Name: Enfoques de cartografía química para estudiar la infección por tripanosomátidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprende a construir modelos 3D de distribución de metabolitos y parásitos mediante cartografía química. Este método computacional permite visualizar más de 5,500 características metabólicas en tejidos infectados por tripanosomátidos.

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Laura-Isobel McCall, PhD, tiene un Premio de Investigadores en la Patogénesis de Enfermedades Infecciosas del Burroughs Wellcome Fund. Los autores desean además agradecer el apoyo del número de premio de los NIH R21AI148886, una subvención piloto del Centro de Enfermedades Respiratorias e Infecciosas de Oklahoma (OCRID) bajo el número de premio de los NIH P20GM103648, y fondos de puesta en marcha de la Universidad de Oklahoma (a LIM). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los financiadores. Los autores también desean agradecer a los desarrolladores de las herramientas utilizadas en este protocolo. Se han citado todas las publicaciones pertinentes, en su caso.

No hay conflictos de intereses que informar.

Comprender las infecciones por tripanosomátidos es esencial para guiar el desarrollo de nuevos fármacos y los enfoques de tratamiento. Este método de cartografía química está en una posición única para proporcionar información procesable sobre la relación entre el metabolismo y la patogénesis de la enfermedad tripanosomátida, abordando así esta necesidad traslacional.
Solo se recomiendan disolventes de grado LC-MS durante la extracción de metabolitos y los análisis de EM, para disminuir la contaminación de fondo. La contaminación polimérica35, comúnmente derivada de películas de parafina y/u otros plásticos36,37,38, debe evitarse siempre que sea posible. Parafilm, en particular, nunca debe usarse. Estos aspectos son cruciales ya que la calidad de los datos de LC-MS depende de los materiales utilizados durante la preparación de la muestra y la extracción de metabolitos. La calidad de los datos debe garantizarse antes de generar 'ili plots. Además, la generación de estos mapas metabolómicos espaciales completos requiere la recolección de todas las muestras de tejido adyacentes y la extracción de metabolitos de todas las muestras recolectadas para evitar brechas en estos mapas. Por lo tanto, los procedimientos de recolección, la logística de la extracción de metabolitos y el análisis de LC-MS, y los costos deben considerarse y planificarse en consecuencia.
Este protocolo se puede modificar para satisfacer las necesidades del usuario de múltiples maneras. Por ejemplo, la polaridad y solubilidad de los disolventes utilizados durante la extracción de metabolitos influirá en qué metabolitos se detectan39. Para maximizar la diversidad de características de metabolitos detectados para análisis de cartografía química no dirigidos, se recomienda combinar múltiples pasos de extracción y solventes. Por ejemplo, este método utiliza diclorometano, metanol y agua como disolventes de extracción porque permiten la detección precisa de moléculas no polares y polares20,40. Sin embargo, estos solventes no son universalmente adecuados para todos los experimentos de EM, y los investigadores deben seleccionar los solventes de extracción en función de los objetivos de su proyecto. Del mismo modo, se pueden utilizar diferentes condiciones LC-MS / MS, como reemplazar la cromatografía de fase inversa con cromatografía de fase normal. Las columnas alternativas también se pueden usar para la recopilación de datos de fase inversa en lugar de la cromatografía C8, aunque empíricamente, la cromatografía C8 es más robusta a los lípidos tisulares y tiene una frecuencia de obstrucción más baja. Conceptualmente, estos protocolos también se pueden aplicar a otros métodos de espectrometría de masas como cromatografía de gases-espectrometría de masas, etc.
Un enfoque alternativo es la imagen de espectrometría de masas. De hecho, a diferencia de los enfoques de imágenes de espectrometría de masas, la cromatografía líquida-espectrometría de masas no preserva inherentemente la información espacial10. Los enfoques de cartografía química cierran esta brecha al incluir la ubicación del muestreo en el momento de la conceptualización del proyecto, en los metadatos de la muestra y en los pasos de procesamiento de datos. Una fortaleza de este enfoque de cartografía química, a diferencia de las imágenes de espectrometría de masas, es la capacidad de proporcionar anotaciones seguras (Metabolomics Standards Initiative nivel 1 o confianza de anotación de nivel 241), a diferencia de las imágenes de espectrometría de masas donde la mayor parte de las aplicaciones dependen de la masa precisa solo para la anotación. Las imágenes de espectrometría de masas permitirán un mapeo espacial de grano fino, a veces hasta el nivel de una sola célula, por ejemplo,42,43. Por el contrario, los enfoques de cartografía química permiten el mapeo a gran escala entre órganos de la distribución de metabolitos sin requerir habilidades de criosecciona de animales enteros altamente especializadas. La cartografía química proporciona evidencia complementaria a los numerosos enfoques transcriptómicos espaciales que se están desarrollando, por ejemplo,44, con la ventaja de centrarse en la "capa ómica más cercana al fenotipo"45. Los métodos alternativos para la cuantificación de la carga de parásitos incluyen la medición de la bioluminiscencia en el momento de la recolección de la muestra6. También se podrían recolectar segmentos finos para permitir que la microscopía confocal o electrónica evalúe la carga de parásitos localizados y el daño tisular. El homogeneizado de agua, que se utiliza para la cuantificación de citoquinas en este protocolo y en publicaciones anteriores13, también podría utilizarse para cuantificar marcadores de daño tisular basados en proteínas.
También hay múltiples formas de obtener modelos 3D adecuados para trazar los datos LC-MS resultantes. Además del método sugerido aquí, los modelos se pueden comprar prefabricados de varios proveedores en línea. Asegúrese de que los términos de uso coincidan con el uso previsto, especialmente en lo que respecta a la publicación. Los modelos para órganos grandes se pueden generar de novo utilizando escáneres 3D de acuerdo con las instrucciones del escáner. Existen alternativas como MATLAB para generar y visualizar modelos 3D para cartografía química46, pero se implementaron principalmente antes del desarrollo de 'ili16. MATLAB es un conjunto de herramientas de análisis y programación de datos que ofrece una amplia variedad de aplicaciones en muchos campos. Sin embargo, MATLAB no es ni gratuito ni de código abierto, y requiere familiaridad con las interfaces de MATLAB, especialmente teniendo en cuenta que MATLAB no se desarrolló para procesar datos de espectrometría de masas. Las alternativas de este método propuesto, a saber, SketchUp, Meshlab e 'ili, son de libre acceso, fáciles de usar y ofrecen funciones similares a MATLAB para fines de cartografía química.
Este método es robusto en lo que respecta a la preparación de muestras y la extracción de metabolitos. La solución de problemas suele ser necesaria en el paso de adquisición de datos de LC-MS. Esto está más allá del alcance de este artículo. Los lectores son dirigidos a excelentes publicaciones sobre la solución de problemas de adquisición de datos LC-MS, incluyendo20,47. Del mismo modo, las complejidades de la anotación de metabolitos están más allá del alcance del enfoque de este método en la generación de modelos 3D. Las referencias útiles sobre este tema incluyen24,25,48,49.
Si bien este método explora eficazmente la patogénesis de la enfermedad, existen limitaciones para este enfoque, algunas de las cuales son comunes en cualquier experimento de metabolómica. Una de esas limitaciones es la baja tasa de anotación de las características LC-MS50, que depende de la disponibilidad y calidad de las bibliotecas espectrales de referencia. Otra limitación es que este protocolo no conserva el ARNm debido a la incompatibilidad de los reactivos de preservación de ARN como RNAlater con el análisis LC-MS/MS. Sin embargo, la calidad de la proteína es adecuada para los análisis posteriores y, por lo tanto, puede reemplazar los análisis basados en ARNm.
Un enfoque de cartografía química para la patogénesis de la infección refleja directamente cómo se desarrollan las infecciones bacterianas, virales o parasitarias en los sistemas de órganos y causan enfermedades localizadas. El análisis de estas submuestras regionales y la generación de modelos 3D en última instancia transmite cómo funcionan los metabolitos en todo el espacio tridimensional, arrojando luz sobre estas dimensiones espaciales previamente no reconocidas de la biología molecular. Usando este protocolo, por ejemplo, la localización de metabolitos se comparó con la carga del parásito Trypanosoma cruzi. Los resultados aclararon la relación entre el patógeno y el tejido huésped y también demostraron la dinámica metabólica de la progresión de los síntomas de la enfermedad de Chagas6. Los métodos de cartografía química también se han aplicado a diversos temas, como la interacción del entorno construido por el hombre51,52,53, la composición química de sistemas de órganos como la piel humana46 y los pulmones54, y el metabolismo de las plantas y las interacciones ambientales55. Las aplicaciones futuras pueden implicar la evaluación de la tolerancia y la resiliencia a la enfermedad localizada, o la relación entre los niveles locales de metabolitos, el tropismo del patógeno y el tropismo de la enfermedad en modelos más allá de la infección por tripanosomátidos. Este enfoque también debe tener una amplia aplicabilidad para ampliar los protocolos farmacocinéticos actuales, para evaluar la relación entre los niveles locales de fármacos tisulares y el metabolismo del fármaco frente al contexto metabólico general, el daño tisular y la eliminación de patógenos. En general, la cartografía química permite exploraciones únicas de distribuciones de metabolitos en varios tipos de muestras, con aplicaciones que incluyen patogénesis de enfermedades, salud humana, interacciones entre humanos y medio ambiente y dinámica microbiana.

