Name: Un modelo de ratón BALB/c neonatal de enterocolitis necrosante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Aprenda a establecer un modelo de enterocolitis necrosante en ratones BALB/c neonatales para investigar respuestas de células T Th2. Este método permite estudiar mecanismos inmunes y características clínicas similares a las observadas en lactantes prematuros.

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Los autores agradecen al Banco de Recursos Biológicos Clínicos del Centro Médico de Mujeres y Niños de Guangzhou por proporcionar la muestra clínica y al Centro de Animales de Laboratorio de Guangzhou Forevergen Biosciences por proporcionar ratones. Esta investigación fue apoyada por la fundación de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 81770510 (R.Z.).

Esta investigación fue aprobada por el Comité de Ética Médica del Centro Médico de Mujeres y Niños de Guangzhou (NO. 174A01) y el Comité de Ética Animal del Centro de Animales de Laboratorio de Guangzhou Forevergen Biosciences (IACUC-G160100). Todos los animales fueron criados en la misma habitación en un ambiente específico libre de patógenos (SPF), y los experimentos se llevaron a cabo en un ambiente convencional. Los ratones utilizados para la cría tenían 7-8 semanas de edad; los ratones para inducir NEC (n = 72) se separaron de la presa el día 4, y las presas (n = 14) se mantuvieron en la jaula original y amamantaron a los ratones del grupo de control (Cont.) (n = 24).
1. Preparación de reactivos y dispositivos
<ol><li>Preparar el sustituto de la leche para los ratones BALB/c en la proporción correspondiente (leche en polvo prematura para bebés: leche de cabra en polvo = 2:1). NOTA: Las composiciones nutricionales finales de la leche de fórmula12 se muestran en la Tabla 1.</li>
	<li>Solución de LPS (2,5 mg/ml)<ol>
<li>Disolver un total de 10 mg de polvo de LPS en 4 ml de agua esterilizada de doble destilación, mezclar bien y almacenar en un refrigerador a -20 °C después de la alícuota. NOTA: La solución de LPS se almacena en la oscuridad a 2-8 °C para uso inmediato o a -20 °C para almacenamiento a largo plazo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Inducir enterocolitis necrosante en ratones BALB/c neonatales
<ol><li>Alimentar a los ratones neonatales.<ol>
<li>Mantenga a los ratones neonatales en la misma jaula con la presa, amamantados por la presa en los días 0-4.</li>
		<li>En la noche del día 4 (cuando los ratones neonatales pesan 2.5-3 g), separe a los ratones neonatales en el grupo NEC de la presa para inducir NEC, manténgalos en una incubadora de animales y aliméntelos con fórmula. Sin embargo, al grupo cont. se le permite quedarse y ser alimentado por la presa. NOTA: Los ratones neonatales que están separados de la presa deben ser criados en una incubadora debido a su débil regulación de la temperatura corporal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare el tubo de sonda remojándolo en recipientes de alcohol al 75% durante 1-2 minutos y lávelos dos veces en agua limpia y doble destilada. NOTA: Para evitar la contaminación cruzada entre los ratones, el proceso anterior debe realizarse después de alimentar a cada ratón.</li>
	<li>Inducir el modelo NEC.<ol>
<li>Tome los ratones neonatales de la presa el día 4 y ayunarlos durante una noche.</li>
		<li>Gavage los ratones con LPS (20-30 μL a la vez) y aliméntelos con fórmula el día 5 (40-50 μL a la vez).</li>
		<li>A partir del día 5, someta a los ratones a un ciclo de hipoxia-reoxigenación-frío-choque dos veces al día durante 5 días. Coloque los ratones en un dispositivo de hipoxia al 5% de O2 durante 90 s y reoxigenarlos durante 3 min; repita este proceso cinco veces. A continuación, coloque los ratones en un ambiente de 4 ° C durante 15 minutos y luego transfiéralos a una incubadora. Ver Figura 1A,B para el proceso de inducción. NOTA: Se realizó un ciclo de hipoxia-reoxigenación-estimulación en frío una vez por la mañana y otra por la tarde. Se preparó una mezcla de 5% de O2 con 95% de N2 en el recipiente, y la concentración se midió con un detector de oxígeno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Observe de cerca a todos los ratones, peséelos todos los días, registre la supervivencia de los ratones durante el período de inducción y registre las características de las heces (con o sin heces pegajosas / heces con sangre). NOTA: El modelo NEC establecido tiene una duración de 5 días.</li>
	<li>El día 10 o antes, cuando los ratones muestren síntomas de NEC (íleo, hematoquecia, diarrea)13, eutanasiar a los ratones mediante anestesia por inhalación con isoflurano, luego recolectar inmediatamente el tejido intestinal. No recolecte tejidos de los ratones que murieron espontáneamente. NOTA: En este estudio, el punto final de la eutenasia del ratón se adaptó cuando el ratón mostró hematoquecia y cianosis de todo el cuerpo.</li>
</ol>3. Gavage el ratón
<ol><li>Fije la cabeza del ratón, sosteniendo la sonda gástrica en la mano derecha. Inserte la sonda gástrica desde la esquina izquierda de la boca del ratón. NOTA: La cabeza se fijó con el dedo índice en la cabeza del ratón y se presionó suavemente hacia atrás y hacia abajo para evitar que el ratón se doblara hacia adelante durante la operación y afectara la inserción del tubo gástrico.</li>
	<li>Mueva lentamente el tubo hacia el centro de la boca. Después de insertar el tubo aproximadamente 2-3 cm, empuje 40-50 μL de fórmula o 20-30 μL de LPS en el tracto digestivo. Ver Figura 2A,B para la sonda gavage. NOTA: En circunstancias normales, la sonda gástrica se inserta en el tracto digestivo sin problemas. Si el ratón tiene un fuerte reflejo de vómito, el tubo gástrico se ha insertado en la tráquea por error. El tubo gástrico debe extraerse suavemente y dejar que el ratón descanse por un tiempo antes de intentar la sonda de nuevo. Además, el procedimiento de sonda gavage se utiliza para inducir el modelo de NEC antes de la eutanasia de ratones.</li>
</ol>4. Recolecte muestras de tejido intestinal fresco para la tinción de hematoxilina y eosina (H&E)
<ol><li>Sumergir el tejido fresco del íleon del ratón en formalina al 10% durante 24 h.</li>
	<li>Incrustar los tejidos en parafina y cortarlos en secciones de 4 μm.</li>
	<li>Desparafinar las secciones en xileno y rehidratarlas sucesivamente en etanol absoluto, etanol al 95%, etanol al 80%, etanol al 70% y agua destilada, remojando durante 5 min en cada paso. Manche las secciones con solución de hematoxilina durante 5 min y diferéncialas en ácido clorhídrico al 1% en alcohol al 75% durante 5 s. Finalmente, manchelos con solución de eosina durante 1 min. NOTA: Después de la tinción con solución de hematoxilina, se debe diferenciar con ácido clorhídrico al 1% en etanol para eliminar la solución de hematoxilina excesivamente unida y el colorante de hematoxilina citoplasmática. La concentración de ácido clorhídrico al 1% es adecuada para el tejido intestinal.</li>
	<li>Examine la histopatología del tejido intestinal a un aumento de 40x.</li>
</ol>

