Name: Imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie en un modelo de gangrena de extremidades posteriores murinas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprende a crear un modelo de gangrena en almohadilla plantar murina mediante electrocoagulación femoral e inhibición de óxido nítrico en ratones FVB. La perfusión con DiI permite visualizar la vasculatura en alta resolución tridimensional para estudiar la isquemia de extremidades.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones a Z-J L y OC V de los Institutos Nacionales de Salud [R01HL149452 y VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. También agradecemos a la Instalación de Microscopía e Imágenes del Proyecto Miami para Curar la Parálisis de la Facultad de Medicina de la Universidad de Miami por proporcionar acceso a su software de análisis y procesamiento de imágenes.

Todos los experimentos con animales descritos en el protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Miami. Para el estudio se utilizaron ratones FVB, tanto machos como hembras, de 8 a 12 semanas de edad.
1. Preparación de la solución L-NAME
<ol><li>En condiciones estériles en una campana de flujo laminar, prepare una solución madre L-NAME disolviendo 1 g de polvo L-NAME (consulte la Tabla de materiales) con 20 ml de agua estéril para hacer una solución de 50 mg / ml. Almacene la solución madre en alícuotas de 300-500 μL a -20 °C durante un máximo de 3 meses.</li>
	<li>Para hacer una solución L-NAME de trabajo, descongele una alícuota de solución madre L-NAME y diluya con PBS (1:4) en condiciones estériles para obtener una concentración final de 10 mg/ml.</li>
	<li>Para preparar PBS (pH 7.4), disuelva 8 g de NaCl, 0.2 g de KCl, 1.44 g de Na2HPO4 y 0.23 g de NaH2PO4 en 800 ml de agua destilada. Ajuste el pH a 7.4 con HCl. Agregue agua a un volumen total de 1,000 ml y filtre a través de un filtro superior de botella de 0.22 μm. NOTA: La inyección intraperitoneal (IP) de 4 μL/g de solución de trabajo L-NAME es equivalente a la dosis deseada de 40 mg/kg de L-NAME. La solución de trabajo L-NAME debe mantenerse en hielo durante el uso, y se deben hacer nuevas diluciones diariamente utilizando alícuotas recién descongeladas de solución madre.</li>
</ol>2. Inducción química y quirúrgica de la gangrena de las extremidades posteriores
<ol><li>Obtener ratones FVB, de 8 a 12 semanas de edad, ya sea de un criador o criados en las instalaciones (ver Tabla de Materiales). 2 h antes de la cirugía, administrar una dosis IP de 40 mg/kg de L-NAME.</li>
	<li>Anestesiar ratones con inyección IP de 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina (ver Tabla de Materiales) diluido en PBS. Confirme la sedación adecuada por la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie y continúe monitoreando la frecuencia respiratoria durante el procedimiento.<ol>
<li>Retire el vello de las extremidades posteriores bilaterales y las ingles con tijeras y / o una crema depilatoria. Coloque al animal bajo un microscopio quirúrgico supino; extender y pegar con cinta adhesiva las extremidades en su lugar. Esterilizar el campo quirúrgico aplicando circunferencialmente la solución de povidona-yodo en el sitio quirúrgico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Con un aumento de 10-20x, use tijeras o un bisturí para hacer una incisión de 1 cm a lo largo del pliegue de la ingle justo inferior al ligamento inguinal. Use fórceps finos y un aplicador de punta de algodón estéril para diseccionar sin rodeos la almohadilla de grasa inguinal lateralmente del ligamento inguinal y exponer la vaina femoral subyacente para que la arteria femoral, la vena y el nervio estén claramente identificados (Figura 1).</li>
	<li>Usando fórceps finos, perfore la vaina femoral. Cepille cuidadosamente el nervio femoral lejos de la arteria femoral. Identificar el despegue de la rama circunfleja lateral de la arteria femoral (LCFA) profunda hasta el nervio femoral (Figura 1).<ol>
<li>Proceda con la electrocoagulación de la arteria femoral y la vena solo proximal al LCFA activando el dispositivo de cauterización (ver Tabla de materiales) y contactando suavemente los vasos con un movimiento de lado a lado, asegurando que el nervio femoral esté bien aislado y permanezca protegido de lesiones térmicas. Divida el segmento del vaso coagulado con tijeras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proceda con la exposición de la arteria y vena femoral distal movilizando la almohadilla de grasa inguinal medialmente. Identificar la arteria epigástrica superficial y la unión safenopoplítea más distalmente.<ol>
<li>Perfore la vaina femoral entre estos dos lugares y diseccione cuidadosamente el nervio femoral lejos de los vasos femorales. Proceder con la coagulación y transección de la arteria y vena femoral como se describe en el paso 2.4.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Irrigar el campo quirúrgico con una jeringa llena de PBS estéril. Obtenga hemostasia aplicando una presión suave con un aplicador de punta de algodón durante 3-5 minutos a cualquier área de sangrado.<ol>
<li>Proceda con el cierre de la incisión utilizando una sutura absorbible de 5-0 de manera simple y continua. Administrar una dosis subcutánea de 1 mg/kg de buprenorfina de liberación sostenida (ver Tabla de Materiales) para el alivio del dolor postoperatorio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confirmar la pérdida de perfusión de la almohadilla del pie en la extremidad posterior ligada por LDPI (ver Tabla de Materiales). Mientras aún esté anestesiado, coloque al animal en una almohadilla de espuma oscura en una posición prona debajo de la máquina LDPI y use bucles de cinta eléctrica para asegurar los pies en su lugar.<ol>