Los parásitos tripanosomátidos consisten en especies de Leishmania, tripanosomas africanos (Trypanosoma brucei) y tripanosomas americanos (Trypanosoma cruzi). Los protozoos de Leishmania causan leishmaniasis, que incluye leishmaniasis cutánea localizada autocurativa y autolimitada, leishmaniasis mucocutánea en la que los tejidos de la mucosa de la boca, nariz y garganta se dañan, y leishmaniasis visceral con tropismo parásito a los órganos viscerales que causa fiebre y hepatoesplenomegalia1,2. T. brucei causa tripanosomiasis africana humana (HAT), también conocida como enfermedad del sueño, reportada principalmente en países africanos3. Los signos y síntomas clínicos incluyen hepatoesplenomegalia, fiebre, dolor de cabeza, dolores musculoesqueléticos, linfadenopatías y anemia en la etapa hemolinfática cuando los parásitos se localizan en el torrente sanguíneo y los linfáticos. A esto le sigue la etapa meningo-encefalítica, donde los parásitos se localizan en el sistema nervioso central y causan trastornos del sueño, alteración del comportamiento y, finalmente, comas fatales4. T. cruzi causa la enfermedad de Chagas, endémica en las Américas. Los individuos infectados experimentan una etapa aguda inicial, generalmente asintomática, con un amplio tropismo del parásito. Alrededor del 10%-30% de los individuos infectados experimentan síntomas crónicos en etapa después de décadas de infección, caracterizados por megaesófago, megacolon y complicaciones cardiovasculares5,6.
Metabolómica estudia pequeñas especies moleculares (50-1.500 Da), incluidos compuestos biológicos del metabolismo primario o secundario y compuestos derivados externamente, como medicamentos o moléculas derivadas de alimentos. En el contexto de las interacciones huésped-patógeno, la metabolómica puede explorar el impacto de la infección en los entornos de metabolitos del huésped, crucial para acceder al efecto del patógeno en el huésped. También puede evaluar las adaptaciones de patógenos al entorno nutricional e inmunológico del huésped7,8,9. La espectrometría de masas (EM) y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) son herramientas metabolómicas comunes utilizadas para identificar, cuantificar y caracterizar metabolitos. Este enfoque "ómico" también se puede aplicar al descubrimiento de biomarcadores y al desarrollo de fármacos10,11.
Dado el tropismo tisular específico de los parásitos tripanosomátidos, los análisis metabolómicos espaciales pueden permitir una visión significativa de la patogénesis de las enfermedades que causan. El mapeo de la distribución espacial de los metabolitos reveló metabolitos afectados localmente por infección crónica por Trypanosoma cruzi en el tejido cardíaco del ratón e infección aguda y a largo plazo por Trypanosoma cruzi en el tracto gastrointestinal del ratón6,12,13. Específicamente, la cartografía química 3D demostró una desconexión entre la persistencia del parásito y las alteraciones metabólicas en el tejido cardíaco de ratones infectados crónicamente con Trypanosoma cruzi. El metabolismo fue más perturbado en los segmentos inferiores y apicales del corazón, coincidiendo con los sitios de los síntomas de la enfermedad de Chagas (aneurismas apicales cardíacos). Las familias de metabolitos perturbadas por la infección en sitios cardíacos específicos y correlacionadas con la gravedad de la enfermedad incluyen acilcarnitinas y glicerofosfocolinas12,13,14. En el tracto gastrointestinal, las alteraciones metabólicas persistentes coincidieron con los sitios de los síntomas de la enfermedad de Chagas: esófago y colon. Por el contrario, el metabolismo se vuelve a normalizar en sitios no asociados con los síntomas de la enfermedad de Chagas, como el intestino delgado. Los metabolitos localmente perturbados por la infección en el tracto gastrointestinal incluyen acilcarnitinas, glicerofosfocolinas, quinurenina, triptófano y ácido cólico. Además, estos análisis permitieron identificar un nuevo mecanismo metabólico de tolerancia a la enfermedad de Chagas6. La aplicación de estos métodos al estudio de la leishmaniasis cutánea reveló perturbaciones metabólicas significativas en el sitio de la lesión, pero también cambios metabólicos específicos en el tejido macroscópicamente sano adyacente a la lesión. Por ejemplo, la glutamina se agotó en el sitio de la lesión, mientras que las glicerofosfocolinas en el m /z (relación masa-carga) 200-299, 400-499, 500-599 y 600-699 aumentaron significativamente en el sitio de la lesión. La PC (O-34:1) sólo aumentó en los sitios adyacentes a la lesión15.
El objetivo de este manuscrito es demostrar los pasos necesarios para generar modelos 3D de distribución de metabolitos ("cartografía química") aplicados a modelos de infección por parásitos tripanosomátidos (Figura 1). Este enfoque se basa en varios avances críticos en el contexto del procesamiento de datos metabolómicos y metabolómicos, en particular el desarrollo de software 'ili para trazar datos metabolómicos en modelos 3D fácilmente16.

