvenciones del Fondo Austríaco para la Ciencia (FWF) P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (proyecto emblemático DYNIMO), la Agencia Austriaca de Promoción de la Investigación (FFG) otorga 864690 y 870454, el Centro de Investigación del Metabolismo Integrativo de Graz; Programa de Infraestructura Austriaca 2016/2017, el Gobierno de Estiria (Zukunftsfonds) y el Fondo de Inicio para Talentos de Alto Nivel de la Universidad Médica de Fujian (XRCZX2021020). Agradecemos al Centro de Investigación Médica por el acceso a las instalaciones de cultivo celular. F.Z. se formó en el marco del programa de doctorado Medicina Molecular de la Universidad Médica de Graz. Q.Z. se formó en el marco del programa de doctorado Enfermedades metabólicas y cardiovasculares de la Universidad Médica de Graz.

Se utilizaron hidrolizados de proteínas de levadura como muestras para los resultados representativos de este trabajo. Todo el protocolo se resume en la Figura 1.
1. Preparación de materiales y reactivos
<ol><li>Metanol/agua: prepare una mezcla de dos partes de metanol al 99% (MeOH) y una parte de H2O, designada como MeOH/H2O. Almacene MeOH puro y MeOH/H2Oa -20 °C para minimizar la evaporación del alcohol y aumentar la estabilidad de la muestra.</li>
	<li>Ácido clorhídrico (HCl): diluir 9 mol/L de HCl concentrado (12,0 mol/L o 37%), así como 0,1 mol/L de HCl. La solución de mayor concentración (9 mol/L) se utiliza para la hidrólisis de proteínas, mientras que la de menor concentración (0,1 mol/L) se utiliza para la extracción en fase sólida. PRECAUCIÓN: Trabaje dentro de la campana extractora.</li>
	<li>Prepare una solución de reemplazo para SPE que contenga 10% de una solución de amoníaco saturada (madre: 30% p/p de amoníaco), 50% de metanol y 40% de agua (v/v).</li>
	<li>Tampón de RMN: Disolver 5,56 g de hidrogenofosfato disódico (Na2HPO 4, 0,08 mol/L), 0,4 g de sal sódica (TSP, 5 mmol/L) de ácido 3-(trimetilsilil) propiónico-2,2,3,3-d4 (TSP, 5 mmol/L), 0,04 % (p/v) de azida sódica (NaN3) en 500 ml de dióxido de deuterio (D2O) y ajustar a pH7,4 (usando HCl o NaOH, respectivamente) (véase el cuadro de materiales). Compruebe la pureza de cada nuevo lote de tampón mediante espectroscopia de RMN. NOTA: La cantidad de cualquier contaminante (por ejemplo, etanol) debe ser lo más baja posible.</li>
	<li>Llene los tubos de pulpa con perlas de óxido de circonio (los tubos de 2 ml y las perlas de 1,4 mm son adecuados para la mayoría de las aplicaciones, pero hay diferentes variantes disponibles) (consulte la Tabla de materiales). Llene aproximadamente 10-20 cuentas a mano o compre tubos precargados, que también están disponibles.</li>
	<li>Mantenga las pipetas y las puntas respectivas listas en el rango de 10-1,000 μL. NOTA: Durante todo el trabajo se utilizó agua altamente pura, designada comoH2O, definida por una alta resistencia de ≥18.2 MΩ·cm-1. Corresponde al agua destilada doble.</li>
</ol>2. Recogida y almacenamiento de muestras
<ol><li>Congelar rápidamente las muestras líquidas (suero/plasma, sobrenadante de cultivo celular, etc.) con nitrógeno líquido y almacenarlas a -80 °C hasta su uso.</li>
	<li>Prepare los materiales sólidos como se menciona a continuación.<ol><li>Recolectar las células de cultivos celulares (3-5 millones de células) ya sea recolectando células adherentes, después del lavado con solución salina tamponada con fosfato frío, raspado y centrifugación, o centrifugación directa de células cultivadas en suspensión.</li>
		<li>Retirar los sobrenadantes celulares (que podrían recogerse para su posterior análisis, ya sea mediante medición directa consecutiva, ver paso 6, o después de la precipitación de proteínas solubles, ver paso 3.1), y luego congelar rápidamente los gránulos con nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C. Para un procesamiento posterior, consulte el paso 3.2.</li>
		<li>Almacenar y recoger los tejidos según el objetivo del estudio. Para tejidos muy homogéneos, como el hígado o el músculo, analiza cualquier parte del mismo. Por ejemplo, en el caso de un cerebro de ratón, determine la metilación global de arginina de todo el cerebro o secciones cerebrales. NOTA: El peso ideal de los tejidos a procesar es de 30-60 mg. Es recomendable congelar y pulverizar todo el cerebro y utilizar alícuotas del mismo. Alternativamente, se pueden usar partes específicas del cerebro (por ejemplo, frontal, cerebelo, regiones occipitales o un hemisferio, que pesa ~ 250 mg).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparación preliminar de la muestra
NOTA: Realice el trabajo en hielo, manteniendo el MeOH frío. Las muestras también deben mantenerse en hielo para evitar la degradación de proteínas.
<ol><li>Para muestras líquidas, añadir 400 μL de metanol helado a 200 μL de la muestra. Continúe con el paso 3.3. NOTA: Si hay menos muestra disponible, ajuste los volúmenes en consecuencia; La sensibilidad a la RMN suele ser lo suficientemente alta para cantidades de muestra más pequeñas, pero debe probarse individualmente.</li>