<li>Proceda con LDPI de pies bilaterales. Una vez que se complete el escaneo, dibuje un ROI alrededor de cada almohadilla y obtenga los valores medios de flujo.</li>
		<li>Calcule el índice de perfusión como la relación entre los valores medios de flujo de la almohadilla del pie ligada a la no ligada. Asegúrese de que el índice de perfusión sea inferior a 0,1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfiera al animal de vuelta a una jaula limpia con una almohadilla térmica o una lámpara de techo para mantener la temperatura corporal central. Asegure la recuperación completa de la anestesia antes de transferir los ratones de regreso a la instalación de animales.</li>
</ol>3. Administración postoperatoria de L-NAME y monitorización de la gangrena de las extremidades posteriores
<ol><li>En los días postoperatorios 1-3, administrar una dosis adicional de 40 mg/kg IP de L-NAME a cada animal. Al mismo tiempo, evalúe cuidadosamente el pie de la extremidad isquémica.</li>
	<li>Cuantificar el grado de isquemia y gangrena de las extremidades posteriores utilizando la puntuación de isquemia de las extremidades posteriores de Faber9. Puntuaciones 1-5: número de uñas isquémicas; puntuaciones 6-10: 1-5 dígitos isquémicos; puntuaciones 11 y 12: atrofia parcial y completa del pie. Registre las puntuaciones de Faber en los días postoperatorios 1-3 y luego semanalmente.</li>
</ol>4. Preparación de DiI y soluciones de trabajo para perfusión animal
<ol><li>Para preparar la solución madre de DiI, disuelva 100 mg de cristales de DiI (ver Tabla de Materiales) en 16.7 mL de etanol 100%. Cubra con papel de aluminio y deje en una plataforma basculante durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente.</li>
	<li>Para preparar el diluyente, disuelva 50 g de glucosa en 1.000 ml de agua destilada para producir una solución de glucosa al 5%. Filtre a través de un filtro superior de botella de 0,22 μm. Mezcle PBS y soluciones de glucosa al 5% en una proporción de 1: 4 para preparar una solución de diluyente de trabajo.</li>
</ol>5. Configuración del equipo y perfusión DiI
<ol><li>Haga que la solución de trabajo DiI agregue 200 μL de solución madre DiI a 10 ml de la solución de diluyente de trabajo (preparada en el paso 4.2) inmediatamente antes de su uso. Agitar a mano para mezclar bien.</li>
	<li>Conecte dos o tres llaves de paso de 3 vías y una aguja de mariposa de 25 G en serie. Prepare jeringas de 10 ml con 4 ml de PBS, 10 ml de solución de DiI y 10 ml de formalina tamponada neutra al 10% (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Conecte la jeringa con formalina al puerto de entrada proximal e inyecte la solución para eliminar el aire de la línea; gire la llave de paso para cerrar el puerto. Repita el mismo procedimiento secuencialmente, conectando las jeringas con DiI y luego PBS a los puertos de entrada medio y distal, respectivamente, teniendo cuidado de eliminar todas las burbujas de aire a través del conjunto de la llave de paso. NOTA: Asegúrese de que no haya burbujas de aire en ninguna parte del conjunto o tubo de la llave de paso. Las burbujas de aire pueden ocluir pequeñas arterias durante la perfusión, lo que resulta en una distribución intravascular deficiente de DiI y resultados de imágenes comprometidos.</li>
	<li>Una vez que se complete la configuración, eutanasia al animal por sobredosis de CO2 en una cámara de inducción.</li>
	<li>Coloque al animal a perfundir en posición supina sobre una almohadilla absorbente y asegure las axilas y las extremidades inferiores con agujas.</li>
	<li>Usando tijeras, haga una incisión transversal para abrir la cavidad abdominal. Exponga y luego divida el diafragma izquierdo y derecho para acceder a la cavidad torácica.<ol>
<li>Corte la pared torácica a ambos lados del esternón desde las costillas inferiores hasta la primera o segunda costilla, evitando las arterias torácicas internas (mamarias) medialmente. Use un hemostático (ver Tabla de Materiales) para agarrar el extremo inferior del esternón y reflejarlo hacia la cabeza del animal para exponer la cavidad torácica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifique el ventrículo izquierdo, que parece de color más claro que el ventrículo derecho. Agarre suavemente el corazón con fórceps contundentes e inserte la aguja de mariposa en el ventrículo izquierdo.<ol>
<li>Use tijeras o una aguja de 18 G para perforar la aurícula derecha, permitiendo que la sangre y las soluciones de perfusión regresen al corazón para drenar. Estabilice la aguja con una o dos manos, teniendo cuidado de no perforar inadvertidamente el ventrículo derecho y perfundir la circulación pulmonar en lugar de sistémica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Abra el puerto de la jeringa con PBS e inyecte manualmente 2-4 ml a una velocidad de 1-2 ml / min durante 1-2 minutos para eliminar la sangre del sistema vascular. Asegure una perfusión exitosa mediante la observación del sangrado de la aurícula derecha. Después de la inyección, cierre el puerto de la jeringa PBS.</li>
	<li>Abra el puerto a la jeringa con DiI e inyecte 5-10 ml a una velocidad de 1-2 ml / min durante 5 min. Controle las orejas, la nariz y las palmas de las manos que deben volverse ligeramente rosadas con la inyección de solución de DiI. Después de la inyección, cierre el puerto de la jeringa DiI y espere 2 minutos para permitir la incorporación del tinte antes de la inyección del fijador.</li>
	<li>Abra el puerto a la jeringa con formalina e inyecte 5-10 ml a una velocidad de 1-2 ml / min durante 5 min. Después de la inyección, retire la aguja del ventrículo izquierdo y proceda a cosechar los tejidos de interés.</li>
	<li>Usando tijeras pesadas, disloque la tibia en el tobillo, separando completamente los pies izquierdo y derecho de la parte inferior de las piernas. Coloque los pies cosechados en una placa de 6 o 12 pocillos con 1-2 ml de solución de formalina al 10%. Envuelva el plato con papel de aluminio y guárdelo a 4 °C durante la noche.</li>