<table><tbody><tr><td>Tubos Eppendorf de 1,5 mL NA</td><td></td><td>NA de</td><td>cualquier marca, según esté disponible</td></tr><tr><td>Botella de 1 L, pyrex</td><td>NA</td><td>NA</td><td>de cualquier marca, según esté disponible</td></tr><tr><td>Cilindro graduado de 1 L, pyrex</td><td>NA</td><td>NA</td><td>de cualquier marca, según esté disponible</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf SafeLock de 2 mL VWR</td><td></td><td>20901-540</td><td>Utilice el modelo de tubo adecuado para el homogeneizador</td></tr> <tr><td>de tejidos disponibleModelo 3D (generado de novo de acuerdo con los pasos del protocolo, o comprado)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>según corresponda para el sistema bajo investigación</td></tr><tr><td>Cordón de acero inoxidable de 5 mm</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 pocillos</td><td>Fisher</td><td>3252449</td><td></td></tr><tr><td>AATTCCTCCAAGCAGCGGATA imprimación</td><td>NA</td><td>NA</td><td>cualquier marca, según esté disponible; publicado en Piron, M. et al. Desarrollo de un ensayo de PCR en tiempo real para la detección de Trypanosoma cruzi en muestras de sangre. Acta trópica. 103 (3), 195&ndash; 200 (2007).</td></tr><tr><td>balanza analítica</td><td>NA</td><td>NA</td><td>cualquier marca, según esté disponible</td></tr><tr><td>ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer</td><td>NA</td><td>NA cualquier</td><td>marca, según disponibilidad; publicado en Piron, M. et al. Desarrollo de un ensayo de PCR en tiempo real para la detección de Trypanosoma cruzi en muestras de sangre. Acta trópica. 103 (3), 195&ndash; 200 (2007).</td></tr><tr><td>centrífuga de sobremesa con microcentrífuga, tubo falcon y capacidad de placa de 96 pocillos</td><td>NA</td><td>NA cualquier</td><td>marca, según esté disponible</td></tr><tr><td>cabina de bioseguridad</td><td>NA</td><td>NA</td><td>clase II, tipo A2; cualquier marca, según esté disponible</td></tr><tr><td>CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC primer</td><td>NA</td><td>NA cualquier</td><td>marca, según esté disponible; publicado en Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Cuantificación rápida de Trypanosoma cruzi en el tejido del huésped por PCR en tiempo real. Parasitología molecular y bioquímica. 129 (1), 53 y ndash; 59 (2003).</td></tr><tr><td>cámara</td><td>NA</td><td>NA de</td><td>cualquier marca, según disponibilidad. Una cámara de teléfono celular es adecuada para este protocolo</td></tr><tr><td>sistema de imágenes con capacidad quimioluminiscente</td><td>NA</td><td></td><td>NA cualquier sistema, como</td></tr><tr><td>bolas de algodón</td><td>disponibles NA</td><td>NA cualquier</td><td>marca, como</td></tr><tr><td>criogénicos</td> disponibles <td>VWR</td><td>97008-208</td><td>reemplazan con cualquier marca, como disponibles</td></tr><tr><td>tijeras de disección</td><td>NA</td><td>NA cualquier</td><td>marca, como</td></tr><tr><td>hielo seco</td><td>disponible NA</td><td>NA</td><td>cualquier marca, según esté disponible</td></tr><tr><td>pinzas de longitud extra</td><td>NA</td><td>NA</td><td>cualquier marca, según esté disponible</td></tr><tr><td>refrigerador de grado inflamable</td><td>NA</td><td>NA</td><td>cualquier marca, según</td></tr><tr><td>esté disponible cajas de almacenamiento en el congelador para tubos de microcentrífuga</td><td>NA</td><td>NA cualquier</td><td>marca, según</td></tr><tr><td>esté disponible campana extractora</td><td>NA</td><td>NA cualquier</td><td>marca, según esté disponible</td></tr><tr><td>masa de alta resolución espectrómetro</td><td>NA</td><td>NA</td><td>cualquier marca, según esté disponible, como ThermoFisher Q-Exactive Plus (número de catálogo 0726030)</td></tr><tr><td>cubo de hielo</td><td>NA</td><td>NA cualquier</td><td>marca, según esté disponible</td></tr><tr><td>ili software</td><td>ili.embl.de</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>tupperware grande</td><td>NA</td><td>NA cualquier</td><td>marca, según esté disponible; lo suficientemente grande como para contener cómodamente de ratón, de bola de algodón</td></tr><tr><td>acetonitrilo de grado LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Diclorotetano de grado LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>D151-4</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico de grado LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>A11750</td><td></td></tr><tr><td>Metanol de grado LC-MS</td><td>Agua</td> de grado LC-MS <td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS Fisher</td><td>Optima</td><td>W64</td><td></td></tr><tr><td>columna de cromatografía líquida</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4499-AN</td><td>puede cambiarse a otras marcas y modelos según corresponda para los metabolitos de interés</td></tr><tr><td>cartucho protector de columna para cromatografía líquida</td><td>Phenomenex</td><td>AJ0-8784</td><td>puede cambiarse a otras marcas y modelos según corresponda para los metabolitos de interés soporte de</td></tr><tr><td>cartucho protector