	<li>En el caso de materiales sólidos, preparar suficientes tubos de 1,5 ml para los lisados (uso para centrifugación después de la homogeneización).<ol><li>Con cuidado, pero a fondo, resuspender los gránulos celulares en 600 μL de MeOH/H2Oy transferir toda la fase líquida a los tubos de pulpa.</li>
		<li>Coloque los pañuelos en tubos de pulpa (puede pesarlos directamente en los tubos) y agregue 600 μL de MeOH / H2O (para 30-60 mg; ajuste si el peso difiere sustancialmente).</li>
		<li>Coloque los tubos en el homogeneizador de tejidos (consulte la Tabla de materiales) y homogeneice una vez durante 20 s con agitación intensa (para gránulos celulares, tejidos blandos) o dos veces durante 20 s cada uno (o más si es necesario) con un intervalo de 5 minutos entre ellos (para tejidos rígidos).</li>
		<li>Después de la homogeneización, vuelva inmediatamente a colocar las muestras en el hielo y transfiera todo el lisado a nuevos tubos de 1,5 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Almacenar las muestras durante al menos 30 minutos (hasta varios días) a -20 °C antes de procesarlas.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C. Mientras tanto, prepare suficientes tubos de 1,5 ml para recoger los sobrenadantes. NOTA: Este sobrenadante (designado "(1)" en la Figura 1) puede descartarse, liofilizarse y procesarse directamente para RMN (paso 6) o analizarse de otra manera.</li>
	<li>En este protocolo, el precipitado de MeOH (= pellet obtenido después del paso 3.1 o 3.2.2, respectivamente) se utiliza para análisis adicionales que contienen, entre otras cosas, componentes tales como ácidos nucleicos y lípidos, proteínas metiladas por arginina. Continuar con hidrólisis proteica o conservar los gránulos a -20 °C durante unos días.</li>
</ol>4. Hidrólisis de proteínas
<ol><li>Añadir 500 μL de 9 mol/L de HCl a cada muestra. Luego, trunque las tapas de cada tubo con tijeras y colóquelas en los tubos de cultivo de vidrio (Figura 2A). Con cuidado, pero con fuerza, cierre las tapas rojas (verificando así el sellado). NOTA: Antes de usar, siempre revise cada sellado (lámina de PTFE gris dentro de los tapones de rosca rojos) para que esté aprietando adecuadamente y límpielos regularmente con agua.</li>
	<li>Cuando termine, coloque los tubos en un vaso de precipitados parcialmente lleno de arena (para una mejor transferencia de calor) e hidrolice las muestras durante aproximadamente 16 h a 110 ° C en una cámara de secado.</li>
	<li>Después de la hidrólisis, enfriar las muestras (~1 h).</li>
	<li>Después de eso, liofilizar durante la noche usando una centrífuga con un alto vacío (por debajo de 100 Pa).</li>
	<li>Disuelva los pellets, si están completamente secos (si no, continúe la liofilización), en 1 ml de HCl de 0,1 mol/L y agregue 50 μL de cloroformo (CHCl3) a cada tubo; Disuelva completamente el pellet con una pipeta de 1.000 μL, mezclando así los líquidos, y luego transfiera el volumen completo a un nuevo tubo. PRECAUCIÓN: Siempre trabaje con pequeñas cantidades para minimizar la evaporación extensa</li>
	<li>Luego, centrifugar a 8,000 x g durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Recoja cuidadosamente la fase superior del líquido bifásico que contiene la fracción soluble en agua (Figura 2B, la fracción con la densidad más baja) con una pipeta y llénela en tubos nuevos. Utilice tubos de 1,5 ml para SPE manual (sección 5.2) o viales de vidrio para SPE robótica (sección 5.3 y figura 2D). Evite derramar sobre CHCl3 y su contenido (Figura 2C).</li>
</ol>5. Extracción en fase sólida (SPE)
<ol><li>Antes del primer uso, limpie los cartuchos SPE dos veces con 1 ml de la solución de reposición (paso 1.3) seguido de centrifugación a 800 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente (colocado en tubos de 15 ml). Se pueden usar 10-20 veces cada uno.</li>
	<li>Manual SPE<ol><li>Acondicione previamente los cartuchos (consulte la Tabla de materiales) en cada serie con 1 ml de metanol puro y 2 x 1 ml de PBS, cada vez seguido de centrifugación a 800 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente (colocado en tubos de 15 ml).</li>
		<li>Después, cargue las muestras (del paso 4.7) en los cartuchos SPE y centrifugarlas a 600 x g durante 2 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Luego, aplique un ciclo de lavado como se menciona a continuación.<ol><li>Añadir tres veces 1 ml deH2O(cada uno seguido de centrifugación durante 1 min a 800 x g a temperatura ambiente).</li>
			<li>Añadir cinco veces 1 ml de HCl de 0,1 mol/L (cada uno seguido de centrifugación durante 1 minuto a 800 x g a temperatura ambiente).</li>
			<li>Añadir dos veces 1 ml de MeOH (cada uno seguido de centrifugación durante 1 min a 800 x g a temperatura ambiente).</li>
		</ol></li>