</ol>6. Preparación de tejido de la almohadilla del pie para microscopía de barrido láser confocal
<ol><li>Al día siguiente, reemplace la solución fijadora en una placa de 6 o 12 pocillos con 1-2 ml de PBS por pozo.</li>
	<li>Para despellejar el pie, primero, haga una incisión longitudinal con un bisturí en los aspectos plantar y dorsal del pie. Luego, usando pinzas dentadas y un pequeño hemostático, retire cuidadosamente toda la piel del pie y los dedos, sin dañar los tejidos blandos subyacentes.</li>
	<li>Proceda al montaje y la obtención de imágenes de los tejidos, preferiblemente dentro de los 1-2 días posteriores a la perfusión y la cosecha. Alternativamente, devuelva las almohadillas a placas de 6 o 12 pocillos con 1-2 ml de PBS; cubrir con papel de aluminio y conservar a 4 °C para mantener la fluorescencia hasta 1 mes.</li>
	<li>Para montar tejidos, coloque individualmente los pies entre dos portaobjetos de microscopio de vidrio con una almohadilla de biopsia de espuma doblada sobre sí misma (una o dos veces dependiendo del grosor del tejido) en cada extremo (consulte la Tabla de materiales). Utilice dos pequeños clips aglutinantes para comprimir las diapositivas de vidrio juntas en cada extremo (espesor final de aproximadamente 1 mm). NOTA: Los tejidos más gruesos requerirán tiempos de escaneo más largos. La almohadilla para el pie con piel se puede comprimir entre portaobjetos de vidrio un día antes de la toma de imágenes para reducir el grosor del tejido.</li>
</ol>7. Microscopía de barrido láser confocal
<ol><li>Prepárese para la sesión de imágenes: encienda el sistema de imágenes e inicie el software de adquisición (consulte la Tabla de materiales). Utilice un objetivo de baja ampliación/baja apertura numérica (por ejemplo, x5/0.15) para capturar imágenes, ya que las lentes de menor aumento suelen tener distancias de trabajo más largas requeridas para este experimento.</li>
	<li>Haga clic en Sí en el cuadro de diálogo Activar escenario. Active el láser de 561 nm en la ficha Configuración. En la pantalla principal, active una trayectoria de haz visible haciendo clic en el botón Visible . Configure un detector en el rango de 570-600 nm haciendo clic en la casilla de verificación Activo correspondiente.</li>
	<li>Seleccione el icono Escaneo de mosaicos en la pestaña Adquirir > Adquisición y establezca la resolución deseada (512 x 512 o 1024 x 1024).</li>
	<li>Coloque una muestra de tejido montada en seco (sin agua ni PBS agregada) comprimida entre portaobjetos de vidrio en la etapa del microscopio y enfoque el tejido.</li>
	<li>Para establecer los límites de escaneo, desplácese hasta la esquina superior izquierda o derecha de la muestra. En la pestaña Adquisición, en el menú Escaneo de mosaicos, haga clic en el botón Marcar posición . Navegue a la esquina opuesta (abajo a la derecha o a la izquierda, respectivamente) y haga clic en el botón Marcar posición una vez más.</li>
	<li>Para establecer la profundidad de la pila Z, haga clic en el botón Live en la esquina inferior izquierda de la pantalla y navegue hasta el centro de la muestra. Utilice la perilla del eje Z para desplazarse hasta la parte inferior de la muestra.</li>
	<li>En la pestaña Adquisición, en el menú Z-Stack, haga clic en el botón Comenzar . Desplácese hasta la parte superior de la muestra y haga clic en el botón Finalizar . Haga clic en Tamaño del paso Z y configúrelo en el valor deseado (por ejemplo, 50 μm).</li>
	<li>En la esquina inferior derecha de la pantalla, haga clic en Iniciar para comenzar la adquisición de imágenes.</li>
</ol>8. Análisis cuantitativo y reconstrucción 3D de la vascularización de la almohadilla del pie
<ol><li>Descargue e instale la última versión de Fiji (ImageJ), así como el plugin Vessel Analysis20. Abra archivos de imagen de microscopía en Fiji, que combinarán series Z individuales en pilas Z que se pueden ver en el eje z utilizando el control deslizante en la parte inferior de la imagen.</li>
	<li>Seleccione la imagen compuesta de la pila Z y, a continuación, en el menú Imagen, elija Pilas > proyecto Z para crear una proyección bidimensional. A continuación, convierta la proyección Z a binaria en Proceso > binario > Hacer binario.</li>
	<li>Ejecute el complemento Densidad vascular en Complementos > Densidad vascular. Cuando se le solicite, use el cursor para rastrear un ROI alrededor del perímetro del footpad y los dígitos. Tome nota de la densidad de vasos que se informa, que se expresa como un porcentaje del ROI (fracción de área vascular).</li>
	<li>Para crear reconstrucciones 3D en Fiji, seleccione Pilas > proyecto 3D y establezca el eje de rotación, el ángulo y la velocidad deseados en el menú Imagen. Alternativamente, seleccione Volume Viewer en el menú Plugins para visualizar imágenes como segmentos o manipular la reconstrucción en los ejes deseados.</li>
	<li>Para una representación 3D más complicada, utilice un software alternativo de análisis y procesamiento de imágenes (consulte la Tabla de materiales). Convierta archivos al formato del software deseado y cose escaneos de mosaicos individuales utilizando la funcionalidad de costura de mosaicos.</li>
	<li>Después de unir escaneos de mosaicos individuales, abra el archivo compuesto y proceda con la representación de la superficie del volumen. Haga clic en Agregar nueva superficie para abrir el Asistente para creación de superficies y use las flechas para alternar a través de los menús, en particular estableciendo el ROI y la intensidad del umbral. Una vez satisfecho con la representación de la superficie, utilice la funcionalidad de animación para crear videos de la imagen procesada.</li>
</ol>