de columna para cromatografía líquida</td><td>Phenomenex</td><td>AJ0-9000</td><td>puede ser cambiado a otras marcas y modelos según corresponda para los metabolitos de interés</td></tr><tr>nitrógeno<td>líquido</td><td>NA</td><td>NA</td><td>cualquier marca, según esté disponible</td></tr><tr><td>luciferina</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>Software MeshLab</td><td>https://www.meshlab.net/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Software Meshmixer</td><td>https://www.meshmixer.com/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MS calibrante</td><td>NA</td><td>NA</td><td>apropiado para el instrumento disponible</td></tr><tr><td>software de procesamiento de datos MS</td><td>NA</td><td>NA múltiples</td><td>opciones disponibles; los autores recomiendan el software MZmine</td></tr><tr><td>MSConvert</td><td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nanodrop ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>otros modelos de nanodrop también son adecuados</td></tr><tr><td>p1000 puntas de pipeta</td><td>NA</td><td>NA</td><td>utilice la marca adecuada para adaptarse a las pipetas disponibles</td></tr><tr><td>pipetas p1000</td><td>NA</td><td>NA de</td><td>cualquier marca, ya que las</td></tr><tr><td>puntas de pipeta p20</td> disponibles <td>NA</td><td></td><td>NA utilizan la marca adecuada para adaptarse a las pipetas disponibles</td></tr><tr><td>P20 pipeta</td><td>NA</td><td></td><td>NA cualquier marca, según</td></tr> las <tr><td>puntas de pipeta p200</td> disponibles <td>NA</td><td>NA</td><td>Utilice la marca adecuada para adaptarse a las pipetas disponibles</td></tr><tr><td>P200 pipeta</td><td>NA</td><td>NA</td><td>de cualquier marca, según esté disponible</td></tr><tr><td>equipo de protección personal (guantes, bata de laboratorio, gafas/gafas de seguridad; pantalla facial)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>de cualquier marca, según esté disponible</td></tr><tr><td>Citocina de ratón Q-Plex - Pantalla (16-Plex)</td><td>Quansys biosciences</td><td>110949MS</td><td>puede sustituirse por otros ensayos de citocinas basados en proteínas, como otros kits comerciales de citocinas ELISA</td></tr><tr><td>Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preparaciones)</td><td>Zymo</td><td>D4069</td><td>reemplaza con cualquier marca de kit de extracción de ADN de mamíferos, como</td></tr><tr><td>termociclador en tiempo real</td> disponible <td>NA</td><td>NA cualquier</td><td>marca, como</td></tr><tr><td>disponible salero o infusor de té</td><td>NA</td><td>NA cualquier</td><td>marca; para contener bola de algodón empapada en isoflurano y evitar el contacto con la piel del ratón</td></tr><tr><td>Software</td><td>SketchUp https://www.sketchup.com/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>espécimen pinzas</td><td>NA</td><td>NA de</td><td>cualquier marca, según esté disponible</td></tr><tr><td>speedvac con tubo de microcentrífuga y capacidad de placa de 96 pocillos</td><td>NA</td><td></td><td>NA de cualquier marca, como software de</td></tr><tr><td>hoja de cálculo</td> disponible <td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td><td>NA</td><td>puede reemplazar con otro software de gestión de hojas de cálculo, según corresponda</td></tr><tr><td>sulfacloropiridazina</td><td>Sigma</td><td>S9882-100G</td><td></td></tr><tr><td>sulfadimetoxina</td><td>Sigma</td><td>S7007-10G</td><td></td></tr><tr><td>Sybr green qPCR reaction mix</td><td>Fisher</td><td>A25780</td><td>puede reemplazar con otras mezclas de reacción de qPCR verde Sybr, según se desee</td></tr><tr><td>TCCCTCTCATCAGTTCTAT GGCCCA primer</td><td>NA</td><td>NA cualquier</td><td>marca, según esté disponible; publicado en Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Cuantificación rápida de Trypanosoma cruzi en el tejido del huésped mediante PCR en tiempo real. Parasitología molecular y bioquímica. 129 (1), 53 y ndash; 59 (2003).</td></tr><tr><td>homogeneizador de tejidos</td><td>NA</td><td>NA de</td><td>cualquier marca, según esté disponible; por ejemplo, Qiagen TissueLyser II, número de catálogo 85300, con juego de adaptadores TissueLyser (2 x 24), número de catálogo 69982</td></tr><tr><td>muestras de tejido</td><td>NA</td><td>NA del</td><td>modelo de infección adecuado</td></tr><tr><td>TissueLyser dispensador de una sola perla Qiagen</td><td></td><td>69965</td><td></td></tr><tr><td>UHPLC</td><td>NA</td><td>NA</td><td>cualquier marca, según esté disponible, como ThermoFisher Vanquish (número de catálogo IQLAAAGABHFAPUMBHV)</td></tr><tr><td>congelador de temperatura ultrabaja (-80)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>cualquier marca, según esté disponible</td></tr><tr><td>baño ultrasónico</td><td>NA</td><td>NA cualquier</td><td>sistema, según esté disponible</td></tr><tr><td>hielo húmedo</td><td>NA</td><td>NA cualquier</td><td>marca, según esté disponible</td></tr><tr><td>película de sellado sin zonas</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 490007-390</td><td></td></tr></tbody></table>