		<li>Luego, eluir la arginina y sus derivados con 3 x 1 ml de solución de reemplazo (seguida de centrifugación 1 min a 800 x g a temperatura ambiente) en un solo tubo de 15 ml. NOTA: La solución de reemplazo sirve como eluyente para arginina y derivados y también se usa para limpiar los cartuchos (todas las sustancias se lavan antes de la elución o al valor de pH básico de la solución de reemplazo). Aún así, para evitar la contaminación con el tiempo, la reutilización debe limitarse (ver paso 5.1).</li>
	</ol></li>
	<li>SPE robótico NOTA: Aquí, un robot de pipeteo (la parte principal que consiste en una aguja de pipeteo, una estación de lavado para la aguja, un suministro de reactivo y posiciones para muestras y eluidos, consulte la Tabla de materiales) se suministra con un soporte de cartucho para las columnas SPE. Para otros instrumentos, asegúrese de estar completamente equipado con todas las cosas enumeradas.<ol><li>Llene el sobrenadante (a partir del paso 4.7) directamente en viales de vidrio con sellado de PTFE (Figura 2D), prepare suficientes reactivos (100 ml de cada uno, es decir, solución de reemplazo, 99% de MeOH, PBS,H2Oy 0,1 de mol/L HCl), tubos de 5 ml para la elución y solución de lavado para la aguja del robot (generalmenteH2O).</li>
		<li>Utilice una aplicación o método en el software del robot basado precisamente en los pasos descritos para SPE manual (paso 5.2). NOTA: Los detalles pueden variar mucho entre los proveedores de instrumentos, así que consulte el manual de software del robot respectivo para la programación. Un robot de pipeteo generalmente funciona aplicando presión de aire sobre los cartuchos en lugar de centrifugación, que es la principal diferencia. Si el protocolo se establece y se ejecuta por primera vez, incluya controles (por ejemplo, L-arginina de concentración conocida) para verificar un flujo de trabajo óptimo.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Preparación final para la RMN
<ol><li>Liofilizar las muestras durante la noche para completar la sequedad para eliminar el amoníaco yH2O.</li>
	<li>Disolver cada muestra en 500 μL de tampón de RMN (paso 1.4) y transferir a tubos de RMN. Es importante destacar que el volumen debe ser el mismo en todos los tubos, y las muestras deben ser homogéneas (libres de residuos y lípidos, que tienden a agregarse). NOTA: Los detalles de la espectroscopia de RMN van más allá de esta revisión del método y se describen con más detalle en otra parte27. Aquí, solo se explican los principales requisitos y pasos. La cuantificación de la arginina y sus metabolitos se realiza en un espectrómetro de RMN de 600 MHz (ver Tabla de materiales). En principio, se puede utilizar cualquier otro espectrómetro de RMN/intensidad de campo de RMN, siempre que las señales de RMN de arginina y argininas metiladas puedan detectarse con suficiente sensibilidad y sin superposición de señales. Se puede utilizar cualquier cabezal de sonda con gradientes de eje z capaz de registrar espectrosH de 1, siempre que las secuencias de pulsos se configuren en consecuencia.</li>
	<li>Registre un espectro 1D utilizando la secuencia de pulsos CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill)33,34 (cpmgpr1d, 512 escaneos, tamaño de fid 73728, ancho espectral de 11904.76 Hz en una RMN de 600 MHz, retardo de reciclaje 4 s) con supresión de señal de agua mediante presaturación.</li>
	<li>En estos experimentos, elimine los acoplamientos escalares de 1H mediante el desacoplamiento virtual, reduciendo la superposición de señales. Registrar adicionales para preguntas específicas y/o muestras o matrices complejas, por ejemplo, 1espectro de coherencia cuántica simple (HSQC) H-13C-heteronuclear27. NOTA: Para matrices más complejas en las que las señales de RMN 1H de argininas metiladas podrían superponerse parcialmente con señales de RMN 1 H de otros metabolitos (por ejemplo, lisina), se requieren espectros homonucleares J (JRES)35 de 1H. </li>
	<li>Realizar la cuantificación absoluta integrando las respectivas intensidades máximas de los patrones de una concentración conocida, por ejemplo, 100 μmol/arginina. NOTA: Rutinariamente, ADMA, SDMA y MMA (ver Tabla de materiales) se informan como una proporción relativa a la arginina. Esto tiene la ventaja significativa de que no es necesario realizar una normalización separada (por ejemplo, número de células, masa tisular, concentraciones de proteínas). En ese caso, la arginina sirve como un estándar interno, y la cuantificación relativa es suficiente para obtener información biológicamente relevante.</li>
	<li>Para la diferenciación de SDMA y MMA, liofilizar las muestras nuevamente para deshacerse deD2O(si han sido resuspendidas en tampón de RMN anteriormente), que luego es reemplazado por dimetilsulfóxido deuterado (d6-DMSO), permitiendo la resolución de resonancias metílicos27. Por lo tanto, aspirar las muestras de los tubos de RMN con pipetas Pasteur, liofilizar y disolverlas en 500 μL de d6-DMSO.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

