Name: Fermentaciones controladas por la luz para la producción química microbiana y de proteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a controlar fermentaciones microbianas mediante optogenética con luz azul para optimizar la producción de químicos y proteínas. Este protocolo demuestra la regulación dinámica del metabolismo en Saccharomyces cerevisiae.

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Esta investigación fue apoyada por el Departamento de Energía de los Estados Unidos, la Oficina de Ciencias, el Premio de la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental Número DE-SC0019363, el Premio NSF CAREER CBET-1751840, The Pew Charitable Trusts y el Premio Camille Dreyfus Teacher-Scholar.

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<li>Nordén, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+gene+dosage+greatly+enhances+recombinant+expression+of+aquaporins+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporins in Pichia pastoris.</a> BMC Biotechnology. 11, 47(2011).</li>
<li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-based+control+of+metabolic+flux+through+assembly+of+synthetic+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Light-based control of metabolic flux through assembly of synthetic organelles.</a> Nature Chemical Biology. 15 (6), 589-597 (2019).</li>
<li>Dowee, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li>
<li>Zhou, K., Edgar, S., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+microbes+to+synthesize+plant+isoprenoids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Engineering microbes to synthesize plant isoprenoids.</a> Methods in Enzymology. 575, 225-245 (2016).</li>
<li>Arfman, N., Worrell, V., Ingram, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+tac+promoter+and+lacI%28q%29+for+the+controlled+expression+of+Zymomonas+mobilis+fermentative+genes+in+Escherichia+coli+and+Zymomonas+mobilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Use of the tac promoter and lacI(q) for the controlled expression of Zymomonas mobilis fermentative genes in Escherichia coli and Zymomonas mobilis.</a> Journal of Bacteriology. 174 (22), 7370-7378 (1992).</li>
<li>Steen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae+for+the+production+of+n-butanol%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol.</a> Microbial Cell Factories. 7 (1), 1-8 (2008).</li>
<li>Tan, S. Z., Manchester, S., Prather, K. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+central+carbon+metabolism+for+improved+pathway+yields+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Controlling central carbon metabolism for improved pathway yields in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (2), 116-124 (2015).</li>
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<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-powered+Escherichia+coli+cell+division+for+chemical+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Light-powered Escherichia coli cell division for chemical production.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-14 (2020).</li>
<li>Senoo, S., Tandar, S. T., Kitamura, S., Toya, Y., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-inducible+flux+control+of+triosephosphate+isomerase+on+glycolysis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Light-inducible flux control of triosephosphate isomerase on glycolysis in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (12), 3292-3300 (2019).</li>
<li>Ramakrishnan, P., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+synechocystis+PCC6803+UirS-UirR+as+a+UV-violet%2Fgreen+photoreversible+transcriptional+regulatory+tool+in+E.+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Repurposing synechocystis PCC6803 UirS-UirR as a UV-violet/green photoreversible transcriptional regulatory tool in E. Coli.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (7), 733-740 (2016).</li>
<li>Tabor, J. J., Levskaya, A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichromatic+control+of+gene+expression+in+escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multichromatic control of gene expression in escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 405 (2), 315-324 (2011).</li>
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<li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
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<li>Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+characterisation+and+manipulation+of+biological+systems+with+Chi.Bio%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio.</a> PLoS Biology. 18 (7), (2020).</li>
<li>Carrasco-López, C., García-Echauri, S. A., Kichuk, T., Avalos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+and+biosensors+set+the+stage+for+metabolic+cybergenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics and biosensors set the stage for metabolic cybergenetics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 296-309 (2020).</li>
<li>Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+optogenetic+feedback+control+for+precise+and+robust+regulation+of+gene+expression+and+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-11 (2016).</li>
<li>Melendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%3A+Quantitative+Biosciences+From+Nano+to+Macro%22%5BJournal%5D)">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences From Nano to Macro. 6 (3), 366-372 (2014).</li>
<li>Milias-Argeitis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+feedback+for+in+vivo+regulation+of+a+gene+expression+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).</li>
<li>Castillo-Hair, S. M., Baerman, E. A., Fujita, M., Igoshin, O. A., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+Bacillus+subtilis+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of Bacillus subtilis gene expression.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Xia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+modification+of+pseudomonas+aeruginosa+enables+controllable+twitching+motility+and+host+infection%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic modification of pseudomonas aeruginosa enables controllable twitching motility and host infection.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (3), 531-541 (2021).</li>
<li>Pu, L., Yang, S., Xia, A., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+manipulation+enables+prevention+of+biofilm+formation+of+engineered+pseudomonas+aeruginosa+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics manipulation enables prevention of biofilm formation of engineered pseudomonas aeruginosa on surfaces.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 200-208 (2018).</li>
</ol>