<ol><li>Horbar, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+and+neonatal+morbidity+among+infants+501+to+1500+grams+from+2000+to+2009%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Mortality and neonatal morbidity among infants 501 to 1500 grams from 2000 to 2009.</a> Pediatrics. 129 (6), 1019-1026 (2012).</li>
<li>Stoll, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+outcomes+of+extremely+preterm+infants+from+the+NICHD+Neonatal+Research+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research Network.</a> Pediatrics. 126 (3), 443-456 (2010).</li>
<li>Neu, J., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Necrotizing enterocolitis.</a> New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).</li>
<li>Sangild, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+Review%3A+The+preterm+pig+as+a+model+in+pediatric+gastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Invited Review: The preterm pig as a model in pediatric gastroenterology.</a> Journal of Animal Science. 91 (10), 4713-4729 (2013).</li>
<li>Cancro, M. P., Sigal, N. H., Klinman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+an+equivalent+clonotype+among+BALB%2Fc+and+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential expression of an equivalent clonotype among BALB/c and C57BL/6 mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 147 (1), 1-12 (1978).</li>
<li>Kuroda, E., Yamashita, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+enhanced+macrophage-mediated+prostaglandin+E2+production+and+its+suppressive+role+in+Th1+activation+in+Th2-dominant+BALB%2Fc+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of enhanced macrophage-mediated prostaglandin E2 production and its suppressive role in Th1 activation in Th2-dominant BALB/c mice.</a> Journal of Immunology. 170 (2), 757-764 (2003).</li>
<li>Fornefett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+clinics%2C+pathologies+and+immune+responses+in+BALB%2Fc+and+C57BL%2F6+mice+infected+with+Streptobacillus+moniliformis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6 mice infected with Streptobacillus moniliformis.</a> Microbes and Infection. 20 (2), 101-110 (2018).</li>
<li>Rosas, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+influences+immune+responses+and+disease+outcome+of+cutaneous+L.+mexicana+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice.</a> International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).</li>
<li>Sproat, T., Payne, R. P., Embleton, N. D., Berrington, J., Hambleton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+preterm+infants+and+the+influence+of+milk+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cells in preterm infants and the influence of milk diet.</a> Frontiers in Immunology. 11, 1035(2020).</li>
<li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis%3A+an+immature+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776(2011).</li>
<li>Afrazi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+pathogenesis+and+treatment+of+necrotizing+enterocolitis%3A+Toll-like+receptors+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">New insights into the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis: Toll-like receptors and beyond.</a> Pediatric Research. 69 (3), 183-188 (2011).</li>
<li>Auestad, N., Korsak, R. A., Bergstrom, J. D., Edmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk-substitutes+comparable+to+rat%27s+milk%3B+their+preparation%2C+composition+and+impact+on+development+and+metabolism+in+the+artificially+reared+rat%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Milk-substitutes comparable to rat's milk; their preparation, composition and impact on development and metabolism in the artificially reared rat.</a> British Journal of Nutrition. 61 (3), 495-518 (1989).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactoferrin-induced+myeloid-derived+suppressor+cell+therapy+attenuates+pathologic+inflammatory+conditions+in+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lactoferrin-induced myeloid-derived suppressor cell therapy attenuates pathologic inflammatory conditions in newborn mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4261-4275 (2019).</li>
<li>MohanKumar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+neonatal+model+of+necrotizing+enterocolitis+caused+by+anemia+and+red+blood+cell+transfusions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A murine neonatal model of necrotizing enterocolitis caused by anemia and red blood cell transfusions.</a> Nature Communications. 10 (1), 3494(2019).</li>
<li>He, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitory+presence+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+neonates+is+critical+for+control+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transitory presence of myeloid-derived suppressor cells in neonates is critical for control of inflammation.</a> Nature Medicine. 24 (2), 224-231 (2018).</li>
<li>Cho, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+pathoimmunology+of+necrotizing+enterocolitis+reveals+novel+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterization of the pathoimmunology of necrotizing enterocolitis reveals novel therapeutic opportunities.</a> Nature Communications. 11 (1), 5794(2020).</li>
<li>Halpern, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+development+of+necrotizing+enterocolitis+in+IL-18-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Decreased development of necrotizing enterocolitis in IL-18-deficient mice.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (1), 20-26 (2007).</li>
<li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP3K2-regulated+intestinal+stromal+cells+define+a+distinct+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche.</a> Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).</li>
<li>Nino, D. F., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotizing+enterocolitis%3A+new+insights+into+pathogenesis+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Necrotizing enterocolitis: new insights into pathogenesis and mechanisms.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 13 (10), 590-600 (2016).</li>
<li>Chuang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cow%27s+milk+protein-specific+T-helper+type+I%2FII+cytokine+responses+in+infants+with+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Allergy+%26+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cow's milk protein-specific T-helper type I/II cytokine responses in infants with necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Allergy & Immunology. 20 (1), 45-52 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