<ol><li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139(2020).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Si bien la isquemia de las extremidades posteriores del ratón es el modelo preclínico más utilizado para estudiar la neovascularización en PAD y CLTI, existe una variación significativa en la gravedad y la recuperación de la isquemia dependiendo de la cepa específica del ratón utilizada y el sitio, el número y el método de interrupción arterial. La combinación de la ligadura de la arteria femoral y la administración IP de L-NAME puede inducir de manera confiable la gangrena de las extremidades posteriores en ratones <sup...

La enfermedad arterial periférica (EAP), caracterizada por una reducción del flujo sanguíneo a las extremidades debido a la aterosclerosis, afecta a 6,5 millones de personas en los Estados Unidos y a 200 millones de personas en todo el mundo1. Los pacientes con EAP experimentan una función reducida de las extremidades y calidad de vida, y aquellos con CLTI, la forma más grave de EAP, tienen un mayor riesgo de amputación y muerte con una tasa de mortalidad a 5 años cercana al 50%2. En la práctica clínica, se considera que los pacientes con índices tobillo-brazo (ABI) <0,9 tienen EAP, y aquellos con ABI <0,4 asociados con dolor en reposo o pérdida de tejido tienen CLTI3. Los síntomas varían entre los pacientes con ABI similares dependiendo de la actividad diaria, la tolerancia muscular a la isquemia, las variaciones anatómicas y las diferencias en el desarrollo colateral4. La gangrena de los dedos y las extremidades es la manifestación más grave de todas las enfermedades oclusivas vasculares que dan lugar a CLTI. Es una forma de necrosis seca que momifica los tejidos blandos. Además de la EAP aterosclerótica, también se puede observar en pacientes con diabetes, vasculitis como la enfermedad de Buerger y el fenómeno de Raynaud, o calcifilaxis en el contexto de la enfermedad renal terminal5,6.
Se han desarrollado varios modelos preclínicos para estudiar la patogénesis de PAD/CLTI y probar la eficacia de posibles tratamientos, el más común de los cuales sigue siendo la isquemia de las extremidades posteriores del ratón. La inducción de la isquemia de las extremidades posteriores en ratones se logra típicamente por la obstrucción del flujo sanguíneo de las arterias ilíacas o femorales, ya sea por ligadura de sutura, electrocoagulación u otros medios de constricción del vaso deseado7. Estas técnicas reducen drásticamente la perfusión a la extremidad posterior y estimulan la neovascularización en los músculos del muslo y la pantorrilla. Sin embargo, existen diferencias esenciales dependientes de la cepa murina en la sensibilidad a la lesión isquémica en parte debido a diferencias anatómicas en la distribución colateral8,9. Por ejemplo, los ratones C57BL / 6 son relativamente resistentes a la isquemia de las extremidades posteriores, lo que demuestra una función reducida de las extremidades, pero generalmente no hay evidencia de gangrena en la almohadilla del pie. Por otro lado, los ratones BALB / c tienen una capacidad inherentemente pobre para recuperarse de la isquemia y, por lo general, desarrollan la autoamputación del pie o la parte inferior de la pierna después de la ligadura de la arteria femoral sola. Esta respuesta grave a la isquemia estrecha la ventana terapéutica y puede impedir la evaluación longitudinal de la reperfusión y la función de las extremidades. Curiosamente, las diferencias genéticas en un único locus de rasgo cuantitativo localizado en el cromosoma murino 7 se han implicado en estas susceptibilidades diferenciales de ratones C57BL/6 y BALB/c a necrosis tisular y reperfusión de extremidades10.
En comparación con las cepas C57BL/6 y BALB/c, los ratones FVB demuestran una respuesta intermedia pero inconsistente a la ligadura de la arteria femoral sola. Algunos animales desarrollan gangrena en forma de uñas isquémicas negras o dedos momificados, pero otros sin signos manifiestos de isquemia11. La administración concomitante de clorhidrato de éster metílico de Nω-Nitro-L-arginina (L-NAME), un inhibidor de la óxido nítrico sintasa (NOS)12, previene los mecanismos vasodilatadores compensatorios y aumenta aún más el estrés oxidativo en el tejido de las extremidades posteriores. En combinación con la ligadura o coagulación de la arteria femoral, este enfoque produce consistentemente una pérdida de tejido de la almohadilla del pie en ratones FVB que se asemeja a los cambios atróficos de CLTI, pero rara vez progresa a autoamputación de extremidades11. El estrés oxidativo es una de las características distintivas de PAD/CLTI y se propaga por disfunción endotelial y disminución de la biodisponibilidad del óxido nítrico (NO)13,14. El NO es una molécula pluripotente que suele ejercer efectos beneficiosos sobre el flujo sanguíneo arterial y capilar, la adhesión y agregación plaquetaria, y el reclutamiento y activación de leucocitos13. También se ha demostrado que los niveles reducidos de NOS activan la enzima convertidora de angiotensina, que induce estrés oxidativo y acelera la progresión de la aterosclerosis15.
Una vez que se establece un modelo de isquemia de las extremidades posteriores, también se necesita monitorear la reperfusión posterior de las extremidades y el efecto terapéutico de cualquier tratamiento potencial. En el modelo de gangrena murina propuesto, el grado de pérdida de tejido se puede cuantificar primero utilizando la puntuación de Faber para evaluar la apariencia macroscópica del pie (0: normal, 1-5: pérdida de uñas donde la puntuación representa el número de uñas afectadas, 6-10: atrofia de los dígitos donde la puntuación representa el número de dígitos afectados, 11-12: atrofia parcial y completa del pie, respectivamente)9. Las mediciones cuantitativas de la perfusión de las extremidades posteriores se realizan típicamente utilizando LDPI, que se basa en las interacciones Doppler entre la luz láser y los glóbulos rojos para indicar la perfusión a nivel de píxeles en una región de interés (ROI)16. Si bien esta técnica es cuantitativa, no invasiva e ideal para mediciones repetidas, no proporciona detalles anatómicos granulares de la vasculatura de las extremidades posteriores16. Otras modalidades de imagen, como la tomografía microcomputarizada (micro-TC), la angiografía por resonancia magnética (ARM) y la microangiografía de rayos X, resultan costosas, requieren instrumentación sofisticada o son técnicamente desafiantes16. En 2008, Li et al. describieron una técnica para etiquetar los vasos sanguíneos dentro de la retina con el tinte lipofílico de carbocianina DiI17. DiI se incorpora a las células endoteliales y, por difusión directa, tiñe estructuras de membrana vascular como brotes angiogénicos y procesos seudópodos17,18. Debido a su entrega directa en las células endoteliales y la naturaleza altamente fluorescente del tinte, este procedimiento proporciona un marcado intenso y duradero de los vasos sanguíneos. En 2012, Boden et al. adaptaron la técnica de perfusión DiI al modelo de isquemia de las extremidades posteriores murinas a través de imágenes de montaje completo de los músculos aductores del muslo cosechados después de la ligadura de la arteria femoral19.
El método actual proporciona una forma relativamente económica y técnicamente factible de evaluar la neovascularización en respuesta a la isquemia de las extremidades posteriores y la terapéutica basada en genes o células. En una adaptación adicional, este protocolo describe la aplicación de la perfusión DiI para obtener imágenes de la vasculatura de la almohadilla del pie en alta resolución y 3D en un modelo murino de gangrena de las extremidades posteriores.