Los autores han solicitado varias patentes para los circuitos y métodos optogenéticos descritos en este artículo.

El control dinámico se ha aplicado durante mucho tiempo para mejorar los rendimientos de la ingeniería metabólica y la producción de proteínas recombinantes4. Los cambios en la expresión enzimática se implementan más típicamente utilizando inductores químicos como IPTG21, galactosa22 y tetraciclina23, pero también se han mediado utilizando condiciones de proceso como la temperatura y el pH. El control optogenético de la expres...

La optogenética, el control de procesos biológicos con proteínas sensibles a la luz, ofrece una nueva estrategia para controlar dinámicamente las fermentaciones microbianas para la producción química y proteica1,2. La carga de las vías metabólicas modificadas y la toxicidad de algunos productos intermedios y productos a menudo perjudican el crecimiento celular3. Tales tensiones pueden conducir a una acumulación deficiente de biomasa y a una reducción de la productividad3. Este desafío puede abordarse dividiendo temporalmente las fermentaciones en una fase de crecimiento y producción, que dedican recursos metabólicos a la acumulación de biomasa o a la síntesis de productos, respectivamente4. Recientemente demostramos que la transición del crecimiento a la producción en esta fermentación bifásica puede ser inducida con cambios en las condiciones de iluminación5,6,7. La alta capacidad de ajuste, reversibilidad y ortogonalidad de las entradas de luz8 ofrece ventajas únicas a las fermentaciones controladas por la luz que son difíciles o imposibles de replicar con inductores químicos utilizados en el control dinámico de fermentaciones bifásicas convencionales4,9,10,11.
La proteína EL222 sensible a la luz azul derivada de Erythrobacter litoralis se ha utilizado para desarrollar varios circuitos optogenéticos para la ingeniería metabólica en Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. EL222 contiene un dominio sensor de voltaje de luz-oxígeno (LOV) que sufre un cambio conformacional tras la activación de la luz azul (465 nm), lo que le permite unirse a su secuencia de ADN cognado (C120)13. La fusión de EL222 al dominio de activación viral VP16 (VP16-EL222) da como resultado un factor de transcripción sensible a la luz azul que puede activar reversiblemente la expresión génica en S. cerevisiae7 y otros organismos14 a partir del promotor sintético PC120. Varios circuitos basados en EL222 han sido desarrollados y utilizados para la producción química en S. cerevisiae, como el sistema básico OptoEXP activado por luz7, en el que el gen de interés se expresa directamente desde PC120 (Figura 1A). Sin embargo, las preocupaciones de penetración de la luz en las altas densidades celulares típicamente encontradas en la fase de producción de las fermentaciones nos motivaron a desarrollar circuitos invertidos que se inducen en la oscuridad, como los circuitos OptoINVRT y OptoQ-INVRT (Figura 1B)5,7,13. Estos sistemas aprovechan los reguleones de galactosa (GAL) o ácido quínico (Q) de S. cerevisiae y N. crassa, respectivamente, controlando sus correspondientes represores (GAL80 y QS) con VP16-EL222, para reprimir la expresión génica a la luz e inducirla fuertemente en la oscuridad. La combinación de los circuitos OptoEXP y OptoINVRT da como resultado un control bidireccional de la expresión génica, permitiendo fermentaciones bifásicas en las que la fase de crecimiento se induce con luz azul y la fase de producción con oscuridad (Figura 2A)5,7.
El uso de la luz en lugar de la oscuridad para inducir la expresión génica durante la fase de producción ampliaría en gran medida las capacidades de los controles optogenéticos, pero también requeriría superar las limitaciones de penetración de la luz de las altas densidades celulares que se encuentran típicamente en esta fase de fermentación. Para ello, hemos desarrollado circuitos, conocidos como OptoAMP y OptoQ-AMP, que amplifican la respuesta transcripcional a la estimulación de la luz azul. Estos circuitos utilizan mutantes de tipo salvaje o hipersensibles de VP16-EL222 para controlar la producción de los activadores transcripcionales Gal4p o QF2 de los reguleones GAL o Q, respectivamente, logrando una mayor sensibilidad y una expresión génica más fuerte con luz12,13 (Figura 1C). Los circuitos OptoAMP pueden lograr una inducción de luz completa y homogénea en biorreactores de 5 L a una densidad óptica (medida a 600 nm; OD600) valores de al menos 40 con solo ~ 0.35% de iluminación (dosis de luz del 5% en solo ~ 7% de la superficie a granel). Esto demuestra un mayor grado de sensibilidad en comparación con OptoEXP, que requiere cerca del 100% de iluminación12. La capacidad de inducir eficazmente la expresión génica con luz a altas densidades celulares abre nuevas oportunidades para el control dinámico de las fermentaciones. Esto incluye fermentaciones operativas en más de dos fases temporales, como las fermentaciones trifásicas, en las que se establecen fases de crecimiento, inducción y producción con programas de luz únicos para optimizar la producción química (Figura 2B)12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig1v2.jpg"> Figura 1: Circuitos optogenéticos para el control dinámico de S. cerevisiae. Los circuitos OptoEXP, OptoINVRT y OptoAMP