La ECN es la emergencia del sistema gastrointestinal más frecuente para los neonatos, con una alta incidencia y mortalidad, especialmente en prematuros1,2,3. Sin embargo, su patogénesis aún no está clara. Actualmente se cree que el daño de la mucosa, la invasión de patógenos y la alimentación enteral son factores de alto riesgo para NEC3. Hasta la fecha, los animales utilizados para el modelo NEC son prin...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/63252">A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 1 was updated from:
<img alt="Timeline diagram of NEC induction; process includes LPS, formula, hypoxia, reoxygenation stimulation." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63252/63252fig01.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: Induction of the BALB/c NEC model process. (A) The mice in the NEC group were separated from the dam at birth until they were 4 days old (on Day 4) and fasted that night. The NEC model was induced from Day 5 onwards after birth and lasted for 5 days. Intestinal tissue specimens were collected on Day 10 or earlier. The mice in the Cont. group were housed with and nursed by the dam. (B) The sequence of operations for each day after inducing the NEC model. Abbreviations: Cont. = control; NEC = necrotizing enterocolitis; LPS = lipopolysaccharide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63252/63252fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="NEC induction timeline diagram, days after birth, LPS-formula hypoxia reoxygenation protocol" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63252/63252fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: Induction of the BALB/c NEC model process. (A) The mice in the NEC group were separated from the dam at birth until they were 4 days old (on Day 4) and fasted that night. The NEC model was induced from Day 5 onwards after birth and lasted for 5 days. Intestinal tissue specimens were collected on Day 10 or earlier. The mice in the Cont. group were housed with and nursed by the dam. (B) The sequence of operations for each day after inducing the NEC model. Abbreviations: Cont. = control; NEC = necrotizing enterocolitis; LPS = lipopolysaccharide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63252/63252fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63252">A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis</a>. The Representative Results section was&#160;updated.