<table><tbody><tr><td>Pinzas de carpeta (pequeñas)Tienda</td><td></td><td></td> de <td>material de oficina</td></tr><tr><td>Buprenorfina (liberación sostenida)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aguja de mariposa (25 G con Luer-Lok)</td><td>VWR</td><td>10148-584</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>DiI (1,1'-Dioctadecil-3,3,3',3'-perclorato de tetrametililindocarbocianina)</td><td>Invitrogen</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de electrocauterización</td><td>Gemini Cautery System</td><td>5917</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (100%)</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ) software</td><td>NIH</td><td></td><td>Usado versión 2.1.0. Descarga gratuita, no se requiere licencia.</td></tr><tr><td>Almohadillas de biopsia de espuma</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-221</td><td></td></tr><tr><td>Formalina (tamponada neutra, 10%)</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>FVB ratones</td><td>Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HCl (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13-1700</td><td></td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Versión usada 9.6.0.</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Pivetal</td><td>NDC 46066-755-04</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-NAME (N&omega;-Clorhidrato de éster metílico de nitro-L-arginina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>Generador de imágenes de perfusión Doppler</td><td>láser MoorLDI</td><td>moorLDI2-HIR</td><td>Software moorLDI V5 usado.</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio (25 x 75 x 1 mm)</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8263</td><td></td></tr><tr><td>Agujas (27 g)</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Hisopo de povidona yodada (10%)</td><td>Medline</td><td>MDS093901ZZ</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos quirúrgicos</td><td>Roboz Surgical Se</td><td></td><td>recomiendan pinzas finas, destornillador de agujas, tijeras de resorte y hemostático.</td></tr><tr><td>Sutura (5-0 absorbible)</td><td>Jeringas de</td><td>G275017B0P</td><td></td>DemeTECH</tr><tr><td>(10 mL)</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>Llaves de paso de tres vías</td><td>Cole-Parmer</td><td>19406-49</td><td></td></tr><tr><td>Plugin</td><td></td><td></td> de análisis vascular <td>Descarga gratuita, no se requiere licencia. Véase la referencia: Elfarnawany (2015).</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie en un modelo de gangrena de extremidades posteriores murinas