se basan en el sistema VP16-EL222 sensible a la luz. (A) En el circuito OptoEXP, la exposición a la luz azul causa un cambio conformacional y dimerización de VP16-EL222, que expone un dominio de unión al ADN y permite la transcripción desde PC120. La cifra ha sido modificada a partir de Zhao et al.7. (B) Los circuitos OptoINVRT aprovechan los regulones GAL (mostrados) o Q para inducir la expresión en la oscuridad. En los circuitos basados en GAL, VP16-EL222 y GAL4 se expresan constitutivamente, mientras que PC120 impulsa la expresión del represor GAL80 (en los circuitos basados en Q, GAL4 y GAL80 se reemplazan por QF2 y QS, respectivamente, y se utiliza un promotor sintético que contiene QUAS en lugar de un promotor GAL). A la luz, Gal80p previene la activación del gen de interés de PGAL1. En la oscuridad, GAL80 no se expresa y se degrada rápidamente fusionándolo a un dominio degron constitutivo (pequeño dominio marrón), que permite la activación de PGAL1 por Gal4p. La cifra ha sido modificada a partir de Zhao et al.5. (C) Los circuitos OptoAMP también utilizan VP16-EL222 para controlar los reguleones GAL (mostrados) o Q. En estos circuitos, el represor GAL80 (o QS) se expresa constitutivamente y se fusiona con un degron fotosensible (pequeño dominio azul) que garantiza una represión estricta en la oscuridad. PC120 y una expresión de control mutante hipersensible VP16-EL222 de GAL4 (o QF2) con luz, que activa fuertemente PGAL1 (o un promotor que contiene QUAS) en la luz. Los circuitos derivados de GAL pueden utilizar formas de ingeniería de PGAL1, como PGAL1-M o PGAL1-S, que tienen una mayor actividad, así como promotores de tipo salvaje controlados por el regulón GAL (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7). La figura ha sido modificada de Zhao et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig02.jpg"> Figura 2: Fermentaciones bifásicas y trifásicas a través del tiempo. (A) Las fermentaciones bifásicas operadas con circuitos invertidos consisten en una fase de crecimiento impulsada por la luz y una fase de producción oscura. En la fase de crecimiento, la biomasa se acumula a medida que la vía de producción permanece reprimida. Al alcanzar el OD600 deseado, las células se desplazan a la oscuridad para ajustarse metabólicamente antes de ser resuspendidas en medios frescos para la fase de producción. (B) En un proceso de tres fases, las fases de crecimiento, incubación y producción están definidas por programas de luz únicos, que pueden consistir en un período de crecimiento oscuro, incubación pulsada y fase de producción completamente iluminada. Figura creada con Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
También se han desarrollado circuitos optogenéticos para el control dinámico de la producción química y proteica en E. coli. Los circuitos OptoLAC controlan el represor bacteriano LacI utilizando el circuito pDawn sensible a la luz, que se basa en el sistema de dos componentes YF1/FixJ6 (Figura 3). Al igual que OptoINVRT5, los circuitos OptoLAC están diseñados para reprimir la expresión génica en la luz e inducirla en la oscuridad. Los niveles de expresión que utilizan circuitos OptoLAC pueden igualar o superar los alcanzados con la inducción estándar de isopropilo β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG), manteniendo así la fuerza de la inducción química al tiempo que ofrece una mayor capacidad de ajuste y reversibilidad6. Por lo tanto, los circuitos OptoLAC permiten un control optogenético efectivo para la ingeniería metabólica en E. coli.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig03.jpg"> Figura 3: Circuitos OptoLAC para el control dinámico de E. coli. Los circuitos OptoLAC adaptan el sistema pDawn y el operón lac para lograr la activación en la oscuridad y la represión en la luz. En la oscuridad, YF1 fosforila FixJ, que luego activa el promotor PFixK2 para expresar el represor cI . El represor cI impide la expresión del represor lacI del promotor PR , lo que permite la transcripción del gen de interés a partir de un promotor que contiene lacO. Por el contrario, la luz azul reduce la actividad de la quinasa neta YF1, revirtiendo la fosforilación de FixJ y, por lo tanto, la expresión de cI , lo que desreprime la expresión de lacI e impide la expresión del promotor que contiene lacO. La figura ha sido modificada a partir de Lalwani et al.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Describimos aquí los protocolos básicos para fermentaciones controladas por la luz de S. cerevisiae y E. coli para la producción química o proteica. Tanto para levaduras como para bacterias, primero nos centramos en fermentaciones con una fase de crecimiento impulsada por la luz y una fase de producción inducida por la oscuridad habilitada por los circuitos OptoINVRT y OptoLAC. Posteriormente, describimos un protocolo para una fermentación trifásica (crecimiento, inducción, producción) controlada por la luz habilitada por los circuitos OptoAMP. Además, describimos cómo escalar fermentaciones controladas optogenéticamente desde microplacas hasta biorreactores a escala de laboratorio. Con este protocolo, nuestro objetivo es proporcionar una guía completa y fácilmente reproducible para la realización de fermentaciones controladas por la luz para la producción química o proteica.