Erratum: A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

La enterocolitis necrosante (ECN), la enfermedad gastrointestinal (GI) más grave, ocurre en la mayoría de los bebés prematuros (>90%), especialmente en aquellos con muy bajo peso al nacer (VLBW)1. En los lactantes VLBW, la incidencia de la enfermedad oscila entre el 10% y el 12%, y la mortalidad de los niños diagnosticados con ECN se sitúa entre el 20% y el 30%2,3. La causa de la NEC puede estar relacionada con lesiones mucosas, invasión por bacterias patógenas y alimentación intestinal, lo que puede conducir a respuestas inflamatorias y a la inducción de lesiones intestinales en huéspedes susceptibles3. La patogénesis de la NEC no está clara. Investigaciones relevantes muestran que la respuesta inmune del bebé afectado es anormal, y la susceptibilidad genética, la tensión microvascular y los cambios bacterianos intestinales pueden desempeñar un papel importante en la enfermedad3.
El modelo animal NEC es una herramienta indispensable para la investigación sobre la patogénesis de NEC. Las especies animales utilizadas para los modelos NEC son cerdos, ratas y ratones. Sin embargo, debido al largo período de gestación, los ciclos de crecimiento y los altos costos, en los últimos años, los cerdos no han sido la primera opción para los modelos NEC y han sido reemplazados por ratas o ratones4. Como existen diferencias en el fondo inmune de diferentes cepas de ratón5, diferentes estudios necesitan usar diferentes cepas de ratones para establecer modelos animales NEC. Los ratones BALB/c tienen una característica importante; cuando están infectados o hacen frente a daños externos, la polarización de las células TH2 durante la infección en ratones es significativamente más fuerte que la de otras cepas de ratones6,7,8. Las células T auxiliares desempeñan un papel crucial en la aparición y progresión de nec, especialmente en el desarrollo de células TH23,9,10,11. Por lo tanto, este estudio utilizó ratones BALB / c para establecer el modelo NEC, que podría ser útil para la investigación de la enfermedad NEC en células T.