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

La enfermedad arterial periférica (EAP) es una causa importante de morbilidad resultante de la exposición crónica a factores de riesgo ateroscleróticos. Los pacientes que sufren de su forma más grave, la isquemia crónica que amenaza las extremidades (CLTI), se enfrentan a deficiencias sustanciales en la vida diaria, incluido el dolor crónico, la distancia limitada para caminar sin dolor y las heridas no cicatrizantes. Se han desarrollado modelos preclínicos en varios animales para estudiar la EAP, pero la isquemia de las extremidades posteriores del ratón sigue siendo la más utilizada. Puede haber una variación significativa en la respuesta al insulto isquémico en estos modelos dependiendo de la cepa de ratón utilizada y el sitio, el número y los medios de interrupción arterial. Este protocolo describe un método único que combina la electrocoagulación de la arteria femoral y la vena con la administración de un inhibidor de la óxido nítrico sintasa (NOS) para inducir de manera confiable la gangrena del footpad en ratones Friend Virus B (FVB) que se asemeja a la pérdida de tejido de CLTI. Si bien todavía se recomiendan los medios tradicionales de evaluación de la reperfusión, como las imágenes de perfusión Doppler con láser (LDPI), se utiliza la perfusión intracardíaca del colorante lipofílico 1,1'-dioctadecil-3,3',3'-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI) para etiquetar la vasculatura. La subscopía de barrido láser confocal de montaje completo permite la reconstrucción tridimensional (3D) de alta resolución de las redes vasculares de la almohadilla del pie que complementa los medios tradicionales de evaluación de la reperfusión en modelos de isquemia de las extremidades posteriores.

Este protocolo detalla un medio confiable para inducir isquemia y pérdida de tejido en la almohadilla murina del pie utilizando una combinación de coagulación de la arteria femoral y la vena con la administración de L-NAME, un inhibidor de la óxido nítrico sintasa, en ratones FVB susceptibles. La Figura 1 detalla la anatomía de la vasculatura de las extremidades posteriores murinas e indica los sitios de la arteria femoral y la coagulación venosa (X amarilla), solo proximal a la arteria femo...

El presente protocolo describe un modelo único y clínicamente relevante de enfermedad arterial periférica que combina la electrocoagulación de la arteria femoral y la vena con la administración de un inhibidor de la óxido nítrico sintasa para inducir gangrena de las extremidades posteriores en ratones FVB. La perfusión Intracardíaca DiI se utiliza para obtener imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie.

Imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie en un modelo de gangrena de extremidades posteriores murinas