enfoques de cartografía química para estudiar la infección por tripanosomátidos

Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

El tropismo de patógenos y el tropismo de la enfermedad se refieren a las ubicaciones de los tejidos colonizados o dañados selectivamente por patógenos, lo que lleva a síntomas de enfermedad localizados. Los parásitos tripanosomátidos infecciosos humanos incluyen Trypanosoma cruzi, el agente causal de la enfermedad de Chagas; Trypanosoma brucei, el agente causal de la enfermedad del sueño; y especies de Leishmania , agentes causantes de la leishmaniasis. Conjuntamente, afectan a 20 millones de personas en todo el mundo. Estos parásitos muestran tropismo específico: corazón, esófago, colon para T. cruzi, tejido adiposo, páncreas, piel, sistema circulatorio y sistema nervioso central para T. brucei, piel para cepas de Leishmania dermópicas e hígado, bazo y médula ósea para cepas viscerotrópicas de Leishmania . Por lo tanto, una perspectiva espacial es esencial para comprender la patogénesis de la enfermedad tripanosomátida. La cartografía química genera visualizaciones en 3D de la abundancia de moléculas pequeñas generadas a través de cromatografía líquida-espectrometría de masas, en comparación con los parámetros microbiológicos e inmunológicos. Este protocolo demuestra cómo la cartografía química se puede aplicar para estudiar los procesos patógenos durante la infección por tripanosomátidos, comenzando por el muestreo sistemático de tejidos y la extracción de metabolitos, seguido de la adquisición de datos de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem, y concluyendo con la generación de mapas 3D de distribución de metabolitos. Este método se puede utilizar para múltiples preguntas de investigación, como los requisitos de nutrientes para la colonización de tejidos por T. cruzi, T. brucei o Leishmania, el inmunometabolismo en los sitios de infección y la relación entre la perturbación metabólica del tejido local y los síntomas clínicos de la enfermedad, lo que lleva a una visión integral de la patogénesis de la enfermedad tripanosomátida.

