Enfoques de cartografía química para estudiar la infección por tripanosomátidos

Este protocolo se puede utilizar para construir modelos 3D de distribución de metabolitos y parásitos. Esto puede ayudar a comprender la relación entre la perturbación metabólica del tejido local, la distribución del parásito y los síntomas clínicos de la enfermedad. La principal ventaja de este método es que permite el mapeo a escala viva entre órganos de la distribución de metabolitos frente a la distribución de patógenos y su análisis estadístico.

Teóricamente, la cartografía química puede explorar el desarrollo y el impacto de la enfermedad en el huésped examinando directamente los metabolitos responsables de la patogénesis y los efectos del tratamiento. Comience por pesar y etiquetar los tubos. Seccionar los tejidos sistemáticamente con una sección por tubo.

Pesar los tubos que contienen muestras de tejido para determinar el peso de la muestra y registrar el peso. Para realizar la homogeneización a base de agua de las muestras de tejido, agregue una cuenta de acero inoxidable de cinco milímetros a los tubos de microcentrífuga de dos mililitros que contienen muestras de tejido. Haga un tubo en blanco que contenga agua de grado LCMS.

Aumente el volumen a 500 microlitros por 50 miligramos de la muestra agregando agua refrigerada de grado LCMS, luego homogeneice las muestras a 25 hercios durante tres minutos. Las muestras deben ser completamente homogeneizadas. Recolectar 1/10 del volumen de homogeneización para la extracción de ADN y otros análisis.

Agregue metanol helado de grado LCMS con cuatro micromolares de sulfacloropiridazina al homogeneizado. Homogeneizar muestras en un homogeneizador de tejido a 25 hercios durante tres minutos, seguido de centrifugación durante 10 minutos. Recolecte un volumen igual de sobrenadante en una placa de 96 pocillos y mantenga los residuos sólidos en hielo mientras recolecta los sobrenadantes.

Seque el sobrenadante de extracción acuosa completamente utilizando la velocidad máxima y sin calentamiento. Realice la extracción orgánica agregando 1, 000 microlitros de metanol de diclorometano preenfriado con dos sulfacloropiridazina micromolares por cada 50 miligramos de muestra de residuo sólido. Homogeneizar las muestras a 25 hercios durante cinco minutos, seguido de centrifugación durante 10 minutos.

Recoge un volumen igual de sobrenadante en una placa de 96 pocillos. Tome una foto del órgano de interés. Haga clic en Archivo, luego en Importar en el software SketchUp para importar una imagen de los órganos de interés.

Haga clic en la herramienta de líneas y seleccione la opción a mano alzada. Utilice la herramienta del lápiz para trazar y dibujar los contornos de los órganos de interés. Seleccione la herramienta push/pull y tire hacia arriba en el área sombreada para convertir el dibujo de 2D a 3D.

Exporte el archivo en formato dae haciendo clic en Exportación de archivos y luego en Modelo 3D. Para mejorar el realismo del modelo, importe el modelo en el software MeshLab seleccionando Archivo y, a continuación, haga clic en Importar malla. Seleccione Wireframe en el menú superior, luego seleccione Filtros, haga clic en Simplificación y reconstrucción de Remeshing y, a continuación, en Punto medio de superficies de subdivisión.

Deje todos los valores como predeterminados y seleccione Aplicar dos veces. Exporte el modelo en formato sdl haciendo clic en Archivo, luego en Exportar malla como y, a continuación, seleccionando Formato de archivo SDL en el menú desplegable Archivos de tipo. Guarde esto y seleccione Aceptar en el siguiente menú emergente.

Abra el software Meshmixer e importe el archivo sdl generado en el paso anterior. Use la escultura, los pinceles, la escultura del dragón, los pinceles, las herramientas de inflado para extraer las superficies del modelo que deben redondearse. Guárdelo en formato sdl una vez que el modelo tenga la apariencia deseada haciendo clic en Archivo y Exportar.

Asigne al archivo el nombre que desee, seleccione el formato binario SDL y guárdelo. Abra el modelo 3D en el software MeshLab. Haga clic en Aceptar en la ventana emergente de procesamiento posterior a la apertura.

Obtenga las coordenadas X, Y y Z para cada punto de muestreo seleccionando la herramienta de puntos de selección y, a continuación, haga clic con el botón derecho en intervalos espaciados regularmente en la superficie del modelo 3D. Una vez que se hayan seleccionado todas las coordenadas deseadas, haga clic en el botón Guardar superior en la ventana emergente del formulario. En el software de hoja de cálculo, abra el archivo pp generado en el paso anterior.

Ajuste la visualización de datos haciendo clic en Texto de datos a columnas y, a continuación, delimitado. Haga clic en Siguiente y luego seleccione Espacio y haga clic en Finalizar. Cambie el formato para que solo queden valores numéricos en las celdas de la hoja de cálculo seleccionando Buscar inicio y Seleccionar reemplazar.

En el cuadro Buscar qué, escriba Y igual capa y deje vacía la casilla de reemplazo. Haga clic en Reemplazar todo y luego en Aceptar. Repita para X capa igual y para Z capa igual y para barra de capa mayor que. En la tabla del software de la hoja de cálculo, las filas corresponden a cada posición y las columnas a los datos.

Pegue los metadatos apropiados y la abundancia de características de metabolitos en las columnas de hoja de cálculo posteriores. En la columna de radio, introduzca el tamaño deseado de los puntos de muestreo que se visualizarán en el modelo. Determine empíricamente los valores del radio y guarde el archivo en formato CSV.

Navegue hasta el software ELI Plot, seleccione Surface y, a continuación, arrastre y suelte el modelo 3D creado en la ventana del navegador. Arrastre y suelte la tabla de características creada en la misma ventana del navegador. Utilice la leyenda en la esquina inferior derecha para proyectar la columna de datos deseada en el modelo 3D.

Seleccione consecutivamente cada columna de datos para evaluar la distribución de esta característica de metabolito en el modelo 3D. Este análisis dio lugar a una tabla de 5.502 características y su visualización en 3D. Este enfoque permite la visualización de las características de los metabolitos en animales individuales que son altos en el sitio de alta carga parasitaria, metabolitos con distribución diferencial a través de las regiones de tejido y características de metabolitos que se encuentran en niveles comparables en los intestinos delgado y grueso.

Es importante recordar utilizar solo disolventes LCMS y recolectar todo el tejido adyacente y extraer los metabolitos para todas las muestras recolectadas para evitar brechas en los mapas espaciales. Esta técnica se puede utilizar para explorar los requisitos de nutrientes para la colonización de tejidos por parásitos tripanosomátidos para comprender la patogénesis de la enfermedad a través de la comparación de mapas de distribución de metabolitos 3D tras la infección.