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Este protocolo presenta cómo crear un modelo de gangrena de almohadilla de pie de ratón mediante la administración de inhibidores de masa y coagulación de la arteria femoral. La perfusión DiI permite la visualización de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie. Este modelo es clínicamente relevante y se puede utilizar para pruebas preclínicas de drogas y para estudiar la isquemia de las extremidades.La visualización de alta resolución de la vasculatura ofrece un medio técnicamente fácil de evaluar la neovascularización. Este modelo de gangrena de la almohadilla del pie tiene importantes aplicaciones en la investigación preclínica de la enfermedad arterial periférica y la isquemia crítica de las extremidades. La perfusión DiI es una herramienta útil para estudiar la neovascularización en modelos animales.Demostrando el procedimiento estarán Antoine Ribieras, de residente quirúrgico, y Yulexi Ortiz, investigador asociado de mi laboratorio. Primero, haga una solución de trabajo DiI agregando 200 microlitros de solución madre DiI a 10 mililitros de la solución de diluyente de trabajo inmediatamente antes de su uso. Agitar a mano para mezclar bien.Conecte dos o tres llaves de paso de tres vías y una aguja de mariposa de calibre 25 en serie. Prepare jeringas de 10 mililitros con cuatro mililitros de PBS, 10 mililitros de solución de DiI y 10 mililitros de formalina tamponada al 10% neutra. Conecte la jeringa con formalina al puerto de entrada proximal e inyecte la solución para eliminar el aire de la línea.A continuación, gire la llave de paso para cerrar el puerto. Repita el mismo procedimiento, conectando las jeringas con DiI y luego PBS a los puertos de entrada medio y distal, respectivamente. Después de la eutanasia, coloque al animal en posición supina sobre una almohadilla absorbente y asegure las axilas y las extremidades inferiores con agujas.Usando tijeras, haga una incisión transversal para abrir la cavidad abdominal, luego exponga y divida el diafragma izquierdo y derecho para acceder a la cavidad torácica. Corte la pared torácica a cada lado del esternón desde las costillas inferiores hasta la primera o segunda costilla. Use un hemostático para agarrar el extremo inferior del esternón y reflejarlo hacia la cabeza del animal para exponer la cavidad torácica.Identifique el ventrículo izquierdo, que parece de color más claro que el derecho. Agarre suavemente el corazón con fórceps contundentes e inserte la aguja de mariposa en el ventrículo izquierdo. Use tijeras o una aguja de calibre 18 para perforar la aurícula derecha, permitiendo que la sangre y las soluciones de perfusión regresen al corazón para drenar.Abra el puerto de la jeringa con PBS e inyecte manualmente de dos a cuatro mililitros a una velocidad de uno a dos mililitros por minuto durante uno o dos minutos para eliminar la sangre del sistema vascular. Asegure una perfusión exitosa mediante la observación del sangrado de la aurícula derecha. Después de la inyección, cierre el puerto de la jeringa PBS.Abra el puerto de la jeringa con DiI e inyecte de cinco a 10 mililitros a una velocidad de uno a dos mililitros por minuto durante cinco minutos. Después de la inyección, cierre el puerto de la jeringa DiI y espere dos minutos para permitir la incorporación del tinte antes de la inyección del fijador. Abra el puerto de la jeringa con formalina e inyecte de cinco a 10 mililitros a una velocidad de uno a dos mililitros por minuto durante cinco minutos.Después de la inyección, retire la aguja del ventrículo izquierdo. Usando tijeras pesadas, disloque la tibia en el tobillo, separando completamente los pies izquierdo y derecho de la parte inferior de las piernas. Coloque los pies cosechados en una placa de 12 pocillos con uno o dos mililitros de solución de formalina al 10%.Envuelva el plato con papel de aluminio y guárdelo a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, reemplace la solución fijadora en una placa de 12 pocillos con uno o dos mililitros de PBS por pozo. Haga una incisión longitudinal con un bisturí en la parte plantar y dorsal del pie.Luego, usando pinzas dentadas y un pequeño hemostático, retire cuidadosamente toda la piel del pie y los dedos, sin dañar los tejidos blandos subyacentes. Para montar tejidos, coloque individualmente los pies entre dos portaobjetos de microscopio de vidrio con una almohadilla de biopsia de espuma doblada sobre sí misma en cada extremo. Use dos pequeños clips aglutinantes para comprimir las diapositivas de vidrio juntas en cada extremo.Alternativamente, devuelva la almohadilla del pie a una placa de 12 pocillos con uno o dos mililitros de PBS. Después de cubrirlo con papel de aluminio, guárdelo a cuatro grados centígrados para mantener la fluorescencia hasta por un mes. Encienda el sistema de imágenes, inicie el software de adquisición y use un objetivo de baja ampliación o apertura numérica baja para capturar imágenes.Haga clic en sí al cuadro de diálogo Activar etapa. Active el láser de 561 nanómetros en la pestaña de configuración. En la pantalla principal, active una trayectoria de haz visible haciendo clic en el botón visible.Configure un detector en el rango de 570 a 600 nanómetros haciendo clic en la casilla de verificación activa correspondiente. Seleccione el icono de escaneo de mosaico en la pestaña de adquisición y establezca la resolución deseada. Coloque la muestra de tejido montada en seco comprimida entre portaobjetos de vidrio en la etapa del microscopio y enfoque el tejido.Desplácese hasta una esquina de la muestra. En el menú de escaneo de mosaico, haga clic en el botón marcar posición. Navegue hasta la esquina opuesta y haga clic en el botón marcar posición nuevamente configurando los límites de escaneo.Para establecer la profundidad de la pila Z, haga clic en el botón en vivo. Desplácese hasta el centro de la muestra y utilice la perilla del eje Z para desplazarse hasta la parte inferior de la muestra. En la pestaña de adquisición, en el menú Z-stack, haga clic en el botón Comenzar.Desplácese hasta la parte superior de la muestra y haga clic en el botón final. Haga clic en el tamaño del paso z y configúrelo en el valor deseado. Luego haga clic en comenzar para comenzar la adquisición de imágenes.La figura muestra la variación en la pérdida de tejido que se puede esperar de este modelo una semana después de la cirugía con puntuaciones FABER registradas en la esquina inferior derecha de cada imagen. Las imágenes de microscopía de reconstrucción revelan una anatomía vascular normal en la almohadilla del pie de control no ligada en comparación con la perfusión severamente disminuida a la almohadilla del pie de la extremidad posterior ligada cinco días después de la cirugía. 20 días después de la cirugía, la perfusión en la almohadilla del pie ha mejorado significativamente, aunque no en la medida del control no ligado.El vídeo muestra que la representación de superficies se creó utilizando la funcionalidad de animación. Enjuague todas las burbujas de aire del conjunto de perfusión. Si los pulmones se expanden y se vuelven rosados durante la perfusión, la aguja ha penetrado en el ventrículo derecho y debe retraerse ligeramente.Los tejidos de las extremidades se pueden utilizar para la inmunotinción para evaluar la necrosis muscular, la regeneración de tejidos, la densidad de los vasos y el reclutamiento de células progenitoras y otras células de reparación de tejidos. La técnica de perfusión DiI en este modelo de gangrena murina se ha utilizado en estudios de terapias génicas y celulares. La investigación tiene como objetivo mejorar la perfusión en extremidades de pacientes con isquemia crítica de extremidades.