El número de características de metabolitos obtenidas depende del tipo de tejido analizado y de los parámetros de procesamiento de datos. Por ejemplo, este protocolo se ha utilizado para analizar el impacto espacial de la infección por T. cruzi en el metaboloma del tracto gastrointestinal en un modelo de ratón de infección por T. cruzi. En trabajos previos, los machos C3H/HeJ fueron inyectados intraperitonealmente con 1.000 CL + luc T. cruzi parásitos32,6. Los animales fueron sacrificados 12 u 89 días después de la infección, y se realizó un análisis de cartografía química de 13 segmentos contiguos del tracto gastrointestinal como se describe en este protocolo. Este análisis condujo a una tabla de características de 5.502 características, que luego se visualizaron en 3D utilizando los pasos descritos en este protocolo. Este enfoque permite la visualización de las características de los metabolitos en animales individuales que son altos en el sitio de alta carga parasitaria (quinurenina, Figura 2B vs. carga de parásitos, Figura 2A), de metabolitos con distribución diferencial entre regiones tisulares (glutamina, Figura 2C) y características de metabolitos que se encuentran en niveles comparables en los intestinos delgado y grueso (LPE 16: 0 Figura 2D ). La quinurenina fue seleccionada para su visualización debido a su conocida relación con la inflamación y publicaciones previas sobre la capacidad de los metabolitos derivados de la quinurenina para regular la carga de T. cruzi33. Los modelos aleatorios de aprendizaje automático basados en bosques habían revelado previamente una asociación entre los niveles de quinurenina y el estado de infección6. La glutamina fue seleccionada para una visualización basada en publicaciones anteriores que demostraban una relación entre la disponibilidad de glutamina in vitro y la sensibilidad al fármaco T. cruzi34. La distribución diferencial se confirmó mediante regresión logística, p &lt; 0,05. LPE 16: 0 se seleccionó después de la inspección visual de los datos para descubrir las características de los metabolitos encontrados en niveles comparables en todos los sitios de tejido.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general del protocolo. La ilustración fue creada con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig02.jpg"> Figura 2: Análisis de cartografía química. A los ratones machos C3H/HeJ se les inyectó por vía intraperitoneal 1.000 parásitos CL+luc T. cruzi32. Los animales fueron sacrificados 12 u 89 días después de la infección, y el tracto gastrointestinal fue recolectado y seccionado sistemáticamente (paso 1)6. Los metabolitos se extrajeron como en el paso 2 y se analizaron mediante LC-MS/MS.3D generación del modelo se realizó utilizando el software SketchUp (paso 5), y los datos se trazaron en 3D como en el paso 6. (A) Distribución del parásito en un ratón específico, 12 días después de la infección. (B) Distribución del metabolito de quinurenina en el mismo ratón, 12 días después de la infección. (C) Distribución media de glutamina entre ratones infectados, 89 días después de la infección. (D) Niveles comparables de m/z 454.292 tiempo de retención 2.929 min, anotados como 2-hexadecanil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (LPE 16:0), en el mismo ratón que en A y B en el intestino delgado y el colon. Se generaron muestras y datos en6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe los pasos para generar un modelo 3D de distribución de metabolitos durante la infección por tripanosomátidos, incluida la recolección de muestras, la extracción de metabolitos, una descripción general de la cromatografía líquida-adquisición de datos de espectrometría de masas en tándem, generación de modelos 3D y, finalmente, visualización de datos.

Enfoques de cartografía química para estudiar la infección por tripanosomátidos

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. ...