<table><tbody><tr><td><Producción química controlada > luz fuerte utilizando S. cerevisiae</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de 24 pocillos</td><td>USA Scientific</td><td>CC7672-7524</td><td></td></tr><tr><td>Polvo de agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>303991049</td><td></td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Reynolds</td><td></td> B004NG90YO <td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer con &mu; cubeta</td><td>Eppendorf</td><td>6135000923</td><td></td></tr><tr><td>Azul Panel LED</td><td>HQRP 884667106091218</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-L439 OptoINVRT7 Plásmido</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Ver Referencia 1</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>501879892 (G8270-5KG)</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002403</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de</td> <td>microcentrífugaUSA Scientific</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Yamato Scientific America</td><td>SOU-300</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Celltreat</td><td>229656</td><td></td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0560L</td><td></td></tr><tr><td>Medidor cuántico</td><td>Apogee Instruments</td><td>MQ-510</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de replicación Thomas</td><td>Scientific</td><td>F37848-0000</td><td></td></tr><tr><td>Réplicas de almohadillas de recubrimiento</td><td>Sunrise Science Products</td><td>3005-012</td><td></td></tr><tr><td>SC-His en polvo</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1303-030</td><td></td></tr><tr><td>SC Polvo completo</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1459-100</td><td></td></tr><tr><td>Película de sellado estéril</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-SEAL-PLT</td><td></td></tr><tr><td>Placas de agar YPD</td><td>VWR</td><td>100217-054</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R25005</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Producción de proteínas controlada por luz utilizando E. coli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6X Tampón de muestra SDS</td><td>Cepham Life Sciences</td><td>10502</td><td></td></tr><tr><td>12% Geles de proteína de acrilamida</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0341BOX</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de 24 pocillos</td><td>USA Scientific</td><td>CC7672-7524</td><td></td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Reynolds</td><td>B004NG90YO</td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer con &mu; cubeta</td><td>Eppendorf</td><td>6135000923</td><td></td></tr><tr><td>Blue Panel LED</td><td>HQRP 884667106091218</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20279</td><td></td></tr><tr><td>Célula de electroforesis</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación de electroforesis</td><td>Bio-Rad</td><td></td> Caldo 1645050 <td></td></tr><tr><td>LB (Miller)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td> BP97235 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002403</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thomas Scientific</td><td>SX0425-1</td><td></td></tr><tr><td>Plásmidos OptoLAC</td> N<td>/A</td><td>N/A</td><td>Ver Referencia 2</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Yamato Scientific America</td><td>SOU-300</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Celltreat</td><td>229656</td><td></td></tr><tr><td>Medidor cuántico</td><td>Apogee Instruments</td><td>MQ-510</td><td></td></tr><tr><td>Medio SOC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Fermentación trifásica mediante S. cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mismos materiales que el protocolo "Producción química controlada por luz utilizando S. cerevisiae" más lo siguiente:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-L580 OptoAMP4 Plásmido</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Ver Referencia 10</td></tr><tr><td><fuerte>Producción química en un biorreactor controlado por luz</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Reynolds</td><td>B004NG90YO</td><td></td></tr><tr><td>Antiespumante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8311</td><td></td></tr><tr><td>Biorreactor con estación de control</td><td>Eppendorf</td><td>B120110001</td><td></td></tr><tr><td>BioEspectrómetro con &mu; cubeta</td><td>Eppendorf</td><td>6135000923</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>VWR Scientific</td><td>89501-620 (CS)</td><td></td></tr><tr><td>Panel LED azul</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td></td></tr><tr><td>Tubos BPT</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-15</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>501879892 (G8270-5KG)</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>M9 Sales mínimas</td><td>Microcentrífuga Thermo Fisher Scientific</td><td>A1374401</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002403</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>NH4OH Solución</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0503-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Yamato Scientific America</td><td>SOU-300</td><td></td></tr><tr><td>Medidor cuántico</td><td>Apogee Instruments</td><td>MQ-510</td><td></td></tr><tr><td>SC Polvo completo</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1459-100</td><td></td></tr></tbody></table>