En la siguiente sección, el enfoque principal radica en el método en sí; las implicaciones biológicas de la metilación de la arginina se describen en la sección Introducción.
En primer lugar, los tejidos de diferente rigidez pueden necesitar un ajuste de la lisis de la muestra: las células del cultivo celular (incluidas bacterias, levaduras, etc.) y tejidos como el cerebro, el hígado joven, el músculo liso, etc., pueden homogeneizarse rápidamente. Para tejidos de alta rigidez (incluyendo hígad...

Durante las últimas dos décadas, la metilación de los residuos de arginina ha sido reconocida como una modificación posttraduccional esencial de las proteínas. Afecta a procesos biológicos fundamentales como la regulación de la transcripción, la transducción de señales y muchos más1. Las principales proteínas implicadas en la regulación de la metilación de la arginina son las proteínas arginina metiltransferasas (PRMTs)2. Los principales derivados de la arginina son ω-(N G,N G)-dimetilarginina asimétrica (ADMA), ω-(N G,N'G)-dimetilarginina simétrica (SDMA), y ω-N G-monometilarginina (MMA)2.
Los PRMT utilizan S-adenosil-l-metionina para transferir grupos metilo al grupo guanidino terminal (con dos grupos amino equivalentes) de arginina1 unida a proteínas. Se pueden distinguir dos enzimas principales: tanto las enzimas de tipo I como las de tipo II catalizan el primer paso de metilación para formar MMA (que por lo tanto pierde su simetría). Después de este paso, las enzimas de tipo I (por ejemplo, PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) utilizan MMA como sustrato para formar ADMA, mientras que las enzimas de tipo II (principalmente PRMT5 y PRMT9) producen SDMA. PRMT1 fue la primera proteína arginina metiltransferasa aislada de células de mamíferos3. Aún así, los PRMT se han conservado evolutivamente4 en otros animales como vertebrados no mamíferos, cordados de invertebrados, equinodermos, artrópodos y nematodos cnidarios5, plantas6 y protozoos, incluidos hongos como la levadura7. En muchos casos, el knockout de uno de los PRMT conduce a la pérdida de viabilidad, revelando el papel esencial de las especies de arginina metilada involucradas en procesos celulares fundamentales como la transcripción, traducción, transducción de señales, apoptosis y separación de fase líquido-líquido (es decir, la formación de orgánulos sin membrana, por ejemplo, nucléolos), que regularmente involucra dominios ricos en arginina 8,9,10 . A su vez, esto influye en la fisiología y los estados de enfermedad, incluyendo cáncer 11,12,13, mieloma múltiple 14, enfermedades cardiovasculares15, patogénesis viral, atrofia muscular espinal 16, diabetes mellitus 17 y envejecimiento1. Se cree que el aumento de los niveles de ADMA en el torrente sanguíneo, por ejemplo, derivado del pulmón18 debido a la descomposición de proteínas, está relacionado con la disfunción endotelial, la enfermedad pulmonar crónica19 y otros síndromes de enfermedad cardiovascular20. Se ha encontrado que la sobreexpresión de PRMT acelera la tumorigénesis y se asocia con mal pronóstico21,22. Además, la ablación de PRMT6 y PRMT7 desencadena un fenotipo de senescencia celular23. Se ha encontrado una disminución significativa de ADMA y PRMT1 durante el envejecimiento de los fibroblastos WI-3824.
El desafío es comprender cómo actúa la metilación en los procesos (pato)fisiológicos identificando y cuantificando la metilación de la proteína arginina. La mayoría de los enfoques actuales utilizan anticuerpos para detectar argininas metiladas. Sin embargo, estos anticuerpos siguen siendo específicos del contexto y podrían no reconocer diferentes motivos de proteínas metiladas con arginina25,26. En el protocolo descrito, todos los derivados de arginina mencionados anteriormente pueden ser cuantificados de manera confiable por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), es decir, solos, en combinación o, como en la mayoría de los casos, dentro de matrices biológicas complejas como células eucariotas (por ejemplo, de levadura, ratón u origen humano) y tejidos27, así como suero28. Para las proteínas y esas matrices complejas, la hidrólisisde proteínas 29 es un requisito previo para generar aminoácidos libres (modificados), como arginina, MMA, SDMA y ADMA. La extracción en fase sólida (SPE)30 permite el enriquecimiento de los compuestos de interés. Finalmente, la espectroscopia de 1H-RMN permite la detección paralela de arginina y todos los principales derivados metílicos de la arginina. La espectroscopia de RMN tiene la ventaja de que es genuinamente cuantitativa, altamente reproducible y una técnica robusta31,32. Las mediciones finales de RMN se pueden hacer después cuando se hayan recogido y preparado muchas muestras. Finalmente, este protocolo se centra principalmente en la preparación de muestras, ya que no requiere un espectrómetro de RMN propio. Se puede realizar en la mayoría de los laboratorios bioquímicos. Aún así, en este trabajo se proporcionan algunas pistas sobre qué mediciones de espectroscopia de RMN se deben realizar.