Este protocolo se puede utilizar para construir modelos 3D de distribución de metabolitos y parásitos. Esto puede ayudar a comprender la relación entre la perturbación metabólica del tejido local, la distribución del parásito y los síntomas clínicos de la enfermedad. La principal ventaja de este método es que permite el mapeo a escala viva entre órganos de la distribución de metabolitos frente a la distribución de patógenos y su análisis estadístico.Teóricamente, la cartografía química puede explorar el desarrollo y el impacto de la enfermedad en el huésped examinando directamente los metabolitos responsables de la patogénesis y los efectos del tratamiento. Comience por pesar y etiquetar los tubos. Seccionar los tejidos sistemáticamente con una sección por tubo.Pesar los tubos que contienen muestras de tejido para determinar el peso de la muestra y registrar el peso. Para realizar la homogeneización a base de agua de las muestras de tejido, agregue una cuenta de acero inoxidable de cinco milímetros a los tubos de microcentrífuga de dos mililitros que contienen muestras de tejido. Haga un tubo en blanco que contenga agua de grado LCMS.Aumente el volumen a 500 microlitros por 50 miligramos de la muestra agregando agua refrigerada de grado LCMS, luego homogeneice las muestras a 25 hercios durante tres minutos. Las muestras deben ser completamente homogeneizadas. Recolectar 1/10 del volumen de homogeneización para la extracción de ADN y otros análisis.Agregue metanol helado de grado LCMS con cuatro micromolares de sulfacloropiridazina al homogeneizado. Homogeneizar muestras en un homogeneizador de tejido a 25 hercios durante tres minutos, seguido de centrifugación durante 10 minutos. Recolecte un volumen igual de sobrenadante en una placa de 96 pocillos y mantenga los residuos sólidos en hielo mientras recolecta los sobrenadantes.Seque el sobrenadante de extracción acuosa completamente utilizando la velocidad máxima y sin calentamiento. Realice la extracción orgánica agregando 1, 000 microlitros de metanol de diclorometano preenfriado con dos sulfacloropiridazina micromolares por cada 50 miligramos de muestra de residuo sólido. Homogeneizar las muestras a 25 hercios durante cinco minutos, seguido de centrifugación durante 10 minutos.Recoge un volumen igual de sobrenadante en una placa de 96 pocillos. Tome una foto del órgano de interés. Haga clic en Archivo, luego en Importar en el software SketchUp para importar una imagen de los órganos de interés.Haga clic en la herramienta de líneas y seleccione la opción a mano alzada. Utilice la herramienta del lápiz para trazar y dibujar los contornos de los órganos de interés. Seleccione la herramienta push/pull y tire hacia arriba en el área sombreada para convertir el dibujo de 2D a 3D.Exporte el archivo en formato dae haciendo clic en Exportación de archivos y luego en Modelo 3D. Para mejorar el realismo del modelo, importe el modelo en el software MeshLab seleccionando Archivo y, a continuación, haga clic en Importar malla. Seleccione Wireframe en el menú superior, luego seleccione Filtros, haga clic en Simplificación y reconstrucción de Remeshing y, a continuación, en Punto medio de superficies de subdivisión.Deje todos los valores como predeterminados y seleccione Aplicar dos veces. Exporte el modelo en formato sdl haciendo clic en Archivo, luego en Exportar malla como y, a continuación, seleccionando Formato de archivo SDL en el menú desplegable Archivos de tipo. Guarde esto y seleccione Aceptar en el siguiente menú emergente.Abra el software Meshmixer e importe el archivo sdl generado en el paso anterior. Use la escultura, los pinceles, la escultura del dragón, los pinceles, las herramientas de inflado para extraer las superficies del modelo que deben redondearse. Guárdelo en formato sdl una vez que el modelo tenga la apariencia deseada haciendo clic en Archivo y Exportar.Asigne al archivo el nombre que desee, seleccione el formato binario SDL y guárdelo. Abra el modelo 3D en el software MeshLab. Haga clic en Aceptar en la ventana emergente de procesamiento posterior a la apertura.Obtenga las coordenadas X, Y y Z para cada punto de muestreo seleccionando la herramienta de puntos de selección y, a continuación, haga clic con el botón derecho en intervalos espaciados regularmente en la superficie del modelo 3D. Una vez que se hayan seleccionado todas las coordenadas deseadas, haga clic en el botón Guardar superior en la ventana emergente del formulario. En el software de hoja de cálculo, abra el archivo pp generado en el paso anterior.Ajuste la visualización de datos haciendo clic en Texto de datos a columnas y, a continuación, delimitado. Haga clic en Siguiente y luego seleccione Espacio y haga clic en Finalizar. Cambie el formato para que solo queden valores numéricos en las celdas de la hoja de cálculo seleccionando Buscar inicio y Seleccionar reemplazar.En el cuadro Buscar qué, escriba Y igual capa y deje vacía la casilla de reemplazo. Haga clic en Reemplazar todo y luego en Aceptar. Repita para X capa igual y para Z capa igual y para barra de capa mayor que. En la tabla del software de la hoja de cálculo, las filas corresponden a cada posición y las columnas a los datos.Pegue los metadatos apropiados y la abundancia de características de metabolitos en las columnas de hoja de cálculo posteriores. En la columna de radio, introduzca el tamaño deseado de los puntos de muestreo que se visualizarán en el modelo. Determine empíricamente los valores del radio y guarde el archivo en formato CSV.Navegue hasta el software ELI Plot, seleccione Surface y, a continuación, arrastre y suelte el modelo 3D creado en la ventana del navegador. Arrastre y suelte la tabla de características creada en la misma ventana del navegador. Utilice la leyenda en la esquina inferior derecha para proyectar la columna de datos deseada en el modelo 3D.Seleccione consecutivamente cada columna de datos para evaluar la distribución de esta característica de metabolito en el modelo 3D. Este análisis dio lugar a una tabla de 5.502 características y su visualización en 3D. Este enfoque permite la visualización de las características de los metabolitos en animales individuales que son altos en el sitio de alta carga parasitaria, metabolitos con distribución diferencial a través de las regiones de tejido y características de metabolitos que se encuentran en niveles comparables en los intestinos delgado y grueso.Es importante recordar utilizar solo disolventes LCMS y recolectar todo el tejido adyacente y extraer los metabolitos para todas las muestras recolectadas para evitar brechas en los mapas espaciales. Esta técnica se puede utilizar para explorar los requisitos de nutrientes para la colonización de tejidos por parásitos tripanosomátidos para comprender la patogénesis de la enfermedad a través de la comparación de mapas de distribución de metabolitos 3D tras la infección.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este manuscrito describe el uso de una cepa bioluminiscente de tripanosomas africanos para permitir el seguimiento de la infección en etapa tardía y demuestra cómo se pueden usar imágenes en vivo in vivo para visualizar infecciones dentro del sistema nervioso central en tiempo real.