fermentaciones controladas por la luz para la producción química microbiana y de proteínas

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Las fábricas de células microbianas ofrecen una alternativa sostenible para producir productos químicos y proteínas recombinantes a partir de materias primas renovables. Sin embargo, sobrecargar un microorganismo con modificaciones genéticas puede reducir la aptitud y la productividad del huésped. Este problema se puede superar mediante el uso de control dinámico: expresión inducible de enzimas y vías, típicamente utilizando aditivos químicos o a base de nutrientes, para equilibrar el crecimiento y la producción celular. Optogenetics ofrece un método no invasivo, altamente ajustable y reversible para regular dinámicamente la expresión génica. Aquí, describimos cómo configurar fermentaciones controladas por la luz de Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae modificadas para la producción de productos químicos o proteínas recombinantes. Discutimos cómo aplicar luz en momentos y dosis seleccionados para desacoplar el crecimiento microbiano y la producción para mejorar el control de la fermentación y la productividad, así como las consideraciones clave de optimización para obtener los mejores resultados. Además, describimos cómo implementar controles de luz para experimentos de biorreactores a escala de laboratorio. Estos protocolos facilitan la adopción de controles optogenéticos en microorganismos diseñados para mejorar el rendimiento de la fermentación.

La regulación optogenética del metabolismo microbiano se ha implementado con éxito para producir una variedad de productos, incluidos biocombustibles, productos químicos a granel, proteínas y productos naturales5,6,7,12,13. La mayoría de estos procesos están diseñados para que el crecimiento celular ocurra en la luz (cuando la baja densidad celular plantea des...