<table><tbody><tr><td>Tubos de 15 mL</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimetilsilil) ácido propiónico-2,2,3,3-d4 sal sódica (TSP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A1448</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 5 mL, fondo redondo</td><td>Greiner Bio One</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>solución de amoníaco 32%</td><td>Roth</td><td>A990.1</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Espectrómetro de RMN de 600 MHz, equipado con un cabezal de sonda TXI</td><td>Bruker</td><td>- </td><td></td></tr><tr><td>Centrífugas, refrigeradas, p. ej. 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000010</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo &ge; 99% p.a.</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr><td>Cryocool</td><td>Thermo Scientific</td><td>SCC1</td><td>fluido de transferencia de calor para el sistema SpeedVac</td></tr><tr><td>Óxido de deuterio (D2O)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-10-PK</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido-d6 (d6-DMSO)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>Aglutinante</td> de<td>cámara de secado</td><td>9090-0018</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo DARAN, 13 x 100 mm, GL 14, 9 mL</td><td>VWR International</td><td>212-0375</td><td></td></tr><tr><td>Edwards Bomba de aceite de vacío profundo RV5</td><td>Thermo Scientific</td><td>16234611</td><td>parte del sistema SpeedVac</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf de 1,5 ml</td><td>Greiner Bio One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Gilson robot de pipeteo GX-241 Aspec</td><td>Gilson Inc.</td><td></td><td></td>26150008</tr><tr><td>L-arginina</td><td>AppliChem</td><td>A3675</td><td></td></tr><tr><td>Metanol &ge; 99%</td><td>Roth</td><td>8388.4</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q aparatus de agua</td><td>Millipore</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 1cc/30 mg, cartuchos de 1</td><td>mL Waters</td><td></td><td>186000252 https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/</td></tr> <tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Lonza</td><td>LONBE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 homogeneizador de tejidos</td><td>Bertin Instrumentos</td><td>P000669-PR240-A</td><td>https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/</td></tr> <tr><td>Tubos Precellys (tubos de fabricación de pulpa)</td><td>VWR International</td><td>432-0351</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de óxido de circonio Precellyse de 1,4 mm</td><td>VWR International</td><td>432-0356</td><td></td></tr><tr><td>Reacti-Therm/ReactiVap Módulos de calentamiento, agitación y evaporación</td><td>Thermo Scientific</td><td>TS-18820</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 Rotor para tubos de 1,5 mL, FA-45-30-11</td> Trampa de enfriamiento refrigerada <td>Eppendorf</td><td>5427753001</td><td></td></tr><tr><td>Savant</td><td>Thermo Scientific 15996161</td><td></td><td>parte del sistema SpeedVac</td></tr><tr><td>Concentrador de vacío Savant SpeedVac SPD210</td><td>Thermo Scientific</td><td>15906181</td><td>parte del sistema SpeedVac; equipado con rotor para tubos de 1,5 ml</td></tr><tr><td>Tapones de rosca para viales de vidrio con sellado de PTFE, DN9</td><td>Dr. R. Forche Cromatographie</td><td>CT11B3011</td><td></td></tr><tr><td>Seasand</td><td>Roth</td><td>8441.3</td><td></td></tr><tr><td>Viales de vidrio de rosca corta 1,5 mL, ND9</td><td>Dr. R. Forche Cromatografía</td><td>VT1100309</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio (NaN3)</td><td>Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>VWR</td><td>BDH7363-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>80731-078</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 4.0 (Software)</td><td>Bruker-https://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-dimetilarginina asimétrica (ADMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-208093</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-monometilarginina (MMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200739A</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-NG'-dimetilarginina simétrica (SDMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202235A</td><td></td></tr></tbody></table>