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Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

El procedimiento quirúrgico para la inducción de isquemia miembro posterior unilateral se demuestra, con la confirmación de la isquemia por imágenes de perfusión Doppler láser.

Modelo murino de isquemia Miembro Posterior

Osmótica Drug Delivery de miembros posteriores isquémicos y la perfusión de la vasculatura con Microfil para Micro-tomografía computarizada

La inducción quirúrgica de la isquemia de las extremidades posteriores en el ratón es útil para examinar la angiogénesis, sin embargo, esto se ve comprometido en ciertas cepas endogámicas de ratón que muestran una marcada necrosis tisular inducida por la isquemia. Se describen métodos para inducir isquemia subaguda de las extremidades utilizando constrictores ameroides, para eludir este problema mediante la inducción de una oclusión arterial gradual.

Los métodos para aguda y subaguda murino de isquemia del miembro posterior

Vasodilatación inducida por la insulina regula la perfusión muscular y aumenta la microvascular superficie (reclutamiento microvascular) disponibles para el intercambio de solutos entre la sangre y del tejido intersticio. Combinado la microscopia intravital y ecografía de contraste se presenta para evaluar simultáneamente la acción de la insulina en los vasos más grandes y la microcirculación en vivo.

Combina la microscopia Intravital y ecografía de contraste de la trasera de ratón para estudiar la perfusión muscular y vasodilatación inducida por la insulina

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar la formación de vasos sanguíneos en vivo y en tiempo real en 3D andamios por microscopía multifotón. Angiogénesis en andamios modificados genéticamente fue estudiada en un modelo de defecto murino hueso calvarial de crítica. Más nuevos vasos sanguíneos fueron detectados en el grupo de tratamiento que en los controles.

Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo

Aquí, se presenta un modelo experimental crítico de isquemia de la extremidad posterior seguido de una batería de pruebas funcionales, histológicas y moleculares para evaluar la eficacia de las terapias angiogénicas.

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Aquí, presentamos un protocolo que demuestra la técnica y los controles necesarios para las imágenes de perfusión de Laser Doppler para medir el flujo sanguíneo en el retroigrama del ratón.

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Este artículo demuestra un enfoque quirúrgico eficiente para establecer la isquemia aguda en ratones con una pequeña incisión. Este enfoque puede ser aplicado por la mayoría de los grupos de investigación sin ninguna actualización de laboratorio.

Un modelo quirúrgico modificado de isquemia de la extremidad posterior en ApoE-/- Ratones que usan una incisión en miniatura

El reclutamiento de leucocitos y plaquetas constituye un componente esencial necesario para el crecimiento efectivo de las arterias colaterales durante la arteriogénesis. La microscopía multifotónica es una herramienta eficiente para rastrear la dinámica celular con alta resolución espacio-temporal in vivo y menos fototoxicidad para estudiar el reclutamiento y extravasación de leucocitos durante la arteriogénesis.

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Aquí, describimos un método de visualización y cuantificación para los vasos murinos de las extremidades posteriores utilizando tomografía computarizada de micro-rayos X.

Preparación de muestras para la visualización tridimensional basada en tomografía computarizada de vasos murinos de las extremidades posteriores

Este procedimiento demuestra el transporte transverso de la corteza tibial en ratas, permitiendo la visualización y el análisis de la revascularización durante la isquemia de la extremidad.

Un modelo de rata de transporte transversal de la corteza tibial para el tratamiento de la isquemia de la extremidad inferior

Aprende a crear un modelo de gangrena en almohadilla plantar murina mediante electrocoagulación femoral e inhibición de óxido nítrico en ratones FVB. La perfusión con DiI permite visualizar la vasculatura en alta resolución tridimensional para estudiar la isquemia de extremidades.

Imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie en un modelo de gangrena de extremidades posteriores murinas (Video) | JoVE Journal

Imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie en un modelo de gangrena de extremidades posteriores murinas

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