El control optogenético del metabolismo microbiano ofrece un control dinámico flexible sobre los procesos de fermentación. El protocolo aquí muestra cómo configurar fermentaciones reguladas por luz azul para la producción química y de proteínas a diferentes escalas volumétricas.

Fermentaciones controladas por la luz para la producción química microbiana y de proteínas

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

La optogenética se ha utilizado para lograr títulos más altos de varios productos químicos y proteínas en comparación con los inductores típicos. Usando este protocolo, otros pueden mejorar sus propios procesos con control basado en la luz. El control de la optogenética no es invasivo, altamente sintonizable y reversible.Estas cualidades permiten una optimización optimizada de los procesos microbianos e incluso abren oportunidades únicas, como fermentaciones trifásicas y control multicromático. Para cualquier producto químico nuevo, las condiciones óptimas de luz diferirán. Por lo tanto, si se observa una baja producción utilizando los parámetros de este protocolo, se deben probar diferentes condiciones de luz.Comience por obtener una cepa de Saccharomyces cerevisiae con oxiotafia HIS3, un marcador necesario para los plásmidos OptoINVRT. Si se busca controlar un gen nativo de Saccharomyces cerevisiae, asegúrese de que la copia endógena del gen se elimine antes de continuar. Para comenzar la construcción de la deformación, linealice el plásmido que contiene el circuito OptoINVRT7, como EZL439.Si utiliza EZL439, que contiene los componentes para reprimir el promotor PIGA en la luz y activarlo en la oscuridad, linealice en el sitio de restricción Pme1. Utilizando métodos estándar de transformación de acetato de litio, integre el plásmido en una cepa auxotrófica HIS3. Después de la transformación, centrífuga las células a 150 G durante un minuto.Resuspender suavemente las células en 200 microlitros de medio SC-HIS fresco. Coloque todo el volumen celular en una placa de agar SC-HIS e incube a 30 grados Celsius durante dos o tres días hasta que aparezcan las colonias. Prepare células competentes utilizando protocolos estándar de transformación de acetato de litio.Transforme las células con el plásmido que contiene los genes que desea controlar optogenéticamente aguas abajo de los promotores PIGA1M o PIGA1S. Después de la transformación, centrifugue el cultivo a 150 G durante un minuto y resuspenda suavemente el pellet celular en 200 microlitros de medio de abandono DE SC fresco. Placa todo el volumen celular en una placa de agar de peptona dextrosa de extracto de levadura, si se integra en sitios Delta o una placa de abandono SC si se transforma con un plásmido que contiene un marcador de selección.Incubar las células a 30 grados Celsius durante 16 horas bajo luz azul constante para mantener el gen controlado optogenéticamente reprimido. Utilice cualquier fuente de luz de la longitud de onda de 465 nanómetros y coloque un panel LED aproximadamente 40 centímetros por encima de la placa de modo que la intensidad de la luz sea de aproximadamente 80 a 110 micromoles por metro cuadrado por segundo. Mide la intensidad usando un medidor cuántico.Si se integra en los sitios Delta, replique la placa en placas de peptona dextrosa de extracto de levadura que contengan un rango de concentraciones de zeocina entre 400 microgramos por mililitro y 1, 200 microgramos por mililitro para seleccionar una variedad de números de copia de integración. Incubar las placas réplica a 30 grados Celsius bajo luz azul constante o pulsada durante dos o tres días hasta que aparezcan las colonias. Para realizar el cribado preliminar, seleccione ocho colonias de cada placa y utilícelas para inocular un mililitro de medio SC-HIS suplementado con 2% de glucosa en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos.Cultive las células durante la noche a 30 grados Celsius temblando a 200 revoluciones por minuto bajo una iluminación constante de luz azul. Al día siguiente, diluir cada cultivo en un medio SC-HIS fresco con 2% de glucosa para obtener los valores de densidad óptica que van desde 0,01 a 0,3 a 600 nanómetros y hacer crecer los cultivos en estado de agitación 200 revoluciones por minuto bajo luz constante o pulsada a 30 grados centígrados hasta que la densidad óptica alcance entre dos y nueve. Luego, envuelva las placas con papel de aluminio, apague el panel de luz e incube las placas en la oscuridad durante cuatro horas a 30 grados centígrados