explorando el metiloma de arginina mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

La arginina unida a proteínas se metila comúnmente en muchas proteínas y regula su función alterando las propiedades fisicoquímicas, su interacción con otras moléculas, incluidas otras proteínas o ácidos nucleicos. Este trabajo presenta un protocolo fácilmente implementable para cuantificar la arginina y sus derivados, incluyendo dimetilarginina asimétrica y simétrica (ADMA y SDMA, respectivamente) y monometil arginina (MMA). Después del aislamiento de proteínas de fluidos biológicos corporales, tejidos o lisados celulares, se describe un método simple para la homogeneización, precipitación de proteínas e hidrólisis de proteínas. Dado que los hidrolizados contienen muchos otros componentes, como otros aminoácidos, lípidos y ácidos nucleicos, es esencial un paso de purificación mediante extracción en fase sólida (SPE). SPE se puede realizar manualmente utilizando centrífugas o un robot pipeteador. La sensibilidad para ADMA utilizando el protocolo actual es de aproximadamente 100 nmol / L. El límite superior de detección de arginina es de 3 mmol / L debido a la saturación de SPE. En resumen, este protocolo describe un método robusto, que abarca desde la preparación de muestras biológicas hasta la detección basada en RMN, proporcionando valiosos consejos y dificultades para un trabajo exitoso al estudiar el metiloma de arginina.

Rutinariamente , lasproyecciones 1 H 1D de espectros de RMN 2D resueltos en J (JRES) virtualmente desacoplados se utilizan para asignaciones de picos y cuantificaciones en nuestro laboratorio36. La Figura 3 muestra espectros representativos de JRES de hidrolizados de proteínas de levadura purificados utilizando el presente protocolo SPE. Aunque en concentraciones muy diferentes, ambas sustancias pueden separarse y cuantificarse en una matriz celular. Basado...

El presente protocolo describe la preparación y medición cuantitativa de arginina y metilargininas libres y unidas a proteínas mediante espectroscopia de RMN-1H.

Explorando el metiloma de arginina mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction ...