<table><tbody><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.</td><td></td><td></td>100092683</tr><tr><td>Leche de cabra en polvo</td><td>&nbsp; Petag&nbsp;</td><td></td><td></td>71795558417</tr><tr><td>solución de colorante HE</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.</td><td>G1003</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>RWD, Shenzhen Reward Life Technology Co., LTD.</td><td>R510&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Adrich</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Oxígeno médico</td><td>varios</td><td>varios</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>NIKON</td><td>Sistema de imagen NIKON (DS-Ri2)</td><td></td></tr><tr><td>Resina neutra</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.</td><td></td><td></td>10004160</tr><tr><td>Parafina</td><td>varios</td><td>varios</td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo para bebés prematuros</td><td>Abbott</td><td>57430</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.</td><td></td><td></td>10023418</tr><tr><td>Ácido clorhídrico al 1%</td><td>varios</td><td>varios</td><td></td></tr><tr><td>Formalina al 10%</td><td>LEAGENE</td><td>DF0110</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón balb/c neonatal de enterocolitis necrosante

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

La enterocolitis necrosante (ECN) es la enfermedad gastrointestinal (GI) más grave que a menudo ocurre en bebés prematuros, especialmente en bebés de muy bajo peso al nacer, con alta mortalidad y patogénesis poco clara. La causa de la NEC puede estar relacionada con anomalías inflamatorias del sistema regulador inmunitario. Un modelo animal NEC es una herramienta indispensable para la investigación inmune de la enfermedad NEC. Los modelos animales NEC generalmente usan ratones neonatales C57BL / 6J; Los ratones neonatales BALB/c rara vez se utilizan. Los estudios relacionados han demostrado que cuando los ratones están infectados, la diferenciación de células Th2 es predominante en ratones BALB / c en comparación con ratones C57BL / 6J. Los estudios han sugerido que la aparición y el desarrollo de NEC se asocian con un aumento en las células T auxiliares tipo 2 (Th2) y generalmente se acompañan de infección. Por lo tanto, este estudio utilizó ratones BALB/c neonatales para inducir un modelo de NEC con características clínicas similares y cambios patológicos intestinales como los observados en niños con NEC. Se justifica un estudio adicional para determinar si este modelo animal podría usarse para estudiar las respuestas de las células Th2 en NEC.

El modelo NEC de ratón BALB/c fue inducido por la alimentación con fórmula, la alimentación lpS, la hipoxia y la estimulación en frío. Durante el período de inducción, los ratones fueron observados para la patología intestinal, las características de las heces, los cambios en el peso corporal y la supervivencia diaria. Imágenes representativas del intestino delgado durante la inducción de NEC; los números en la imagen representan la puntuación de patología intestinal de 0 (epitelio normal) a 4 (el más grave) (<strong cla...

La enterocolitis necrosante (ECN) es la enfermedad gastrointestinal (GI) más grave que a menudo ocurre en bebés prematuros, especialmente en bebés de muy bajo peso al nacer, con alta mortalidad y patogénesis poco clara. La causa de la NEC puede estar relacionada con anomalías inflamatorias del sistema regulador inmunitario. Un modelo animal NEC es una herramienta indispensable para la investigación inmune de la enfermedad NEC. Los modelos animales NEC generalmente usan ratones neonatales C57BL / 6J; Los ratones neonatales BALB/c rara vez se utilizan. Los estudios relacionados han demostrado que cuando los ratones están infectados, la diferenciación de células Th2 es predominante en ratones BALB / c en comparación con ratones C57BL / 6J. Los estudios han sugerido que la aparición y el desarrollo de NEC se asocian con un aumento en las células T auxiliares tipo 2 (Th2) y generalmente se acompañan de infección. Por lo tanto, este estudio utilizó ratones BALB/c neonatales para inducir un modelo de NEC con características clínicas similares y cambios patológicos intestinales como los observados en niños con NEC. Se justifica un estudio adicional para determinar si este modelo animal podría usarse para estudiar las respuestas de las células Th2 en NEC.

Un modelo de ratón BALB/c neonatal de enterocolitis necrosante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...