con 200 revoluciones por minuto.Centrifugar los cultivos en la placa de 24 pocillos a 234 G durante cinco minutos y resuspender las células en un mililitro de medio de abandono completo sintético fresco con 2% de glucosa. Selle las placas para evitar la evaporación del producto deseado utilizando cinta de sellado de microplacas estéril. Fermenta las placas selladas en la oscuridad durante 48 horas a 30 grados Centígrados agitando a 200 revoluciones por minuto.Para cosechar las fermentaciones, centrífuga las placas durante cinco minutos a 234 G y transfiera 800 microlitros del sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Dependiendo del producto químico de interés, analice utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento, espectrometría de masas por cromatografía de gases u otro método analítico utilizando la técnica de preparación de muestras más adecuada para el instrumento utilizado. Seleccione ocho colonias de cada placa y utilícelas para inocular un mililitro de medio SC-HIS con 2% de glucosa en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos.Cultive las células durante la noche en la oscuridad a 30 grados centígrados con 200 revoluciones por minuto agitando. A la mañana siguiente, diluya cada cultivo en un medio SC-HIS fresco con 2% de glucosa a 0.1 densidad óptica. Envuelva las placas en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz y haga crecer el cultivo en la oscuridad a 30 grados centígrados con 200 revoluciones por minuto agitando hasta que alcancen una densidad óptica de tres.Luego, incuba las placas bajo luz pulsada durante 12 horas a 30 grados centígrados con 200 revoluciones por minuto agitando. Centrifugar los cultivos a 234 G's durante cinco minutos y resuspender en medio SC-HIS fresco con 2% de glucosa. Selle las placas para evitar la evaporación del producto deseado utilizando cinta de sellado de microplacas estéril.Fermenta las placas selladas a la luz durante 48 horas a 30 grados centígrados agitando a 200 revoluciones por minuto. Después de realizar fermentaciones optogenéticas, la producción química se probó en un rango de densidades celulares en el momento de la inducción con dos circuitos. El circuito OptoINVRT7 demostró altos títulos de ácido láctico e isobutanol con una densidad celular óptima de valor de inducción de 7.0 y 8.75 en comparación con los circuitos OptoINVRT1 y 2.Las fermentaciones utilizando los circuitos OptoAMP se estudiaron en tres fases definidas por diferentes ciclos de trabajo ligeros. La producción de ácido láctico se puede optimizar utilizando una fase de crecimiento pulsado y fases de inducción y producción totalmente iluminadas. La producción de isobutanol se optimizó utilizando una fase de crecimiento pulsado, una fase de inducción totalmente iluminada y una fase de producción pulsada.Mientras que la biosíntesis de naringenina se optimizó mejor utilizando una inducción de crecimiento pulsado totalmente iluminada y una fase de producción oscura. El sistema OptoLAC se ha utilizado en E.Coli para producir factor de transcripción FDER en títulos que son comparables o superiores a los logrados mediante inducción química con IPDG. Los circuitos OptoLAC se han aplicado para producir mevalonato y la producción supera los títulos logrados mediante inducción IPDG.La producción de mevalonato a nivel de biorreactor demuestra la escalabilidad y la capacidad de ajuste de la regulación optogenética para la producción química y de proteínas en bacterias más allá de los niveles de microplacas. Es importante asegurarse de que la intensidad de la luz esté en el rango adecuado para los pasos iluminados y que se evite la contaminación lumínica para los pasos que requieren oscuridad. Esta técnica allanó el camino para lograr títulos récord de isobutanol en levaduras, estabilizar poblaciones de consorcios con luz e incluso controlar el flujo metabólico utilizando orgánulos controlados por luz sintética.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Fuente: Hemmerich, J., et al. Protocolo para la optimización de la producción de proteínas heterólogas utilizando tecnología automatizada de microbioreadores. J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demuestra el uso de un microbioreactor automatizado para monitorizar el crecimiento bacteriano y la secreción de proteínas fluorescentes en respuesta a diferentes formulaciones de medios. Una bacteria genéticamente modificada que expresa una proteína fluorescente secretora se cultiva bajo selección...