Este protocolo permite cuantificar los niveles y la dinámica de la metilación de la arginina. Esta modificación juega importantes funciones reguladoras y podría servir como un biomarcador para la enfermedad. La ventaja de este método es que proporciona un flujo de trabajo simple para un número casi ilimitado de matrices que van desde células, medios hasta tejidos y biofluidos.La metilación de la arginina está elevada en muchos cánceres humanos y los primeros inhibidores de las transferasas del método de arginina se prueban en ensayos clínicos. Este método podría ayudar con la estratificación de los pacientes y la evaluación del riesgo. Demostrando el procedimiento estará Hansjorg Habisch, un técnico de investigación de mi laboratorio.Para muestras líquidas, agregue 400 microlitros de metanol helado a 200 microlitros de la muestra seguido de incubación durante 30 minutos a menos 20 grados centígrados. Centrifugar esta muestra a 10, 000 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Mueva el sobrenadante y recoja el pellet en tubos de 1,5 mililitros.Para materiales sólidos, agregue 600 microlitros de agua con metanol al 66% en tubos de pulpa que contengan de 30 a 60 miligramos de tejido o gránulos celulares. Homogeneice el tejido blando una vez durante 20 segundos y el tejido rígido dos veces durante 20 segundos con un intervalo de cinco minutos entre ellos. Coloque inmediatamente la muestra en hielo y transfiera todo el lisado a un nuevo tubo de 1,5 mililitros, seguido de incubación.Luego, centrifugar la muestra a 10, 000 G durante 30 minutos. A cuatro grados centígrados, seleccione el sobrenadante en tubos de 1,5 mililitros y proceda con la hidrólisis de proteínas utilizando este sobrenadante. Truncar las tapas de cada tubo.Luego agregue 500 microlitros de nueve molares de ácido clorhídrico a cada muestra. Finalmente, coloque los tubos en tubos de vidrio. Ciérrelos con tapas herméticamente, asegurando un sellado adecuado, y coloque estos tubos en un vaso de precipitados de vidrio parcialmente lleno de arena.Hidrolizar las muestras durante 16 horas a 110 grados centígrados en una cámara de secado. Enfriar las muestras y liofilizarlas durante la noche utilizando una centrífuga de alto vacío. Al día siguiente, disuelva los gránulos completamente secos en un mililitro de ácido clorhídrico molar 0.1.Agregue 50 microlitros de cloroformo a cada tubo y disuelva completamente el pellet con una pipeta de 1.000 microlitros. Transfiera el volumen completo a un tubo nuevo y centrifugue las muestras durante 10 minutos. Recoja cuidadosamente la fase superior del líquido bifásico en un tubo nuevo.Utilice tubos de plástico para la extracción manual o de vidrio para la extracción robótica en fase sólida. Para la extracción manual en fase sólida, acondicione previamente los cartuchos en cada ejecución seguida de una centrifugación de un minuto. Después de eso, cargue la muestra en cartuchos SPE y centrifuércelos a 600 G durante dos minutos a temperatura ambiente.Lave los cartuchos con un mililitro de agua tres veces, cada lavado seguido de centrifugación durante un minuto. Luego lavar cinco veces con un mililitro de ácido clorhídrico molar 0.1, seguido de centrifugación durante un minuto a 800 G a temperatura ambiente. Lave los cartuchos dos veces con un mililitro de metanol seguido de centrifugación durante un minuto.Eluya la arginina y sus derivados en un solo tubo de 15 mililitros agregando un mililitro de solución de reemplazo de tres X y centrifugar dos veces durante un minuto. Para la extracción robótica en fase sólida, coloque tubos para la recolección de eluidos y los tubos de vidrio que contienen la fase superior del líquido bifásico en la posición respectiva del robot. Utilice una aplicación o método en el software basado en los pasos descritos para SPE manual.Liofilizar las muestras durante la noche para que se sequen completamente para eliminar el amoníaco y el agua. Disuelva cada muestra en 500 microlitros de tampón de RMN hasta que sea homogénea. Luego transfiera una cantidad igual de muestra homogénea a cada tubo de RMN.Aquí se muestran los espectros J-RES de hidrolizados de proteínas de levadura purificados utilizando el protocolo SPE. Diferentes cambios químicos característicos pueden discriminar L-arginina y ADMA a 3.25 y 3.02 partes por millón. Ambas sustancias pueden separarse y cuantificarse en una matriz celular.Basado en el número de protones del grupo metilo o metileno específico en el cambio químico respectivo, una espectroscopia de resonancia magnética nuclear H permite una cuantificación precisa. Usando este enfoque, los cambios químicos de resonancia magnética nuclear de H de SDMA y MMA se pueden separar y cuantificar mediante cambios químicos característicos a 2.76 partes por millón de SDMA y 2.74 partes por millón de MMA. Al realizar este protocolo, recoja cuidadosamente la fase superior del líquido bifásico que contiene la fracción soluble en agua con una pipeta y transfiérala a nuevos tubos.Utilice tubos de 1,5 mililitros para SPE manual o vidrio de clase para SPE robótico. Evite derramar sobre el cloroformo y su contenido. Los eluidos que contienen arginina y las especies de arginina metilada se analizan mediante espectroscopia de RMN.Esto produce cantidades absolutas de estas especies. Nuestra tecnología se utiliza actualmente en una gran cantidad de proyectos de investigación básica destinados a diseccionar el papel fisiopatológico de la metilación de la arginina. Además, estamos evaluando la metilación de la proteína arginina como candidato a biomarcador en varias enfermedades humanas.

exploring-arginine-methylome-nuclear-magnetic-resonance

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Se describen dos métodos para asignar las señales de resonancia magnética nuclear de α y ε-dimetilamina de una lisina N-terminal reductivamente metilada con 13C. Un método utiliza la selectividad inducida por el pH de la reacción de metilación reductora, y el otro utiliza la aminopeptidasa para eliminar selectivamente la lisina N-terminal.