Imágenes de bioluminiscencia para detectar la infección en fase tardía de la tripanosomiasis africana

Los tripanosomas africanos cultivados in vitro experimentan variación antigénica a una tasa baja, de modo que las poblaciones están formadas por parásitos que expresan un tipo de glicoproteína de superficie (VSG) variante dominante y una pequeña población de variantes "conmutadas".  Este protocolo describe un método rápido para detectar y cuantificar estas poblaciones.

Detección de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant glicoproteína de superficie de conmutación por Magnetic Activated Cell Sorting y Citometría de Flujo

En este protocolo, fluorescencia etiquetada T. cruzi fueron inyectadas en larvas de pez cebra transparente y motilidad del parásito fue observada en vivo usando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación.

Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo

El agente Trypanosoma cruzi enfermedad de Chagas produce infecciones asintomáticas de larga duración que convertirse abruptamente en patología clínicamente reconocida. El siguiente protocolo de investigación describe un estudio epidemiológico de corto plazo basado en la familia para desentrañar la infección de T. cruzi transmitida sexual de los padres a la progenie.

Transmisión sexual de tripanosomas americanos de machos y hembras a compañeros de ingenua

Este método de separación de tripanosoma de sangre depende de su carga superficial ser menos negativa que mamífero las células de la sangre. Sangre infectada es colocada y tratada en una columna de intercambiador de aniones. Este método, más apropiado diagnóstico de la tripanosomiasis africana, proporciona parásitos purificados para las investigaciones inmunológicas, biológicas, bioquímicas, farmacéutica y biología molecular.

Purificación de tripanosomas extracelulares, incluyendo a africano, de la sangre por intercambiadores de aniones (celulosa Diethylaminoethyl columnas)

El presente protocolo describe la microscopía fluorescente de lámina de luz y los métodos automatizados asistidos por software para visualizar y cuantificar con precisión los parásitos Trypanosoma cruzi proliferantes y latentes y las células T en órganos y tejidos intactos y despejados. Estas técnicas proporcionan una forma confiable de evaluar los resultados del tratamiento y ofrecen nuevos conocimientos sobre las interacciones parásito-huésped.

Imágenes cuantitativas en 3D de células infectadas por Trypanosoma cruzi, amastigotes latentes y células T en órganos aclarados intactos

Este estudio muestra un protocolo detallado para realizar microscopía de expansión de ultraestructura en tres etapas del ciclo de vida in vitro de Trypanosoma cruzi, el patógeno responsable de la enfermedad de Chagas. Incluimos la técnica optimizada para las proteínas del citoesqueleto y el marcaje panproteoma.

Microscopía de expansión ultraestructural en tres etapas del ciclo de vida in vitro de Trypanosoma cruzi

Los parásitos sanguíneos médicos de todo el mundo se examinaron automáticamente mediante sencillos pasos en una plataforma de IA de bajo código. El diagnóstico prospectivo de los frotis sanguíneos se mejoró mediante el uso de un método de detección y clasificación de objetos en un modelo híbrido de aprendizaje profundo. La colaboración de la monitorización activa y los modelos bien entrenados ayuda a identificar los puntos críticos de transmisión de tripanosomas.

Identificación automática superior de parásitos tripanosomas mediante el uso de un modelo híbrido de aprendizaje profundo

Describimos un método para estudiar cómo responde el pH a las señales ambientales en los glicosomas del torrente sanguíneo de los tripanosomas africanos. Este enfoque implica un sensor de proteínas hereditarias sensible al pH en combinación con citometría de flujo para medir la dinámica del pH, tanto como un ensayo de curso temporal como en un formato de pantalla de alto rendimiento.

Medición de los cambios dinámicos del pH glusómico en el Trypanosoma brucei vivo

El protocolo proporcionado aquí describe los pasos detallados para realizar estudios de eficacia de fármacos en un modelo bioluminiscente de infección por Trypanosoma cruzi , con un enfoque en la adquisición, análisis e interpretación de datos. También se proporcionan procedimientos de solución de problemas y control de calidad para minimizar los problemas técnicos.

Desmitificación de la imagen de bioluminiscencia in vivo de un modelo de ratón de enfermedad de Chagas para estudios de eficacia de fármacos

Aprende a construir modelos 3D de distribución de metabolitos y parásitos mediante cartografía química. Este método computacional permite visualizar más de 5,500 características metabólicas en tejidos infectados por tripanosomátidos.

Enfoques de cartografía química para estudiar la infección por tripanosomátidos

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