Monitorización del crecimiento bacteriano en formulaciones de medios distintos con un microbioractor automatizado

Se diseñó un aparato de cultivo continuo para uso con sistemas de optogenética para iluminar cultivos de microbios y periódicamente celdas de imagen en el efluente con un microscopio invertido. El cultivo, el muestreo, tratamiento de imágenes y análisis de imágenes son totalmente automatizadas para que las respuestas dinámicas a la iluminación pueden ser medidos durante varios días.

Diseño e implementación de un sistema automatizado de Iluminador, cultivo y sistema de muestreo para Aplicaciones microbiana Optogenética

Este manuscrito describe un enfoque genérico para el diseño a medida de los medios de cultivo microbianos. Esta opción está activada por un flujo de trabajo iterativo combinando Kriging experimental diseño y microbioreactor tecnología suficiente rendimiento de cultivo, que se apoya en la robótica de laboratorio para aumentar la fiabilidad y rapidez en los medios de comunicación para manejo de líquidos preparación.

Protocolo genérico para la optimización de la producción de proteína heteróloga utilizando tecnología Microbioreactor automatizada

Como los organismos anaeróbicos obligatorios son incapaces de crecer al exponerse al oxígeno, el uso de técnicas de cultivo anaeróbico es indispensable. Aquí, demostramos un método simple y eficaz para cultivar un cultivo mixto derivado de una planta de biogás desde la preparación de medios hasta la cuantificación de gases y ácidos grasos volátiles.

Preparación media para el cultivo de microorganismos bajo condiciones estrictamente anaeróbicas/anóxicos

Este protocolo emplea un reportero bioluminiscente, lo que permite mediciones de la actividad transcripcional en Saccharomyces eubayanus para monitorear la transición de glucosa a maltosa, lo que permite el análisis en tiempo real de las adaptaciones metabólicas y apoya la optimización de la cepa para la fermentación industrial en diversas condiciones.

In vivo Monitorización de la actividad transcripcional durante la transición metabólica mediante un reportero bioluminiscente en levadura

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Diseño de sistemas de fermentación en estado sólido para la producción de enzimas extracelulares hidrolíticas poliméricas por hongos filamentosos

Este protocolo presenta un flujo de trabajo estándar de cribado de alto rendimiento para microorganismos industriales. Consiste en construir una biblioteca mutante mediante mutagénesis ARTP, realizar cribado positivo de gotas con microfluidica automatizada y, posteriormente, verificar los resultados. La fiabilidad del flujo de trabajo se validó mediante el cribado de cepas de B. coagulans de alto rendimiento.

Cribado de alto rendimiento de mutantes de Bacillus coagulans hiperproductores de ácido L-láctico utilizando una plataforma microfluídica automatizada de gotas

Gota de plataformas basadas en microfluidos son candidatos prometedores para la experimentación de alto rendimiento, ya que son capaces de generar picolitros, la auto-compartimentado barcos bajo costo en las tasas de kHz. Mediante la integración con rápido, sensible y de alta resolución espectroscópica métodos de fluorescencia, la gran cantidad de información generada dentro de estos sistemas se puede extraer de manera eficiente, aprovechar y utilizar.

Métodos de detección de fluorescencia para las plataformas de las gotas de microfluidos

Este método describe la síntesis combinatoria de película polianhídrido biodegradable y bibliotecas de nanopartículas y la detección de alto rendimiento de liberación de proteína a partir de estas bibliotecas.

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Se presenta la síntesis de un hidrogel de proteína dividida intein mediada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. La mezcla de los dos copolímeros de proteínas desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido que se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es altamente pH y...

Síntesis de una proteína artificial mediada Intein hidrogel

Aprende a controlar fermentaciones microbianas mediante optogenética con luz azul para optimizar la producción de químicos y proteínas. Este protocolo demuestra la regulación dinámica del metabolismo en Saccharomyces cerevisiae.

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