Métodos para identificar las resonancias de RMN de la amina 13C-dimetilN-terminal en proteínas metiladas reductivamente

Proteína arginina metilación, catalizada por una clase de enzimas viz., La proteína arginina metil transferasas (PRMTs), es el proceso de adición enzimática de grupo (s) metilo para argininas dentro de las proteínas. El ensayo de metilación in vitro es la herramienta más fiable para evaluar el estado de metilación de sustratos PRMT conocidos o nuevos.

In vitro metilación de ensayo para estudiar la proteína arginina metilación

Las matrices de péptidos sintetizadas por el método SPOT se pueden utilizar para analizar la especificidad del sustrato de las proteínas lisina metiltransferasas (PKMTs) y para definir el espectro de sustrato de las PKMT para comprender su papel biológico. Este protocolo describe cómo sintetizar matrices de péptidos, metilarlas con PKMT y analizar los resultados.

Análisis de la especificidad de la proteína lisina metiltransferasas Usando SPOT Péptido Arrays

La metilación del ADN es capaz de mantener niveles estables de expresión génica, así como de permitir cambios dinámicos en la expresión génica en respuesta a una variedad de estímulos. Detallamos técnicas que permiten el estudio de los cambios específicos de genes en la metilación del ADN y el efecto de estos cambios en la expresión génica.

La correlación de Gene-específica de ADN de metilación cambios con la expresión y actividad transcripcional de astrocíticos<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

Este protocolo describe la reconstitución de los nucleosomas que contienen histonas hermana marcados con isótopos diferencialmente. Al mismo tiempo, los nucleosomas asimétricamente después de la traducción modificados pueden ser generados después de usar una copia de la histona premodified. Estas preparaciones se pueden utilizar fácilmente para estudiar los mecanismos de modificación de diafonía, simultáneamente en ambos histonas hermanas, mediante el uso de la espectroscopia de RMN de alta...

La reconstitución de los nucleosomas con histonas hermanas marcadas con isótopos diferencialmente

La proteína arginina (R)-metilación es una modificación postraduccional muy extendida que regula múltiples vías biológicas. La espectrometría de masas es la mejor tecnología para perfilar globalmente el R-metil-proteoma, cuando se combina con enfoques bioquímicos para el enriquecimiento peptídico modificado. El flujo de trabajo diseñado para la identificación de alta confianza de la R-metilación global en células humanas se describe aquí.

Un enfoque proteómico basado en espectrometría de masas para el análisis global y de alta confianza de la proteína R-metilación

Estos protocolos proporcionan la metodología utilizada para evaluar la actividad enzimática de los miembros individuales de la familia de la proteína arginina metiltransferasa (PRMT) en las células. Las pautas detalladas en la evaluación de actividad de PRMT usando los biomarkers endógenos y exógenos, los anticuerpos de reconocimiento de la metílico-arginina, y los compuestos de la herramienta del inhibidor se describen.

Métodos cuantitativos para estudiar la actividad de la arginina metiltransferasa de la proteína 1-9 en células

Aquí, presentamos un protocolo que detalla la adquisición, el procesamiento y el análisis de una serie de experimentos de RMN destinados a caracterizar las interacciones proteína-glicano en solución. Se describen las metodologías más comunes basadas en ligandos y proteínas, que sin duda contribuyen a los campos de la glicobiología estructural y los estudios de reconocimiento molecular.

Desenredando las interacciones glicano-proteína: la resonancia magnética nuclear (RMN) al rescate

Aquí presentamos un protocolo para evaluar de forma semicuantitativa los niveles globales de m⁶A usando dot blot. El ARN total se extrae, desnaturaliza, se mancha en una membrana de nylon, se sondea con anticuerpo anti-m⁶A y se visualiza mediante quimioluminiscencia. La intensidad de la señal, cuantificada mediante análisis en escala de grises ImageJ, refleja la abundancia relativa de metilación, proporcionando un flujo de trabajo reproducible para la investigación.

Ensayo de blot de punto para detectar niveles globales de modificación del ARN N 6-metiladenosina

La polarización nuclear dinámica con la posterior disolución de la muestra ha permitido estudios en tiempo real del metabolismo en sistemas biológicos. Se utilizó piruvato hiperpolarizado [1-13C] para estudiar la actividad de la lactato deshidrogenasa en una línea celular de carcinoma de próstata in vitro.

hiperpolarizado 13 C metabólico espectroscopía de resonancia magnética e Imagen

Aprende a cuantificar la metilación de arginina mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear 1H. Este método permite analizar células, tejidos y biofluidos para evaluar biomarcadores en cáncer y otras enfermedades.

Explorando el metiloma de arginina mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear

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