Este estudio utiliza ratones BALB / c para establecer el modelo NEC, que será útil para la investigación de enfermedades en células T. En el quinto día, los dos grupos no muestran diferencias significativas en el tamaño corporal. Sin embargo, en el día 10 los ratones NEC eran significativamente más delgados que los ratones de control.El peso de los ratones en el grupo NEC aumentó lentamente, y la tasa de supervivencia disminuyó gradualmente durante los cinco días de establecimiento del modelo. El modelo NEC podría ser ventajoso para estudiar la polarización de células T. Demostrando el procedimiento estará Yan Tian, un postgrado de mi laboratorio.Gavage los ratones con 20 a 30 microlitros de LPS, y aliméntelos con 40 a 50 microlitros de fórmula en el quinto día. A partir del quinto día, colóquelos en un dispositivo de hipoxia al 5% de oxígeno durante 90 segundos y vuelva a oxigenarlos durante tres minutos. A continuación, coloque a los ratones en un ambiente de cuatro grados Celsius durante 15 minutos y transfiéralos a una incubadora.Observe de cerca a todos los ratones, peséelos todos los días, registre la supervivencia de los ratones durante el período de inducción y registre si sus heces son sanguinolentas y pegajosas. Sosteniendo el tubo gástrico en la mano derecha, fije la cabeza del mouse con el dedo índice en la cabeza del mouse presionado suavemente hacia atrás y hacia abajo. Inserte el tubo gástrico desde la esquina izquierda de la boca y muévalo lentamente de dos a tres centímetros hacia el centro de la boca.Empuje de 40 a 50 microlitros de fórmula o de 20 a 30 microlitros de LPS en el tracto digestivo. Si el ratón tiene un fuerte reflejo de vómito y la sonda gástrica entra en la tráquea, sáquela suavemente y permita que el ratón descanse antes de intentar la sonda de nuevo. Sumergir el tejido fresco de ratón illum en formalina al 10%, incrustar los tejidos en parafina y cortarlos en cuatro secciones de micrómetros.Para desparafinar las secciones, colóquelas en xileno. Remoje durante cinco minutos con éxito en etanol absoluto, 95% etanol, 80% etanol, 70% etanol y agua destilada. A continuación, manche las secciones con solución de hematoxilina durante cinco minutos y diferéncialas en ácido clorhídrico al 1% y alcohol al 70% durante cinco segundos.Finalmente, tiñelos con solución de eosina durante un minuto y examine la histopatología del tejido intestinal a un aumento de 40 veces. Las fotomicrografías de la puntuación de patología intestinal de cero a cuatro mostraron mucosa intacta y normal, separación submucosa y lámina propia leve, separación moderada de submucosa y lámina propia, separación submucosa y la lámina propia severa, y desaparición de vellosidades intestinales con necrosis intestinal. La puntuación de patología intestinal fue significativamente mayor en el grupo de ECN que en el control con un valor de P inferior a 0,001.Las heces se calificaron de cero con gránulos bien formados a tres con heces líquidas. En el día 10, las puntuaciones de heces de los grupos nec fueron significativamente más altas en el grupo NEC con un valor de P inferior a 0,001. En el quinto día, los dos grupos no mostraron diferencias significativas en el tamaño corporal.Sin embargo, en el día 10, los ratones en el grupo NEC eran significativamente más delgados y más pequeños de la cabeza a la cola que los ratones en el grupo de control. El peso de los ratones en el grupo NEC aumentó lentamente y la tasa de supervivencia disminuyó gradualmente durante los cinco días de establecimiento del modelo. El área ileocecal resecada del tejido intestinal de pacientes con NEC mostró necrosis del tejido de la mucosa intestinal.En este estudio, los ratones en el grupo NEC también desarrollaron hemorragia ileocecal y necrosis. Al amordazar al ratón, asegúrese de que el ratón no tenga dificultades para evitar efectuar la inserción de la sonda gástrica. Gavage los ratones con 20 a 30 microlitros de LPS y aliméntelos con 40 a 50 microlitros de fórmula en el quinto día.A partir del quinto día, colóquelos en un dispositivo de hipoxia al 5% de oxígeno durante 90 segundos y reoxigenéelos durante tres minutos. Este modelo podría ser útil para la investigación de la enfermedad nec en las células T y podría ayudar a estudiar las respuestas de las células Th2 en NEC.

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JoVE Journal

Medicine

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